ШТАММ БАКТЕРИЙ BACILLUS SUBTILIS - ПРОДУЦЕНТ РИБОФЛАВИНА Российский патент 1997 года по МПК C12N1/20 C12P25/00 C12N1/20 C12R1/125 

Изобретение относится к микробиологической промышленности, конкретно к микробиологическому синтезу рибофлавина (витамин В2), используемого в качестве добавки к кормам сельскохозяйственных животных, в пищевой и фармацевтической промышленности.

Известен штамм B.subtilis ВНИИГенетика 304 продуцент рибофлавина (а.с. СССР N 908092, C I2 P 25/00, 1984), синтезирующий до I г/л рибофлавина за 48 часов культивирования при 37^oC.

К недостаткам этого штамма следует отнести низкую продуктивность.

Важной задачей представляется получение нового штамма Bacillus subtilis
продуцента рибофлавина, обладающего более высокой продуктивностью.

Поставленная задача достигается получением генетико-селекционными методами штамма Bacillus subtilis 62/рМХ30ribo186 (ВКПМ В-6797) продуцента рибофлавина.

Работа по конструированию штамма Bacillus subtilis 62/рМХ30ribo186 включала несколько этапов:
конструирование с применением генетико-селекционных методов реципиентного штамма Bacillus subtilis Y6 с ненарушенной системой рекомбинации,
конструирование с применением генетико-селекционных методов рекомбинантной плазмиды, несущей рибофлавиновый оперон штамма Bacillus subtilis 53А с нарушенной негативной регуляцией,
конструирование рекомбинантного штамма-продуцента рибофлавина Bacillus subtilis 62/рМХ30ribo186.

Конструирование реципиентного штамма. Известно, что биосинтез рибофлавина в Bacillus subtilis подвержен негативному контролю. Имеются два типа мутаций, снимающих этот контроль: мутации в операторной области рибофлавинового оперона ribO и мутации по репрессору биосинтеза рибофлавина ribC. На первом этапе получения реципиентного штамма в штамм Bacillus subtilis RK6121 (коллекция отделения молекулярной и радиационной биофизики Санкт-Петербургского Института Ядерной Физики АН России) методом генетической трансформации вводят мутации ribC862 и ribO186. Затем для увеличения пула предшественника рибофлавина (гуанозин-5-трисфосфата) методом мутагенеза in vivo под действием N-метил-N-нитрозонитрогуанидина и ультрафиолета последовательно вводят мутации, определяющие устойчивость к 0.5 мг/мл 8-азагуанина и к 10 мг/мл метионин-сульфоксида. В полученный штамм, названный Bacillus subtilis 53А, также дополнительно вводят мутации, определяющие устойчивость к метионин-сульфоксиду (20 мг/мл), диацетилу (10 в ростовой среде) и псикофуранину (0,5 мг/мл). Таким образом был получен штамм-реципиент Bacillus subtilis Y6. Этот штамм синтезирует до 4 г/л рибофлавина за 48 часов культивирования при 37 41 ^oC.

Конструирование рекомбинантной плазмиды. К бациллярному вектору рМХ30 [Мол. Биол. 1984, т. 18, с.189 196] определяющему устойчивость бацилл к эритромицину и имеющему размер 18,3 т.п.н. (тысяч пар нуклеотидов), присоединяют фрагмент ДНК с рибофлавиновым опероном Bacillus subtilis 53А, содержащим мутацию ribO186 в операторной области. В результате была получена гибридная плазмида, которой присвоено название рМХ30 ribO186, обусловливающая устойчивость к 10 мкг/мл эритромицина и имеющая размер 28,6 т.п.н.

Конструирование рекомбинантного штамма Bacillus subtilis 62/рМХ30ribO186. В штамм Bacillus subtilis Y6 методом генетической трансформации вводят плазмиду рМХ30ribO186. Трансформанты отбирают по признакам устойчивости к 19 мкг/мл эритромицина и по повышению биосинтеза рибофлавина.

Полученный таким образом штамм Bacillus subtilis 62/рМХ30ribO186 способен синтезировать до 12,4 г рибофлавина (витамина В2) за 42 часа культивирования. Штамм депонирован 10.05.1994 г. во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов и имеет регистрационный номер ВКПМ В-6797.

Культурально-морфологические признаки.

Морфология под микроскопом. Спорообразующая грамположительная палочка длиной 2 3 мкм.

Морфология на разных средах.

Мясопептонный агар (МПА). На 2 сут. роста при 37^oC образует колонии с неровным краем диаметром 3 4 мм, поверхность гладкая, блестящая, колонии выделяют в среду пигмент, флуоресцирующий в УФ-лучах желтым цветом.

Мясопептонный бульон (МПБ). Рост по уколу умеренный, в основном на поверхности среды. Рост без качания на поверхности в виде пленки.

Минимальная среда Спицайзена с глюкозой. На 2 сут. роста образует колонии диаметром 2 3 мм, выделяющие в среду флуоресцирующий в УФ-лучах ярко-желтый пигмент.

Агар Хоттингера (АХ). На 2 сут. роста при 37^oC образует колонии с ровным краем диаметром 3 5 мм, поверхность гладкая, блестящая, колонии выделяют в среду пигмент, флуоресуирующий в УФ-лучах желтым цветом.

Физиолого-биохимические признаки. Растет при температуре 28 44^oC, оптимум температуры 41^oC, pH ростовых сред 5,5 9,0, оптимум pH 6,5 - 7,2.

Отношение к источникам углерода: хорошо утилизирует глюкозу, сахарозу, крахмал, мальтозу, мелассу. Отношение к источникам азота: хорошо усваивает аммоний, мочевину, (NH₄)₂НРО₄, (NH₄)₂SO₄.

Штамм Bacillus subtilis 62/рМХ30ribO186 имеет хромосомную ribC862-мутацию, ribO186-мутацию в хромосомной и плазмидных копиях рибофлавинового оперона, хромосомные мутации, обусловливающих устойчивость к 8-азагуанину (AzgR), метионин-сульфоксиду (MsoR), диацетилу (DacR), а так же плазмидную устойчивость к эритромицину (EmR).

Культивирование штамма Bacillus subtilis 62/pMX30ribO186 осуществляют следующим образом.

Односуточную культуру, выращенную на агаре Хоттингера с глюкозой и эритромицином, переносят в колбы с посевной средой, содержащей глюкозу, дрожжевой экстракт или кукурузный экстракт, пептон, минеральные соли, эритромицин.

Посевной материал выращивают 8 20 ч при 37 41 ^oC в условиях аэрации и в количестве 2 5% переносят в основную ферментационную среду.

Ферментационная среда содержит глюкозу, сахарозу или мелассу, высушенную биомассу дрожжей, дрожжевой экстракт, минеральные соли, содержит или не содержит эритромицин.

Ферментацию осуществляют при 37 43 ^oC, перемешивании и аэрации (сульфитное число 1 5 г О2/л ч ). Ферментация ведется с постоянной подачей подпитки, содержащей глюкозу, сахарозу или мелассу, кукурузный экстракт, дрожжевой экстракт, содержащий или не содержащий эритромицин.

Через 42 ч ферментации штамма Bacillus subtilis 62/pMXribO186 в среде накапливается до 12,4 г/л рибофлавина.

Пример 1.

Односуточную культуру Bacillus subtilis Y6, выращенную при 37^oC на косяке с агаризованной средой следующего состава:
пентон 10 г/л
дрожжевой экстракт 10 г/л
глюкоза 20 г/л
NaCl 2,5 г/л
агар-агар 15 г/л
(pH 6,8 7,2),
переносят петлей на жидкую среду следующего состава:
пептон 10 г/л
дрожжевой экстракт 10 г/л
глюкоза 20 г/л
NaCl 2,5 г/л
(pH 6,8 7,2)
Посевной материал выращивают в колбах Эрленмейера объемом 750 мл (объем среды 25 мл) на качалке 260 об/мин при температуре 41^oC в течении 8 ч и вносят в количестве 5% в ферментационную среду следующего состава:
меласса 15 г/л
дрожжевой экстракт 1,5 г/л
(NH₄)₂HPO₄ 14,2 г/л
К₂ SO₄ 5,33 г/л
MgSO₄ 7H₂O 0,71 г/л
(pH 6,8 7,2)
Ферментацию осуществляют в ферментерах типа MDL фирмы
Marubishi объемом 1 л с исходным объемом ферментационной среды 0,45 л при перемешивании (1100 об/мин), уровне аэрации 0,6 л/мин и температуре 41 ^oC. Подпитка подается в течении всей ферментации со скоростью подачи 3,6 г/л ч сахара. Объем поданной подпитки составляет 280 мл.

Состав подпитки:
меласса 330г/л сахара
кукурузный экстракт 150 мл/л
дрожжевой экстракт 1,5 г/л
(pH 6,8-7,2)
Через 42 ч культивирования концентрация рибофлавина в культуральной жидкости составляет 4,1 г/л.

Пример 2.

Тоже как, в примере 1, только в состав сред для получения односуточной культуры, посевного материала, для ферментации и подпитки дополнительно входит эритромицин в концентрации 10 мг/л и используют штамм Bacillus subtilis 62/pMXribO186.

В результате через 42 ч культивирования концентрация рибофлавина в культуральной жидкости составляет 12,4 г/л.

Использование: биотехнология, получение рибофлавина. Сущность изобретения: новый штамм бактерий Bacillus subtilis ВКПМ В-6797 - продуцент рибофлавина. Предлагаемый штамм - продуцент рибофлавина получен путем введения в реципиентный штамм Bacillus subtilis рекомбинантной плазмиды, несущей рибофлавиновый оперон штамма Bacillus subtilis с нарушенной негативной регуляцией. Штамм -продуцент устойчив к 8-азагуанину, метионинсульфоксиду, диацелиту, псикофуранину и к эритромицину и позволяет получать до 12,4 г/л рибофлавина за 42 ч культивирования.

Штамм бактерий Bacillus subtilis ВКПМ В-6797 продуцент рибофлавина.