Изобретение относится к микробиологической промышленности и представляет собой пару (+) и (-) штаммов гриба Blakeslea trispora, продуцирующую бета-каротин.
Бета-каротин (провитамин А), получаемый на основе микробиологического синтеза, находит применение в ряде отраслей пищевой промышленности, фармакологии, медицине, в косметической промышленности, а также сельском хозяйстве в качестве добавки к рациону животных и птицы.
В качестве продуцентов бета-каротина известны различные виды микроорганизмов: бактерии, актиномицеты, дрожжи, микроводоросли, а также многие виды грибов.
Наиболее активным продуцентом, используемым для промышленного по- лучения бета-каротина, является гетероталличный гриб Blakeslea trispora, относящийся в порядку Mucorales.
Получение бета-каротина осуществляют путем совместного глубинного культивирования пары (+) и (-) штаммов продуцента на питательных средах различного состава.
В авторском свидетельстве СССР N 260825 пару штаммов Blakeslea trispora NRRL 2895 (+) и NRRL2896 (-) культивируют на средах, включающих измельченные кукурузу и сою, сухие дрожжи или белковый препарат из семян хлопчатника ("Pharmamedia"), цитрусовую мелассу, автоклавные масла (отход, получаемый после обезжиривания отбельных земель, применяемых при рафинировании растительных масел), тиамин и керосин. Максимальное накопление бета-каротина в этих условиях составляет 100000 мкг/100 мл среды.
Недостатком пары штаммов NRRL 2895(+) и NRRL 2896(-) является их низкая продуктивность при культивировании на средах сложного состава с добавлением керосина, что исключает возможность использования целевого продукта в пищевых производствах.
В патентах Франции NN 1456569 и 1449879 пару штаммов Blakeslea trispora NRRL 2456(+) и NRRL 2457(-) культивируют на среде, содержащей крахмал, дрожжевой экстракт, соевое и хлопковое масло, керосин, тиамин и бета-ионон. В первом случае добавление к среде 0,5 г/л фуроил-2-гидразина обеспечивало накопление бета-каротина в количестве 250500 мкг/100 мл, во втором внесение в среду 2 г/л формил-4-пиридина позволяло получить 306500 мкг бета-каротина/100 мл среды.
Недостаток пары штаммов NRRL 2456(+) и NRRL 2457(-) заключается в необходимости использовать в составе ферментационных сред для достижения высоких уровней синтеза бета-каротина дорогостоящие компоненты и керосин, что препятствует производству препаратов в промышленном масштабе и ограничивает сферы их применения.
Известны пары (+) и (-) штаммов Blakeslea trispora, способные синтезировать бета-каротин при росте на простых по составу средах, не содержащих керосин.
В патенте США N 2890989 пару штаммов Blakeslea trispora NRRL 1348(+) и NRRL 2457(-) культивируют на среде с негидролизованными размельченной кукурузой (5%) и соевой мукой (5%), растительными маслами (4%), тиамином и поверхностно-активным веществом. Стимулятор синтеза бета-каротина бета-ионон добавляют через 48 ч совместного роста культур. В описанных условиях при продолжительности ферментации 144 ч пара штаммов NRRL 1348(+) и NRRL 2457(-) обеспечивает накопление каротина в количестве 51600 мкг/100 мл среды. Недостатком данной пары штаммов является их низкая продуктивность.
По совокупности признаков (вид продуцента, состав ферментационной среды, техника ее приготовления) пара штаммов Blakeslea trispora NRRL 1348(+) и NRRL 2457(-) [4] выбрана в качестве прототипа.
Нашей задачей является создание новой пары (+) и (-) штаммов гетероталличного гриба Blakeslea trispora, обеспечивающей высокий уровень биосинтеза бета-каротина при совместном росте на простой по составу среде, не содержащей керосин и дорогостоящие компоненты.
Получена пара штаммов Blakeslea trispora 185Б(+) и 185Б(-), которая при совместном культивировании в течение 114 ч на ферментационной среде, содержащей в качестве основных компонентов негидролизованные соевую и кукурузную муку, растительное масло, тиамин, антиокислитель и бета-ионон, обеспечивает в лабораторных условиях средний уровень накопления бета-каротина, равный 300000 мкг/100 мл культуральной жидкости.
Штаммы Blakeslea trispora 185Б(+) и 185Б(-) получены из (+) и (-) форм коллекционного штамма B. trispora в результате многоступенчатой селекции с применением ультрафиолетовых лучей, азотистой кислоты и N-метил-N'-нитро-N-нитрозогуанидина в качестве мутагенных факторов.
Штаммы Blakeslea trispora 185Б(+) и 185Б(-) депонированы во Всесоюзной коллекции промышленных микроорганизмов института "ВНИИгенетика" под номерами ВКПМ F-674 и ВКПМ F-551 соответственно.
Штаммы 185Б(+) и 185Б(-) имеют следующие морфологические характеристики:
Сусло-агар.
185Б(+) Рост интенсивный. Воздушный мицелий развит равномерно, пушистый, палевого цвета. Спорообразование среднее.
185Б(-) Рост более медленный, чем у 185Б(+), Воздушный мицелий стелющийся или слабо пушистый, бледно-оранжевого цвета. Спорообразование скудное.
Среда Роулен-Тома с добавлением кукурузного экстракта.
Рост обоих (+) и (-) штаммов слабый. Воздушный мицелий серый паутинообразный, стелющийся. Спорообразование очень скудное.
Среда GAT для Blakeslea с глюкозой, аспарагином и тиамином (Phytochemistry, 1967, v. 6, N3, p. 355).
Рост обоих (+) и (-) штаммов слабый, замедленный. Воздушный мицелий белый, слегка приподнимающийся. Субстратный мицелий развит неравномерно, имеет оранжевую окраску. Спорообразование слабое.
Среда Роулен-Тома с сахарозой.
Оба (+) и (-) штамма образуют высокий, пушистый, воздушный мицелий белого цвета. Субстратный мицелий желтый. Спор практически не образует.
Совместный рост (+) и (-) штаммов на сусло-агаре.
При совместном росте в месте соприкосновения колоний наблюдается образование широкой, четко выраженной полосы кирпично-красного мицелия, на котором в небольшом количестве формируются черные зигоспоры.
Оптимальная температура роста штаммов 185Б(+) и 185Б(-) 26-28оС.
При совместном глубинном культивировании штаммов 185Б(+) и 185Б(-) в лабораторных условиях на ферментационной среде с соевой и кукурузной мукой, растительным маслом, тиамином, антиокислителем и бета-иононом при 28оС накопление бета-каротина через 114 ч роста культур в среднем составляет 300000 мкг/100 мл культуральной жидкости.
Штаммы 185Б(+) и 185Б(-) в течение 2 лет стабильно сохраняют свои морфологические признаки и уровень биосинтетической активности.
Штаммы 185Б(+) и 185Б(-) непатогенны.
П р и м е р 1. Для получения вегетативного посевного материала штаммы 185Б(+) и 185Б(-) выращивают раздельно на жидкой посевной среде, имеющей состав, г: Соевая мука 4,7 Кукурузная мука 2,3 KH2PO4 0,05 Тиамин 0,0002 Вода водопроводная до 100 мл.
Соевую и кукурузную муку перед приготовлением среды подвергают частичному гидролизу серной кислотой в автоклаве при 120оС в течение 1,5 ч. Перед стерилизацией pH среды доводят до 6,9 с помощью раствора NaOH.
Культивирование проводят в колбах Эрленмейера объемом 750 мл, содержащих для (+) штамма 100 мл, а для (-) штамма 150 мл среды. Засев посевных колб осуществляют водной суспензией спор 7-10-дневных культур на скошенном сусло-агаре в количестве 0,1-0,15 мл (+) штамма и 1,0-1,5 мл (-) штамма, Инкубацию проводят в течение 44 ч при 28оС на круговых качалках, вращающихся со скоростью 240 об/мин.
Процесс ферментации осуществляют путем совместного культивирования (+) и (-) штаммов на питательной среде следующего состава, г: Соевая мука 4,0 Кукурузная мука 1,73 KH2PO4 0,05 Тиамин 0,0002 Вода водопроводная до 100 мл. pH среды 6,1-6,2 (натуральный).
Приготовленную среду в количестве 50 мл помещают в колбы Эрленмейера объемом 750 мл, после чего в каждую колбу перед стерилизацией добавляют по 3 мл растительного масла. pH среды после стерилизации натуральный.
Посевной мицелий (+) и (-) штаммов в общем количестве 20% вносят в колбы с 50 мл ферментационной среды в соотношении 1:4 соответственно. Инкубацию проводят на круговых качалках со скоростью вращения 240 об/мин при 28оС.
Через 42 ч роста в культуральную жидкость добавляют антиокислитель (0,01%) и бета-ионон (0,15%). Продолжительность ферментации 114 ч.
По окончании ферментации содержимое нескольких колб объединяют. Для определения количества синтезированного бета-каротина используют мицелий, содержащийся в 100 мл смешанной культуральной жидкости. Определение осуществляют по следующей методике. 100 мл культуральной жидкости прогревают на водяной бане при 85-100оС в течение 15 мин, охлаждают и фильтруют. Бета-каротин, содержащийся в пробе полученной биомассы, экстрагируют ацетоном. Интенсивность окраски полученного раствора измеряют на фотоэлектрокалориметре при длине волны 440 нм. Содержание (уровень накопления) бета-каротина выражают в мкг/100 мл культуральной жидкости.
Ниже приведены накопления бета-каротина при совместном культивировании штаммов 185Б(+) и 185Б(-) (см. таблицу).
Таким образом, полученная новая пара штаммов Blakeslea trispora 185Б(+) и 185(-) по сравнению с прототипом при культивировании на близкой по компонентному составу и способу приготовления среде обеспечивает более высокий уровень биосинтеза бета-каротина, составляющий в среднем 300000 мкг/100 мл и максимально 334000 мкг/100 мл культуральной жидкости.
Использование: в микробиологической промышленности. Сущность: в результате многоступенчатой селекции получена новая пара мутантных штаммов гриба blakeslea trispora 185Б(+) и 185Б(-), продуцирующая бета-каротин. При совместном глубинном культивировании штаммов 185Б(+) и 185Б(-) в лабораторных условиях на питательной среде простого состава в течение 114 ч уровень накопления бета-каротина в мицелии составляет в среднем 300000 мкг/100 мл культуральной жидкости.
Пара штаммов гетероталличного гриба Blakeslea trispora F-674(+) и F-551(-), продуцирующая бета-каротин.
