СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЦИТОХРОМА С Российский патент 2011 года по МПК A61K35/34 C12P21/00 C07K14/80 

Изобретение относится к биотехнологии, к области получения лекарственных белковых препаратов, а именно к способу получения цитохрома С из мышц сердца млекопитающих - свиней, крупного рогатого скота и лошадей.

Цитохром С представляет собой фермент, катализирующий окислительно-восстановительные реакции, в качестве простетической группы содержит гем-атом железа. Благодаря гему цитохром С служит переносчиком электронов (Ю.А.Овчинников. Биоорганическая химия. М.: Химия, 1987, с.815).

Цитохром С широко используется в медицине и ветеринарии в качестве лекарственного препарата, а также в виде реактива в биохимии и биотехнологии.

Изобретение может использоваться при получении цитохрома С в промышленных масштабах.

Цитохром С может быть выделен из разнообразных видов природного сырья: дрожжей, риса, мышц сердца млекопитающих (лошадей, крупного рогатого скота, свиней, собак, кроликов, человека), птиц (голубей, пингвинов), сердец лососевых и других. Известны способы получения цитохрома С, включающие выделение из мышц сердца млекопитающих, предпочтительно крупного рогатого скота, путем экстракции и сорбционной очистки экстракта с использованием алюмосиликата магния (F.Okumura and al. Chem. Soc. Japan. V.49, №1, p.65, 1975) или карбоксильных катионитов типа Амберлит ХЕ-64 (В.Hagihara and al. J. Biochem. V.45, №8, p.551, 1975) и КМДМ (Л.К.Шатаева, Н.Н.Кузнецова, Г.Э.Елькин. Карбоксильные катиониты в биологии. - Л.: Наука, 1979, с.285). Данные сорбенты характеризуются малой емкостью и сложностью при промышленном применении карбоксильных катионитов из-за разницы в степени набухания в Н⁺ и Na⁺-форме.

Наиболее близким к предлагаемому изобретению является способ получения цитохрома С из мышц сердца крупного рогатого скота (RU 2096464, опубл. 20.11.97, бюл. №32), включающий экстракцию предварительно обезжиренных и измельченных сердец крупного рогатого скота разбавленным раствором сильной кислоты при pH 3,9-4,2 в течение 1,5-2 ч при 10-15°С с последующей фильтрацией. Экстракт после фильтрации подщелачивают до pH 6,8-7.4, отделяют образовавшийся осадок. Непосредственно из него ведут сорбцию на карбоксильном катионите в Na⁺-форме. Элюцию целевого продукта ведут 10-12% водным раствором сульфата аммония с pH 9,0-9,8. Из элюата при pH 7,2-7,5 осаждают балластные белки добавлением сульфата аммония в количестве 0,5 г/мл. Из надосадочной жидкости осаждают цитохром С действием 20% раствором трихлоруксусной кислоты (ТХУ) с получением осадка, который отделяют, растворяют в минимальном количестве воды и диализуют против изотонического раствора хлористого натрия до полного удаления иона SO₄ ^2-.

В прототипе используют катионит, представляющий собой сополимер метакриловой кислоты и N,N-гексаметилендиметакриламида, получаемый в виде блоков, который перед использованием требует предварительной обработки: измельчения, обработки 1 н. едким натром, затем 1 н. соляной кислотой, отмывки и сушки. Коэффициент набухания в воде Кнаб.=5,0, в буферном растворе с pH 6,8 Кнаб.=10,0, при переходе в слабокислую область Кнаб.=4,0. Полученный карбоксильный катионит хранится в H⁺-форме. Для выделения цитохрома С его необходимо переводить в Na⁺-форму действием избытка 1 н. едкого натра с последующим отмыванием водой до pH на выходе колонки 7,0-8,5 и уравновешиванием солевым раствором ионной силы 0,1 (5,6 г/л хлористого натрия или 5 г/л сульфата аммония). При этом набухаемость сорбента меняется в несколько раз (2-3 раза), что приводит к значительным неудобствам при промышленном выделении цитохрома С, так как требует использования колонн увеличенного размера.

Указанный сорбент имеет невысокую емкость сорбции по целевому продукту и низкую механическую прочность.

Отсутствие правильной сферической формы гранул катионита замедляет скорость проведения процесса в динамическом режиме сорбции и десорбции.

Кроме того, в описанном способе отсутствует сорбция цитохрома С непосредственно из экстракта при pH 3,9-4,2, так как карбоксильные катиониты в этой области не диссоциируют. Поэтому требуется дополнительная стадия - подщелачивание экстракта до pH 6,8-7,4.

Недостатком указанного способа получения цитохрома С является также невысокая степень чистоты цитохрома С, показатель чистоты (Е_550/280) цитохрома С в элюате (отношение экстинкции раствора цитохрома С при длине волны 550 нм и раствора цитохрома С при длине волны 280 нм) составляет около 0,58, это требует использования повышенного количества сульфата аммония (0,5 г/мл) для осаждения балластных белков при дополнительном подкислении элюата до pH 7,2-7,5, что значительно сокращает эффективность и экономичность технологического процесса.

Таким образом, задача настоящего изобретения заключается в том, чтобы предложить способ получения цитохрома С из экстракта с использованием высокостабильных гранульных макропористых сорбентов, обеспечивающих высокую емкость и обратимость сорбции, что делает их наиболее предпочтительными при использовании в промышленных масштабах.

Результатом настоящего изобретения является: сокращение технологического процесса, увеличение емкости по целевому продукту, повышение степени чистоты цитохрома С.

Согласно настоящему изобретению предложен сорбционный способ получения цитохрома С из экстракта с использованием катионита нового поколения UNOsphere™ S (UNOsphere Polymer Technology, производства «Bio-Rad» USA) - имеющий в качестве функциональных групп SO₃-группы. На заключительных стадиях получения цитохрома С применяют диафильтрацию и ультрафильтрацию в тангенциальном потоке на мембранах с пределом исключения по молекулярной массе 5 кДа фирмы Millipore или Sartorius.

Для достижения указанного результата предложен способ, который включает в себя следующие стадии.

Из сердец свиней, крупного рогатого скота или лошадей после обезжиривания и удаления из них связок, сосудов путем измельчения получают фарш. Полученный фарш экстрагируют 2,5% раствором кислоты трихлоруксусной при температуре 10-15°С, при pH 3,9-4,2. После отделения от фарша непосредственно ведут сорбцию целевого продукта из отфильтрованного экстракта на катионите UNOsphere™ S, уравновешенном стартовым буферным раствором при pH 3,9-4,2. После завершения сорбции катионит UNOsphere™ S промывают стартовым буферным раствором. Удаление балластных белков с колонки проводят 80 мМ раствором трис (Трис (гидроксиметил)аминометан). Элюцию цитохрома С с катионита UNOsphere™ S проводят раствором сульфата аммония с концентрацией 0,3 М. Из элюата осаждают балластные белки добавлением сухого сульфата аммония из расчета 0,270 г/мл. Для отделения цитохрома С от сульфата аммония проводят диализ против воды или диафильтрацию в тангенциальном потоке на мембранах с пределом исключения 5 кДа, на этих же мембранах ультрафильтрацией осуществляют концентрирование цитохрома С.

Для уравновешивания колонки наиболее оптимальным оказался буферный раствор, содержащий 2 мМ лимонной кислоты и 1,5 мМ трис, также возможно использование других буферных растворов при данном значении pH. Для удаления балластных белков с катионита оптимальным является раствор триса с концентрацией 80 мМ, при более низких концентрациях не полностью вымываются балластные белки, более высокие концентрации не оказывают существенного влияния на количество удаленных балластных белков. Установлено, что для элюции цитохрома С с катионита наиболее оптимальным является раствор сульфата аммония с концентрацией 0,3 М, низкие концентрации сульфата аммония не полностью элюируют целевой продукт с катионита, при более высоких концентрациях с катионита частично элюируются примесные белки, что существенно снижает степень чистоты целевого продукта.

Использование указанного катионита UNOsphere™ S позволяет непосредственно вести сорбцию цитохрома С из экстракта (при pH экстракта), позволяет значительно сократить технологический процесс за счет увеличения скорости процесса сорбции и десорбции, использовать меньший объем катионита за счет большей емкости и существенно повысить степень чистоты цитохрома С. Использование диафильтрации и концентрирования цитохрома С ультрафильтрацией на заключительных стадиях очистки позволяет значительно повысить эффективность и экономичность процесса за счет снижения расхода реактивов и времени проведения процесса.

Настоящее изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1

2,6 кг фарша, полученного из сердечных мышц свиней после удаления сосудов, связок и измельчения, отмывают водой от остатков крови, экстрагируют 2,5% кислоты трихлоруксусной. Экстракцию ведут 2 ч при 10-15°С. Экстракт отделяют от исходного сырья фильтрованием через ватно-марлевый фильтр с последующим центрифугированием при n=3000 об/мин в течение 10 мин; pH полученного экстракта 4,1. Всего получают 2750 мл экстракта. Полученный экстракт пропускают через катионит UNOsphere™ S уравновешенным стартовым буферным раствором, содержащим 2 мМ лимонной кислоты и 1,5 мМ трис, pH 4,0. Объем колонки 49 мл (диаметр 2,5 см, высота слоя сорбента 7,5 см, количество сорбента 37 мл). Сорбцию ведут при скорости пропускания раствора 2240 мл/ч. Время сорбции около 1,2 ч. Затем катионит UNOsphere™ S промывают 230 мл стартовым буферным раствором. Время промывки 0,1 ч. Для удаление балластных белков с колонки пропускают 750 мл 80 мМ раствора трис при скорости 750 мл/час. Время промывки 1 ч. Элюцию цитохрома С проводят раствором сульфата аммония с концентрацией 0,3 М. Скорость подачи элюирующего раствора 75 мл/ч. Время элюции 1,2 ч. Элюат отбирают фракциями. Фракции, окрашенные в красный цвет, объединяют. Объем фракций около 46 мл. Показатель чистоты цитохрома С (E_550/280) составляет 0,92, выход 220 мг цитохрома С или 84,7 мг/кг исходного сырья.

В объединенные фракции при перемешивании порциями добавляют сухой сульфат аммония в количестве 12,42 г. Раствор выдерживают 15-30 мин. Центрифугированием удаляют осадок балластных белков. На этой стадии показатель чистоты цитохрома С составляет (E_550/280) выход 212 мг цитохрома С или 81,62 мг/кг исходного сырья.

Пример 2

Выполняется в условиях примера 1. Для отделения цитохрома С от ионов сульфата аммония проводят диализ против воды. Показатель чистоты цитохрома С (E_550/280) - 1,15. Выход 205 мг цитохрома С или 78,9 мг/кг исходного сырья.

Пример 3

Выполняется в условиях примера 1. После удаления балластных белков, для отделения цитохрома С от ионов сульфата аммония проводят диафильтрацию. Для этого раствор цитохрома С в количестве 138 мл (объединенные фракции 3^хзагрузок) пропускают на ультрафильтрационной установке в режиме диафильтрации в тангенциальном потоке через мембраны фирмы Millipore (кассета типа Pellicon XL) или Sartorius (кассета типа Vivaflow 50) с пределом исключения по молекулярной массе 5 кДа. Собирают 150 мл раствора, содержащего целевой продукт.

Показатель чистоты цитохрома С (E_550/280) - 1,2. Выход 210 мг цитохрома С или 80,7 мг/кг исходного сырья (в пересчете на одну загрузку).

Пример 4

Выполняется в условиях примера 1 и 2. Раствор цитохрома С после диализа концентрируют методом ультрафильтрации. Для этого раствор цитохрома С в количестве 180 мл (объединенные фракции 3^х загрузок после диализа) пропускают на ультрафильтрационной установке в тангенциальном потоке через мембраны фирмы Millipore (кассета типа Pellicon XL) или Sartorius (кассета типа Vivaflow 50) с пределом исключения по молекулярной массе 5 кДа. Получают 50 мл раствора, содержащего целевой продукт.

Показатель чистоты цитохрома С (E_550/280) - 1,18. Выход 200 мг цитохрома С или 77,0 мг/кг исходного сырья (в пересчете на одну загрузку).

Пример 5

Выполняется в условиях примера 1 и 3. Цитохром С после диафильтрации концентрируют методом ультрафильтрации. 150 мл раствор цитохрома С (объединенные фракции 3^х загрузок после диафильтрации) пропускают на ультрафильтрационной установке в тангенциальном потоке через мембраны фирмы Millipore (кассета типа Pellicon XL) или Sartorius (кассета типа Vivaflow 50) с пределом исключения по молекулярной массе 5 кДа. Получают 50 мл раствора, содержащего целевой продукт.

Показатель чистоты цитохрома С (E_550/280) - 1,21. Выход 208 мг цитохрома С или 80,0 мг/кг исходного сырья (в пересчете на одну загрузку).

Примеры 6-15 по стадиям выполнены в условиях примера 1, 2, 3, 4 и 5. Все экспериментальные данные представлены в таблице.

При этом индекс А означает сырье из сердечных мышц свиньи по примеру 1, 2, 3, 4 и 5; Б -. сырье из сердечных мышц крупного рогатого скота; В - сырье из сердечных мышц лошади.

Изобретение относится к фармакологии, а именно к способу получению цитохрома С. Способ получения цитохрома С, включающий обезжиривание сердец свиней крупного рогатого скота или лошадей, удаление из них связок и сосудов, измельчение и экстракцию раствором трихлоруксусной кислоты при определенных условиях, отделение экстракта от фарша, сорбцию отфильтрованного экстракта при pH экстракта на катионите UNOsphere™ S, уравновешенном стартовым буферным раствором при pH 3,9-4,2, после завершения сорбции катионит промывают стартовым буферным раствором, балластные белки удаляют с катионита UNOsphere™ S раствором трис, затем проводят элюцию цитохрома С с катионита UNOsphere™ S раствором сульфата аммония, концентрированно и очистку его диализом до полного удаления ионов сульфата аммония. Вышеописанный способ позволяет увеличить выход продукта, повысить его чистоту и сократить технологический процесс. 3 з.п. ф-лы, 1 табл.

1. Способ получения цитохрома С, включающий обезжиривание сердец свиней крупного рогатого скота или лошадей, удаление из них связок и сосудов, измельчение и экстракцию 2,5%-ным раствором кислоты трихлоруксусной при температуре 10-15°С, при pH 3,9-4,2, отделение экстракта от фарша, сорбцию и элюцию на катионите, осаждение балластных белков сульфатом аммония, концентрирование и очистку его диализом до полного удаления ионов сульфата аммония, отличающийся тем, что сорбцию целевого продукта проводят непосредственно из отфильтрованного экстракта при pH экстракта на катионите UNOsphere™ S, уравновешенном стартовым буферным раствором при pH 3,9-4,2, после завершения сорбции катионит промывают стартовым буферным раствором, балластные белки удаляют с катионита UNOsphere™ S 80 мМ раствором трис и затем проводят элюцию цитохрома С с катионита UNOsphere™ S раствором сульфата аммония с концентрацией 0,3 М, после стадии элюции осуществляют осаждение балластных белков путем добавления сухого сульфата аммония из расчета 0,270 г/мл.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве уравновешивающего стартового раствора используют буферный раствор, содержащий 2 мМ лимонной кислоты и 1,5 мМтрис.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что очистку цитохрома С от ионов сульфата аммония проводят диафильтрацией в тангенциальном потоке через мембраны с пределом исключения по молекулярной массе 5 кДа.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что концентрирование цитохрома С проводят ультрафильтрацией в тангенциальном потоке через мембраны с пределом исключения по молекулярной массе 5 кДа.