МОНОКЛОНАЛЬНЫЕ АНТИТЕЛА ПРОТИВ АКТИВИРОВАННОГО ПРОТЕИНА С Российский патент 2015 года по МПК C07K16/36 A61K39/395 A61P7/02 

Настоящее изобретение заявляет приоритет предварительной заявки США No. 60/983092, поданной 26 октября 2007, все содержимое которой включено в настоящее описание посредством ссылки.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Настоящее изобретение относится в целом к области антител. Конкретнее, настоящее изобретение описывает идентификацию и применение моноклональных антител и фрагментов антител, избирательно направленных против активированного протеина С (APC).

Описание предшествующего уровня техники

Свертывание крови является процессом, состоящим из сложного взаимодействия различных компонентов крови или факторов, который приводит в результате к образованию фибринового сгустка. В целом, компоненты крови, участвующие в каскаде реакций свертывания, являются проферментами или зимогенами - ферментативно неактивными белками, которые переходят в активную форму под действием активатора. Регулирование свертывания крови преимущественно осуществляется ферментативно путем протеолитической инактивации факторов прокоагуляции Va и VIIIa, достигаемой с помощью активированного протеина C (APC) (Esmon, 1989).

Протеин C является предшественником APC, мощным природным антикоагулянтом. Протеин С активируется тромбином в комплексе с тромбомодулином (TM). Активация усиливается эндотелиальным рецептором протеина С (EPCR). TM и EPCR могут быть деактивированы с помощью медиатора воспаления, такого как фактор некроза опухоли, рассмотренный Esmon (1999). Также обнаружено, что TM и EPCR снижены при некоторых формах септического шока, в частности при менингококкемии. Поскольку EPCR и TM экспрессируются на эндотелии, невозможно определить, непосредственно как они функционируют, не удаляя кровеносные сосуды.

APC действует как антикоагулянт путем протеолитического расщепления и понижающей регуляции прокоагуляционных факторов. APC также выполняет важные функции в качестве антиапоптотического агента, противовосполительной молекулы и цитопротективного агента. Нарушения свертываемости, при которых регуляция гемостатического статуса нарушена в результате потери ключевого фактора, как, например, отсутствие фактора VIII при гемофилии, или у травматологических пациентов, в тех случаях, когда раневой процесс приводит к временной потере гемостаза, можно лечить путем удаления APC. Однако такое лечение может привести к нежелательным вредным последствиям, связанным с удалением благоприятных функций APC помимо удаления антикоагулянтного действия. Поэтому желательно иметь лекарство, которое избирательно направлено на антикоагулянтную активность APC и в то же время оставляет другие функции молекулы неповрежденными.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Создан и описан в настоящем документе способ лечения нарушений свертываемости, включающий в себя применение моноклонального антитела, которое распознает активированный протеин С, но не распознает неактивированный протеин С. В этой связи настоящее изобретение также предоставляет моноклональные антитела, которые избирательно связываются и/или блокируют протеолитический активный центр активированного протеина С. Указанные антитела могут ингибировать антикоагулянтную активность активированного протеина С, но не могут повлиять на какую-либо активность неактивированного протеина С в определенных воплощениях. Указанные антитела также могут поддерживать цитопротективные эффекты активированного протеина С в определенных воплощениях. Таким образом, способы настоящего изобретения также включают в себя лечение с применением указанных моноклональных антител, в тех случаях, когда желательно избирательно ингибировать антикоагулянтную активность активированного протеина С.

Соответственно, некоторые общие аспекты настоящего изобретения предполагают моноклональное антитело, где указанное антитело связывается и ингибирует активированный протеин С, но не связывается или не ингибирует неактивированный протеин С. Например, определенные воплощения настоящего изобретения предусматривают моноклональное антитело, где указанное антитело связывается и ингибирует антикоагулянтную активность активированного протеина С, но не связывается или не ингибирует активацию неактивированного протеина С. В определенных воплощениях моноклональное антитело настоящего изобретения представляет собой HAPC1573. Антитела настоящего изобретения могут связываться и ингибировать активированный протеин С и его антикоагулянтные активности in vivo и/или in vitro.

Предусмотрены другие моноклональные антитела настоящего изобретения, такие как антитело, которое ингибирует связывание активированного или неактивированного протеина С эндотелиальным рецептором протеина С (EPCR) или фосфолипидами и ингибирует активацию неактивированного протеина С. В определенных аспектах указанное антитело связывается с Gla-доменом неактивированного протеина С мыши. Указанные антитела могут быть использованы в контекстах in vitro или in vivo.

Антитело настоящего изобретения может представлять собой, например, антитело мыши, антитело настоящего изобретения может представлять собой, например, гуманизированное антитело. Антитело настоящего изобретения может быть включено в фармацевтическую композицию, где фармацевтическая композиция также включает в себя фармацевтически приемлемый носитель. Антитело настоящего изобретения также может быть использовано в способах, где антитело контактирует с клеткой in vitro или in vivo.

Также настоящим изобретением предусматривается способ ингибирования антикоагулянтной активности активированного протеина С у субъекта, включающий в себя введение эффективного количества антитела настоящего изобретения указанному субъекту (например, млекопитающему, такому как человек). В указанном способе или в любом другом способе настоящего изобретения, включающем в себя введение антитела настоящего изобретения, цитопротективные эффекты активированного протеина С в определенных воплощениях могут быть не описаны или могут оставаться в пределах нормальных значений.

Также предусмотрены способы ингибирования амидолитической активности активированного протеина С у субъекта, включающие в себя введение эффективного количества антитела настоящего изобретения указанному субъекту.

Настоящим изобретением также предусмотрен способ лечения субъекта, который нуждается в коагуляции крови, включающий в себя введение эффективного количества антитела настоящего изобретения указанному субъекту. Указанный субъект может болеть, например, гемофилией или геморрагией.

В настоящем описании также предусмотрен способ лечения субъекта, имеющего сепсис, который включает в себя введение эффективного количества антитела настоящего изобретения. Указанные способы также могут включать в себя введение активированного протеина С.

Также предусмотрены способы лечения субъекта, имеющего гемофилию, которые включают в себя введение эффективного количества антитела настоящего изобретения.

Антитела настоящего изобретения также могут быть использованы, например, в способах модулирования гемостаза у субъекта или модулирования тромбообразования у субъекта, включающих в себя введение эффективного количества антитела настоящего изобретения. Указанные способы также могут включать в себя введение активированного протеина С.

Определенные способы настоящего изобретения предполагают способ ингибирования активации неактивированного протеина С, включающий в себя введение субъекту эффективного количества моноклонального антитела настоящего изобретения. Антитела, применяемые в указанных способах, также могут ингибировать связывание активированного или неактивированного протеина С эндотелиальным рецептором протеина С (EPCR) или фосфолипидами.

Согласно настоящему изобретению субъект может представлять собой, например, млекопитающее, такое как мышь, крыса, кролик, собака, лошадь или человек.

Если не указано иначе, любое антитело, описанное в настоящем документе, может быть фрагментом антитела. Например, антитело дополнительно может быть определено как Fab', Fab, F(ab')₂, однодоменное антитело, Fv или scFv, которые являются хорошо известными типами фрагментов антител. Если не указано иначе, антитело настоящего изобретения также включает указанные фрагменты.

Термин "антитело" используют для обозначения любого антитела как молекулы, которая имеет антиген-связывающий участок, и термин включает в себя фрагменты антител, такие как Fab', Fab, F(ab')2, однодоменные антитела (DABs), Fv, scFv (одноцепочечный Fv) и т.д., описанные далее. Технические приемы получения и применения различных конструкций на основе антител и фрагментов антител хорошо известны в данной области техники. Средства для получения и характеристики антител также хорошо известны в данной области техники (см., например, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988; включенный в описание посредством ссылки).

Другой аспект изобретения предполагает вариабельный участок, который включает в себя изменяющиеся гипервариабельные участки или CDR и каркасные области или FR. CDR представляют собой последовательности в пределах вариабельной области, которые в целом дают антигенную специфичность.

Изобретение также охватывает фрагменты антител, которые включают в себя последовательность вариабельного участка, достаточную, чтобы обеспечить антигенное связывание. Фрагменты антител включают в себя без ограничения Fab, Fab', F(ab')₂, Fv, SFv, scFv (одноцепочечный Fv), полученные либо путем протеолитического расщепления интактных антител, например расщепление папаином или пепсином, либо с помощью рекомбинантных методов, в которых воздействуют на кДНК интактных тяжелых и легких цепей для получения фрагментов тяжелых и легких цепей либо по отдельности, либо в виде части одного и того же полипептида.

В пределах объема изобретения mAb также включают в себя последовательности, соответствующие антителам человека, антителам животных и их комбинации. Термин "химерное антитело", используемый в описании, включает в себя антитела, которые имеют вариабельные участки, полученные из антитела животного, такие как антитела крысы или мыши, слитые с другой молекулой, например с константными доменами, полученными из антитела человека. Один тип химерных антител, "гуманизированные антитела", имеет вариабельные участки, измененные (посредством мутагенеза или переноса CDR) для соответствия (насколько возможно) известной последовательности человеческих вариабельных участков. Перенос CDR включает в себя перенос CDR из антитела с желаемой специфичностью на FR антитела человека, при этом значительную часть нечеловеческой последовательности замещают человеческой последовательностью. Поэтому гуманизированные антитела больше соответствуют (по аминокислотной последовательности) последовательности известных антител человека. С помощью гуманизации мышиных моноклональных антител уменьшают тяжесть ответа на человеческое антимышиное антитело, или HAMA. Изобретение далее включает в себя полностью человеческие антитела, которые бы предотвращали, насколько возможно, ответ на HAMA. Получение гуманизированных антител описано более подробно далее.

Применяемый в описании термин "фармацевтически приемлемый носитель" включает в себя любой и все растворители, дисперсионные среды, покрытия, сурфактанты, антиоксиданты, консерванты (например, антибактериальные средства, противогрибковые средства), изотонические агенты, агенты, задерживающие абсорбцию, соли, консерванты, лекарства, стабилизаторы лекарств, гели, связующие вещества, эксципиенты, дезинтегрирующие агенты, лубриканты, подсластители, вкусовые добавки, красители, подобные материалы и их комбинации, которые должны быть известны специалисту в данной области техники (см., например, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. Mack Printing Company, 1990, pp. 1289-1329). Кроме случаев, когда любой общепринятый носитель несовместим с активным ингредиентом, предусматривается его применение в терапевтических или фармацевтических композициях.

Термин "контакт", применительно к клетке, используется в настоящем документе для описания процесса, с помощью которого соединение изобретения доставляется в клетку-мишень или располагается в прямом соприкосновении с клеткой-мишенью.

Термин "эффективный", в том виде, как данный термин используется в настоящем описании и/или формуле изобретения (например, "эффективное количество"), означает достаточный для достижения желаемого, ожидаемого или намеченного результата.

Термин "в основном" и его разновидности обозначают в значительной степени, но не обязательно полностью, что очевидно для специалиста в данной области техники, и в одном не ограничивающем воплощении в основном относится к диапазонам в пределах 10%, в пределах 5%, в пределах 1% или в пределах 0,5%

Термины "ингибирование", "снижение" или "предотвращение" или любая разновидность указанных терминов, когда они используются в формуле изобретения и/или в описании, включают в себя любое измеряемое снижение или полное ингибирование для достижения желаемого результата. Например, может быть снижение активности, по сравнению с нормальным состоянием, на 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или больше, или снижение активности в любом диапазоне, получаемом с указанными здесь значениями.

В настоящей заявке термин "приблизительно" используют, чтобы показать, что значение включает в себя неустранимое отклонение ошибки устройства или способа, применяемого для определения значения, или отклонение, которое есть среди субъектов исследования. Например, "приблизительно" может быть в пределах 10%, предпочтительно в пределах 5%, более предпочтительно в пределах 1% и наиболее предпочтительно в пределах 0,5%.

Термин, представленный в единственном числе, если он применяется в сочетании с термином "включающий" в формуле изобретения и/или в описании, может означать "один", но также он согласуется со значением "один или более", "по меньшей мере один" и "один или более чем один".

Термин "или" в пунктах формулы изобретения применяют в значении "и/или", если не указано особо, что ссылка относится только к альтернативным вариантам, или если альтернативные варианты являются взаимоисключающими, хотя раскрытие изобретения поддерживает определение, которое относится только к альтернативным вариантам и вариантам "и/или".

Применяемые в данном описании и в пункте (пунктах) формулы изобретения слова "состоящий из" (и любая форма "состоящий из", такая как "состоят из" и "состоит из"), "имеющий" (и любая форма “имеющий”, такая как "имеют" и "имеет"), "включающий" (и любая форма “включающий”, такая как "содержит" и "содержат") или "содержащий" (и любая форма “содержащий”, такая как "содержит" и "содержат") являются инклюзивными или с открытым концом и не исключают дополнительных, не перечисленных элементов или стадий способа.

Предполагается, что любое воплощение, обсуждаемое в настоящем описании, может быть осуществлено в отношении любого соединения, способа или композиции изобретения, и наоборот.

Другие объекты, особенности и преимущества настоящего изобретения становятся очевидными из последующего подробного описания. Однако следует понимать, что подробное описание и конкретные примеры, которые показывают предпочтительные воплощения изобретения, даны только с иллюстративной целью, поскольку различные изменения и модификации, соответствующие духу и изобретению, будут очевидны для специалиста в данной области техники из настоящего подробного описания.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Следующие чертежи являются частью настоящего описания и включены, чтобы продемонстрировать далее определенные аспекты настоящего изобретения. Изобретение может быть лучше понято с помощью ссылки на один или более из указанных чертежей в комбинации с подробным описанием конкретных воплощений, представленных в настоящем документе.

ФИГ.1. Стандартная кривая APC ELISA.

ФИГ.2. HAP1573 усиливает связывание APC на эндотелии.

ФИГ. 3. HAPC1573 способствует интернализации APC в клетки EA.

ФИГ.4. HAPC1573 изменяет амидолитическую активность APC по отношению к хромогенному субстрату.

ФИГ.5. HAPCl573 блокирует антикоагулянтную активность APC в анализе (коагулирующей активности) плазмы крови.

ФИГ.6. HAPCl573 усиливает расщепление гистонов APC.

ФИГ.7A-B. Эффект HAPC1573 на APC-цитопротекцию против гистонов.

ФИГ.8A-C. MPC1609 и MAPC1591 ингибируют антикоагулянтную активность APC. (ФИГ.8A) Клетки bEnd3 инкубировали с 100 нМ FL-APC без или в присутствии 125 нМ MPC1609 или MAPC1591 в течение 15 мин на льду и проводили анализ методом проточной цитометрии. (ФИГ.8B) Клетки bEnd3 инкубировали с 100 нМ протеина C и 5 нМ тромбина в присутствии или без 100 нМ MPC 1609 или MAPCl 591 в течение 15 мин при 37°C и измеряли активность APC с помощью хромогенного субстрата PCa. (ФИГ.8C) Время одностадийной коагуляции плазмы крови измеряли с 200 нг/мл, без или в присутствии 5 мкг/мл MPC1609 или MAPC1591. Тесты активации протеина С и свертывания крови выполняли в дупликатах, и все ошибки находились в пределах 5%.

ФИГ.9. MPC1609, но не MAPCl591 увеличивал летальность у мышей при введении вместе с сублетальной дозой LPS. Мышам BL6 вводили внутривенную инъекцию 10 мг/кг LPS с 10 мг/кг MPC1609 или MAPC1591 и регистрировали показатели выживаемости.

ФИГ.10A-D. Температура тела, концентрации в сыворотке крови IL-6, мочевины и креатинина у мышей, перенесших инъекцию LPS и MPC1609 или MAPCl 591. Мышам BL6 (4 мыши в каждой группе) вводили внутривенную инъекцию физиологического раствора, 10 мг/кг LPS или 10 мг/кг LPS с 10 мг/кг MPC1609 или MAPC1591. (ФИГ.10A) Температуру тела мыши (ФИГ.10B), концентрации в сыворотке крови IL-6 (ФИГ. 10C-D), мочевины и креатинина измеряли через 3 часа или через 18 часов после инъекции.

ФИГ.11A-C. MAPC1591 усиливает APC-расщепление гистонов. (ФИГ.11A) 100 мг/мл гистона H3 тимуса теленка (левая панель) или H4 (правая панель) инкубировали в Opti-MEM с добавлением или без добавления 100 нМ APC, без или в присутствии 200 нМ MAPC1591 в течение 1 часа при 37°C. Затем проводили анализ образцов методом электрофореза в ДСН-ПААГ с окраской Кумасси голубым. (ФИГ.11B) Клетки EA.hy926 культивировали с гистонами тимуса теленка (50 мкг/мл) без или в присутствии APC (100 нМ) и MAPC1591 (200 нМ) в течение 1 часа при 37°C. Количество погибших клеток измеряли с помощью проточной цитометрии по положительному окрашиванию PI (FL3). (ФИГ.11C) Мышам BL6 вводили внутривенную инъекцию физиологического раствора, 10 мг/кг LPS или 10 мг/кг LPS с 10 мг/кг MAPC1591 или MPC1609. Образцы плазмы получали через 18 часов после введения и проводили анализ методом электрофореза ДСН-ПААГ и вестерн-блоттинга с применением козьего антитела против гистона H3.

ОПИСАНИЕ ИЛЛЮСТРАТИВНЫХ ВОПЛОЩЕНИЙ

Настоящее изобретение относится к раскрытию моноклональных антител, которые избирательно связываются с активированным протеином С, но не связываются с неактивированным протеином С, и специфически ингибируют антикоагуляционную активность активированного протеина С. Указанные и другие аспекты изобретения подробно описаны ниже.

А. Структура антитела

Антитела составляют большое семейство гликопротеинов с общими структурными особенностями. Антитело включает в себя четыре полипептида, которые образуют трехмерную структуру, которая похожа на букву Y. Обычно антитело включает в себя два различных полипептида, тяжелую цепь и легкую цепь. Молекула антитела состоит из одной или более Y-единиц, каждая единица Y включает в себя две тяжелые цепи и две легкие цепи.

Молекула антитела обычно состоит из трех функциональных доменов: Fc, Fab и антигенсвязывающего участка. Домен Fc расположен в основании Y. “Плечи” Y содержат Fab-домены. Антигенсвязывающий участок расположен на конце каждого “плеча”. Область точки опоры “плеч” Y представляет собой шарнирную область.

Существует пять различных типов полипептидов тяжелых цепей, обозначаемых как α, δ, ε, γ и μ. Существуют два различных типа полипептидов легких цепей, обозначаемых κ и λ. Антитело обычно имеет в своем составе только один тип тяжелой цепи и только один тип легкой цепи, хотя любая легкая цепь может соединяться с любой тяжелой цепью.

Карбоксильный конец полипептида каждой тяжелой цепи называется константной (Fc) областью. Аминоконец полипептида каждой тяжелой и легкой цепи называется вариабельной (V) областью. Внутри вариабельных участков цепей находятся гипервариабельные участки, называемые участками, определяющими комплементарность (CDR). Вариабельные участки одной тяжелой цепи и одной легкой цепи соединяются с образованием антигенсвязывающего участка. Каждая тяжелая цепь и каждая легкая цепь включает в себя три CDR. Шесть CDR антигенсвязывающего участка определяют аминокислотные остатки, которые формируют фактически существующий участок связывания антигена. Вариабельность CDR обуславливает разнообразие распознаваемых антигенов.

B. Получение моноклональных антител настоящего изобретения

Настоящее изобретение имеет отношение к получению и применению молекул, которые способны к "специфическому связыванию" с другой молекулой. В настоящем описании молекулу называют способной к "специфическому связыванию" с другой молекулой, если указанное связывание зависит от соответствующих структур молекул. Известная способность антитела связываться с иммуногеном представляет собой пример "специфического связывания". Указанные взаимодействия являются противоположными неспецифическому связыванию, в которое вовлечены классы соединений независимо от их химической структуры (например, связывание белков нитроцеллюлозой и т.д.) Наиболее предпочтительно, антитело настоящего изобретения будет демонстрировать "высокоспецифическое связывание" такое, что антитело будет неспособно или в основном неспособно к связыванию близкородственных гетерологичных молекул. Действительно, предпочтительные моноклональные антитела настоящего изобретения демонстрируют способность связываться с активированным протеином C, но в основном не способны связываться с неактивированным протеином C. В других воплощениях моноклональные антитела специфически ингибируют только антикоагулянтные активности APC путем связывания и блокирования протеолитического активного участка APC.

Таким образом, в одном воплощении указанные молекулы включают в себя фрагменты (такие как (F(ab'), F(ab')₂), которые получены, например, путем протеолитического расщепления mAb, или одноцепочечные иммуноглобулины, получаемые, например, рекомбинантными способами. Указанные производные антител являются моновалентными. В одном воплощении указанные фрагменты могут быть соединены друг с другом или с другими фрагментами антител или с лигандами рецепторов, с образованием "химерных" связывающих молекул. Такие химерные молекулы в значительной степени могут содержать заместители, способные к связыванию с различными эпитопами одной и той же молекулы, или они могут быть способны к связыванию с эпитопом активированного протеина C и с эпитопом "неактивированного протеина C".

Моноклональное антитело может быть легко получено с помощью хорошо известных методов, таких как методы, представленные в качестве примера в патенте США 4196265, который включен в описание посредством ссылки. Обычно способ включает в себя первое иммунизирование подходящего животного выбранным антигеном (например, полипептид или полинуклеотид настоящего изобретения), с помощью способа, достаточного, чтобы обеспечить иммунный ответ. Грызуны, например мыши и крысы, являются предпочтительными. Клетки селезенки иммунизированного животного затем соединяют с клетками иммортализованной миеломной клеточной линии. Если иммунизированное животное является мышью, то предпочтительная миеломная клеточная линия представляет собой клеточную линию NS-I миеломы мышей.

Слитые клетки “селезенка/миелома” культивируют в селективной среде, чтобы отделить слитые клетки “селезенка/миелома” от родительских клеток. Слитые клетки выделяют из смеси неслитых родительских клеток, например, с помощью добавления агентов, которые блокируют синтез нуклеотидов de novo в среде тканевой культуры. Типичными и предпочтительными агентами являются аминоптерин, метотрексат и азасерин. Аминоптерин и метотрексат блокируют синтез de novo пуринов и пиримидинов, тогда как азасерин блокирует только синтез пуринов. Если используют аминоптерин или метотрексат, среду дополняют гипоксантином и тимидином в качестве источника нуклеотидов. Если используют азасерин, то среду дополняют гипоксантином.

Указанное культивирование обеспечивает получение популяции гибридом, из которых отбирают специфические гибридомы. Обычно отбор гибридом производят путем культивирования клеток с разведением одного клона в титрационных микропланшетах, с последующим тестированием супернатантов индивидуальных клонов на реактивность с антигенами-полипептидами. Выбранные клоны затем можно размножать неопределенно долго для получения моноклонального антитела.

В качестве конкретного примера, чтобы получить моноклональное антитело, мышам вводят внутрибрюшинно приблизительно 1-200 мкг антигена, содержащего полипептид. B-лимфоциты стимулируют для роста введением антигена совместно с адъювантом, например с полным адъювантом Фрейнда (неспецифический стимулятор иммунного ответа, содержащий убитую Mycobacterium tuberculosis). В какой-то момент (например, две недели) спустя после первой инъекции мышей повторно иммунизируют с помощью инъекции второй дозы антигена, смешанного с неполным адъювантом Фрейнда.

Через несколько недель после второй инъекции у мышей забирают кровь из хвостовой вены и сыворотку титруют с помощью метода иммунопреципитации с меченным изотопом антигеном. Предпочтительно, процесс повторной иммунизации и титрования повторяют до достижения подходящего титра. Выделяют селезенку мыши с самым высоким титром и лимфоциты селезенки получают путем гомогенизации селезенки с помощью шприца. Обычно селезенка иммунизированного животного содержит приблизительно от 5×10 до 2×10 лимфоцитов.

Мутантные лимфоцитарные клетки, известные как миеломные клетки, получают от лабораторных животных, у которых индуцируют рост указанных клеток с помощью ряда хорошо известных способов. Миеломные клетки не имеют "реутилизационного" пути биосинтеза нуклеотидов. Поскольку миеломные клетки представляют собой опухолевые клетки, они могут расти неопределенно долго в тканевой культуре и поэтому называются бессмертными. Установлены многочисленные клеточные линии миеломных клеток мышей и крыс, например клетки миеломы мышей NS-I.

Миеломные клетки соединяют в условиях, способствующих слиянию с нормальными антитело-продуцирующими клетками, полученными из селезенки мыши или крысы, которым ввели антиген/полипептид. Условия слияния включают в себя, например, присутствие полиэтиленгликоля. Получаемые слитые клетки представляют собой гибридомные клетки. Подобно клеткам миеломы, клетки гибридомы могут расти в культуре неопределенно долго.

Гибридомные клетки выделяют из неслитых миеломных клеток путем культивирования в селективной среде, например среде HAT (гипоксантин, аминоптерин, тимидин). Неслитые миеломные клетки не имеют ферментов, необходимых для синтеза нуклеотидов по "реутилизационному" пути, поскольку они погибают в присутствии аминоптерина, метотрексата или азасерина. Неслитые лимфоциты также не могут продолжать расти в тканевой культуре. Таким образом, только клетки, которые успешно слиты (гибридомные клетки), могут расти в селективной среде.

Каждая из выживших гибридомных клеток производит одно антитело. Затем проводят скрининг указанных клеток на продукцию специфического антитела, иммунореактивного по отношению к антигену/полипептиду. Методом серийных разведений выделяют отдельные гибридомы. Гибридомы серийно разводят много раз, после разведений оставляют для роста, супернатант тестируют на наличие моноклональных антител. Клоны, продуцирующие указанное антитело, затем культивируют в больших количествах, чтобы получить антитело в подходящем количестве.

Liaw et al. (2003), в работе, включенной в настоящее описание во всей полноте посредством ссылки, описаны способы получения определенных мышиных моноклональных антител против активированного и неактивированного протеина C человека.

Если антитела или их фрагменты предназначены для терапевтических целей, может быть желательно "гуманизировать" их, чтобы смягчить какой-либо иммунный ответ. Указанные гуманизированные антитела могут быть изучены в контексте in vitro или in vivo. Гуманизированные антитела могут быть получены, например, путем замены иммуногенной части антитела на соответствующую, но неиммуногенную часть (т.е. химерные антитела). Robinson et al., патентная заявка США согласно PCT PCT/US86/02269; Akira et al., Европейская патентная заявка 184187; Taniguchi, Европейская патентная заявка 171496; Morrison et al., Европейская патентная заявка 173494; Neuberger et al., Международная патентная заявка согласно PCT WO 86/01533; Cabilly et al., Европейская патентная заявка 125023; Better et al. (1988); Liu et al. (1987); Liu et al. (1987); Sun et al. (1987); Nishimura et al. (1987); Wood et al. (1985); Shaw et al. (1988); которые включены в описание посредством ссылки. Общие обзоры "гуманизированных" химерных антител предоставлены Morrison (1985) и Oi et al. (1986); указанные обзоры включены в описание посредством ссылки).

Подходящие "гуманизированные" антитела альтернативно могут быть получены путем замены CDR или CEA. Jones et al. (1986); Verhoeyan et al. (1988); Beidler et al. (1988); все указанные документы включены в описание посредством ссылки.

D. Фармацевтические композиции

Фармацевтические композиции настоящего изобретения включают в себя эффективное количество одного или более антител, терапевтических агентов или дополнительного агента, растворенных или диспергированных в фармацевтически приемлемом носителе. Водные композиции настоящего изобретения включают в себя эффективное количество антитела, растворенного или диспергированного в фармацевтически приемлемом носителе или водной среде. Выражения "фармацевтически или фармакологически приемлемый" относятся к молекулярным субстанциям и композициям, которые не вызывают побочную, аллергическую или другую неблагоприятную реакцию при введении животному или человеку соответствующим образом.

Применяемый в описании термин "фармацевтически приемлемый носитель" включает в себя один или все растворители дисперсионные среды, покрытия, сурфактанты, антиоксиданты, консерванты (например, антибактериальные средства, противогрибковые средства), изотонические агенты, агенты, задерживающие абсорбцию, соли, консерванты, лекарства, стабилизаторы лекарств, гели, связующие вещества, эксципиенты, дезинтегрирующие агенты, лубриканты, подсластители, вкусовые добавки, красители, подобные материалы и их комбинации, которые должны быть известны специалисту в данной области техники (см., например, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. Mack Printing Company, 1990, pp. 1289-1329, включенный в настоящее описание посредством ссылки). Применение указанных сред и агентов для фармацевтических активных субстанций хорошо известно в данной области техники. Использование любой традиционной среды или агента в составе терапевтических композиций рассматривается лишь в тех случаях, когда они не являются несовместимыми с активным ингредиентом. Дополнительные активные ингредиенты также могут быть включены в композиции. Для введения человеку препараты должны соответствовать стандартам стерильности, пирогенности, общей безопасности и чистоты согласно требованиям службы FDA по биологическим стандартам.

Биологический материал должен быть тщательно диализирован для удаления нежелательных молекул с низким молекулярным весом и/или лиофилизирован для более легкого приготовления лекарственного средства в желаемом носителе, когда это целесообразно. Затем активные соединения обычно включают в композиции для парентерального введения, например включают в композиции для инъекций, вводимых внутривенным, внутримышечным, подкожным, интраназальным, внутрираневым или даже внутрибрюшинным путем. Обычно такие композиции могут быть приготовлены в виде препаратов для инъекций или в виде жидких растворов или суспензий; также могут быть приготовлены твердые формы, удобные для приготовления растворов или суспензий при добавлении жидкости перед введением инъекции; и препараты также могут быть эмульгированными.

Фармацевтические формы, подходящие для инъекционного применения, включают в себя стерильные водные растворы или суспензии; композиции, содержащие кунжутное масло, арахисовое масло или водный раствор пропиленгликоля; и стерильные порошки для экстемпорального приготовления стерильных инъекционных растворов или дисперсионных систем. Во всех случаях лекарственная форма должна быть стерильной и должна быть жидкой при условии, что существует возможность легкого введения лекарственной формы через шприц. Лекарственная форма должна быть стабильна в условиях производства и хранения и должна быть защищена от контаминирующего действия микроорганизмов, таких как бактерии и грибки.

Растворы активных соединений в виде свободных оснований или фармакологически приемлемых солей могут быть приготовлены в воде, соответственно смешанной с сурфактантом, например с гидроксипропилцеллюлозой. Дисперсионные системы также могут быть приготовлены в глицерине, жидких полиэтиленгликолях и в их смесях и в маслах. В обычных условиях хранения и применения указанные препараты содержат консерванты для предотвращения роста микроорганизмов.

Антитела настоящего изобретения могут быть включены в композицию в форме свободного основания, в нейтральной форме или в форме соли. Фармацевтически приемлемые соли включают в себя кислые соли присоединения (образованные со свободными аминогруппами протеина) и соли, которые образованы с неорганическими кислотами, такими как, например, соляная или фосфорная кислоты, или с органическими кислотами, такими как уксусная, щавелевая, винная, миндальная кислоты и т.п. Соли, образованные со свободными карбоксильными группами, также могут быть получены из неорганических оснований, таких как, например, гидроксиды натрия, калия, аммония, кальция или гидроксид железа, и таких органических оснований как изопропиламин, триметиламин, гистидин, прокаин и т.п.

Носитель также может быть растворителем или дисперсионной средой, содержащей, например, воду, этанол, полиол (например, глицерин, пропиленгликоль и жидкий полиэтиленгликоль, и т.д.), их подходящие смеси и растительные масла. Соответствующую текучесть можно поддерживать, например, с помощью применения покрытия, такого как лецитин, путем сохранения требуемого размера частиц в случае дисперсной системы и с помощью применения сурфактантов. Защита от действия микроорганизмов может быть осуществлена с помощью различных антибактериальных и противогрибковых агентов, например парабенов, хлорбутанола, фенола, сорбиновой кислоты, тимеросала и т.п. Во многих случаях предпочтительно включать в состав изотонические агенты, например сахара или хлорид натрия. Пролонгированная абсорбция инъецируемых композиций может быть осуществлена с помощью применения в композициях агентов, задерживающих абсорбцию, например моностеарата алюминия и желатина.

Стерильные инъецируемые растворы получают путем соединения активных соединений в необходимом количестве в подходящем растворителе с различными другими ингредиентами, приведенными выше, по мере необходимости, с последующей стерилизацией фильтрованием. В целом, дисперсные системы получают путем введения различных стерилизованных активных ингредиентов в стерильный носитель, который содержит основную дисперсионную среду и другие необходимые ингредиенты, из градиентов, приведенных выше. В случае стерильных порошков для приготовления стерильных инъецируемых растворов, предпочтительные способы приготовления представляют собой высушивание в вакууме или замораживание-оттаивание, которые дают в результате порошок активного ингредиента плюс любой дополнительный желаемый ингредиент из его ранее стерильно-фильтрованного раствора. Также предусмотрено приготовление более или высококонцентрированных растворов для прямого введения в тех случаях, когда предполагается применение DMSO в качестве растворителя, что дает в результате очень быстрое проникновение с доставкой высоких концентраций активных агентов в небольшую область.

После создания растворы могут быть введены способом, соответствующим дозированной композиции, и в количестве, которое является терапевтически эффективным. Композиции являются легко вводимыми в различных дозированных формах, таких как тип инъецируемых растворов, описанных выше, но также могут быть использованы капсулы с высвобождением лекарств и т.д.

Для парентерального введения в водном растворе, например, раствор должен быть надлежаще забуферен, если необходимо, и жидкий растворитель должен быть заранее приведен в изотоническое состояние достаточным количеством физиологического раствора или глюкозы. Указанные конкретные водные растворы являются особенно подходящими для внутривенного, внутримышечного, подкожного, интраназального и внутрибрюшного введения. В этой связи, стерильная водная среда, которая может быть использована, будет известна специалисту в данной области техники в свете настоящего раскрытия. Например, одна доза может быть растворена в 1 мл изотонического раствора NaCl и либо добавлена к 1000 мл жидкости для подкожной инфузии, либо инъецирована в предполагаемое место инфузии (см., например, "Remington's Pharmaceutical Sciences" 15th Edition, pages 1035-1038 and 1570-1580). Безусловно, будет иметь место некоторое варьирование дозировки в зависимости от состояния субъекта, который получает лечение. Специалист, ответственный за введение лекарства, в любом случае, будет определять соответствующую дозу для конкретного субъекта.

Помимо включения соединений в композиции для парентерального введения, таких как внутривенная или внутримышечная инъекция, другие фармацевтически приемлемые формы включают в себя, например, таблетки или другие твердые формы для перорального введения; липосомальные композиции; капсулы с пролонгированным действием; и любая другая форма, применяемая в настоящее время, включая кремы.

В определенных воплощениях предусмотрено применение липосом и/или наночастиц для приготовления лекарственной формы и введения антител и/или их аналогов. Формирование и применение липосом в целом известно специалисту в данной области техники и также описано ниже.

Нанокапсулы, в основном, могут захватывать соединения стабильным и воспроизводимым способом. Чтобы избежать побочных эффектов, вызванных внутриклеточной полимерной перегрузкой, указанные ультрамелкие частицы (размером приблизительно 0,1 мкм) следует разрабатывать с применением полимеров, способных разрушаться in vivo. Биодеградируемые полиалкилцианоакриловые наночастицы, которые соответствуют указанным требованиям, предусмотрены для применения в настоящем изобретении, и указанные частицы являются легко получаемыми.

Липосомы формируют из фосфолипидов, которые диспергируют в водной среде, и они спонтанно образуют многослойные концентрические двухслойные везикулы (также называемые мультиламеллярными везикулами, (MLVs)). MLV обычно имеют диаметр от 25 нм до 4 мкм. Обработка ультразвуком MLV приводит к образованию маленьких униламеллярных везикул (SUVs) с диаметром в диапазоне 200-500 Å, содержащих в центре водный раствор.

Следующая информация также может быть использована в создании липосомальных композиций. Фосфолипиды могут образовывать различные структуры помимо липосом при диспергировании в воде, в зависимости от молярного соотношения липида к воде. При низком соотношении липосома является предпочтительной структурой. Физические характеристики липосом зависят от значения pH, ионной силы и присутствия двухвалентных катионов. Липосомы могут демонстрировать низкую проницаемость для ионных и полярных веществ, но при повышенных температурах они претерпевают фазовый переход, который заметно меняет их проницаемость. Фазовый переход включает в себя изменение плотно упакованной, упорядоченной структуры, известной как гелеобразное состояние, в неплотно упакованную, неорганизованную структуру, известную как жидкое состояние. Указанный процесс происходит при характеристической температуре фазового перехода и в результате приводит к увеличению проницаемости для ионов, сахаров и лекарств.

Липосомы взаимодействуют с клетками четырьмя различными механизмами: эндоцитоз фагоцитарными клетками ретикулоэндотелиальной системы, такими как макрофаги и нейтрофилы; адсорбция на поверхности клетки, либо с помощью неспецифических слабых гидрофобных или электростатических сил, либо с помощью специфических взаимодействий с компонентами клеточной поверхности; слияние с плазматической клеточной мембраной путем включения липидного бислоя липосомы в плазматическую мембрану с одновременным высвобождением содержимого липосом в цитоплазму; и путем переноса липосомальных липидов на клеточные или субклеточные мембраны, или, наоборот, без какого-либо слияния содержимого липосом. Варьируя состав липосомы, можно менять действующий механизм, хотя одновременно может работать более чем один механизм.

Терапевтический агент может включать в себя различные типы носителей, в зависимости от того, вводится ли он в твердой жидкой или аэрозольной форме и должен ли он быть стерильным при таких путях введения как инъекция. Композиция по настоящему изобретению может быть введена внутривенно, внутрикожно, внутриартериально, внутрибрюшинно, внутрь раны, интракраниально, внутрь сустава, внутрь предстательной железы, внутриплеврально, интратрахеально, интраназально, интравитреально, внутривагинально, интраректально, местно, интратуморально, внутримышечно, подкожно, подконъюктивально, интравезикулярно, через слизистые оболочки, интраперикардиально, через пуповину, перорально, местно, локально, ингаляционно (например, аэрозольная ингаляция), с помощью инъекции, инфузии, непрерывной инфузии, локализованной перфузии, непосредственно омывающей клетки-мишени, через катетер, посредством орошения, в кремах, в липидных композициях (например, липосомы) или с помощью других способов или любой комбинации способов, упомянутых выше, как должно быть известно специалисту в данной области техники (см., например, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. Mack Printing Company, 1990, включенный в описание посредством ссылки).

Фактический размер дозировки композиции настоящего изобретения, вводимой животному-пациенту, может быть определен с помощью физических и физиологических факторов, таких как вес тела, тяжесть состояния, тип заболевания, которое лечат, предшествующие или сопутствующие терапевтические мероприятия, идиопатия у пациента и путь введения композиции. Практикующий врач, ответственный за введение, в любом случае будет определять концентрацию активного ингредиента (ингредиентов) в композиции и дозу (дозы), предназначенную для каждого конкретного субъекта.

В определенных воплощениях фармацевтические композиции могут включать в себя, например, по меньшей мере приблизительно 0,1% активного соединения. В других воплощениях активное соединение может составлять от приблизительно 2% до приблизительно 75% веса одной единицы дозирования, или, например, от приблизительно 25% до приблизительно 60%, и любой диапазон, получаемый из указанных здесь значений. В других неограничивающих примерах доза также может составлять от приблизительно 1 микрограмм/кг веса тела, приблизительно 5 микрограмм/кг веса тела, приблизительно 10 микрограмм/кг веса тела, приблизительно 50 микрограмм/кг веса тела, приблизительно 100 микрограмм/кг веса тела, приблизительно 200 микрограмм/кг веса тела, приблизительно 350 микрограмм/кг веса тела, приблизительно 500 микрограмм/кг веса тела, приблизительно 1 милиграмм/кг веса тела, приблизительно 5 милиграмм/кг веса тела, приблизительно 10 милиграмм/кг веса тела, приблизительно 50 милиграмм/кг веса тела, приблизительно 100 милиграмм/кг веса тела, приблизительно 200 милиграмм/кг веса тела, приблизительно 350 милиграмм/кг веса тела, приблизительно 500 милиграмм/кг веса тела до приблизительно 1000 мг/кг веса тела или более на одно введение лекарства, и любой диапазон, получаемый из указанных здесь значений. В неограничивающих примерах диапазона, получаемого из перечисленных здесь значений, доза может быть введена в диапазоне от приблизительно 5 мг/кг веса тела до приблизительно 100 мг/кг веса тела, от приблизительно 5 микрограмм/кг веса тела до приблизительно 500 милиграмм/кг веса тела и т.д., на основании значений, описанных выше.

В любом случае композиция может включать в себя различные антиоксиданты для уменьшения окисления одного или более компонентов.

В воплощениях, где композиция представлена в жидкой форме, носитель может представлять собой растворитель или дисперсионную среду, содержащую без ограничения воду, этанол, полиол (например, глицерин, пропиленгликоль, жидкий полиэтиленгликоль и т.д.), липиды (например, триглицериды, растительные масла, липосомы) и их комбинации. Соответствующая текучесть может поддерживаться, например, с помощью применения покрытия, такого как лецитин, путем сохранения требуемого размера частиц с помощью рассеивания в носителях, таких как, например, жидкий полиол или липиды; с помощью применения сурфактантов, таких как, например, гидроксипропилцеллюлоза; или их комбинаций. Во многих случаях предпочтительно включать в состав изотонические агенты, такие как, например, сахара, хлорид натрия или их комбинации.

В других воплощениях настоящего изобретения можно применять глазные капли, назальные растворы или спреи, аэрозоли или ингаляторы. Указанные композиции обычно разрабатывают совместимыми с типом ткани-мишени. В неограничивающем примере назальные растворы в целом являются водными растворами, разработанными для введения в назальные проходы в каплях или в спреях. Назальные растворы готовят таким образом, что они являются сходными во многих отношениях с назальным секретом для того, чтобы сохранить нормальную работу цилиарного аппарата. Таким образом, в предпочтительных воплощениях водные назальные растворы обычно являются изотоническими или незначительно забуференными для поддержания значения pH от приблизительно 5,5 до приблизительно 6,5. Кроме того, антибактериальные консерванты, сходные с консервантами, применяемыми в глазных лекарственных препаратах, лекарства или соответствующие стабилизаторы лекарств, в случае необходимости, могут быть включены в композицию. Например, известны различные коммерческие назальные препараты, и они включают в себя лекарства, например антибиотики или антигистаминные средства.

В определенных воплощениях антитела готовят для введения через такие пути поступления, как пероральный прием внутрь. В указанных воплощениях твердая композиция может включать в себя, например, растворы, суспензии, эмульсии, таблетки, пилюли, капсулы (например, твердые или мягкие покрытые оболочкой желатиновые капсулы), композиции с замедленным высвобождением, буккальные композиции, пастилки, эликсиры, суспензии, сиропы, облатки или их комбинации. Пероральные композиции могут быть объединены непосредственно с едой пищевого рациона. Предпочтительные носители для перорального введения включают в себя инертные разбавители, легкоусвояемые съедобные носители или их комбинации. В других аспектах изобретения пероральная композиция может быть приготовлена в виде сиропа или эликсира. Сироп или эликсир может включать в себя, например, по меньшей мере один активный агент, подслащивающее вещество, консервант, ароматизатор, краситель или их комбинации.

В определенных предпочтительных воплощениях пероральная композиция может включать в себя одно или более связующих веществ, наполнителей, дезинтегрирующих агентов, смазывающих веществ, ароматизаторов и их комбинации. В определенных воплощениях композиция может включать в себя одно или более из ниже перечисленного: связующее вещество, такое как, например, трагакантовая камедь, акациевая камедь, кукурузный крахмал, желатин или их комбинации; эксципиент, такой как, например, дикальция фосфат, маннитол, лактоза, крахмал, стеарат магния, сахарин натрия, целлюлоза, карбонат магния или их комбинации; дезинтигрирующий агент, такой как, например, кукурузный крахмал, картофельный крахмал, альгиновая кислота или их комбинации; лубрикант, такой как, например, стеарат магния; подслащивающее вещество, такое как, например, сахароза, лактоза, сахарин или их комбинации; ароматизатор, такой как, например, мята перечная, винтергреневое масло, вишневый ароматизатор, апельсиновый ароматизатор, и т.д.; или комбинации перечисленного выше. Если стандартная лекарственная форма представляет собой капсулу, она может содержать, в дополнение к материалам вышеуказанного типа, носители, такие как липидный носитель. Различные другие материалы могут быть представлены в качестве покрытий или для модификации иным способом физической формы единицы дозирования. Например, таблетки, пилюли или капсулы могут быть покрыты шеллаком, сахаром или ими обоими.

Дополнительные композиции, которые подходят для способов введения, включают в себя суппозитории. Суппозитории представляют собой твердые дозированные лекарственные формы различного веса и формы, обычно пропитанные лекарственным средством, для введения в прямую кишку, влагалище или уретру. После введения суппозитории размягчаются, тают или растворяются в полостных жидкостях. В целом для суппозиториев, общепринятые носители могут включать в себя, например, полиалкиленгликоли, триглицериды или их комбинации. В определенных воплощениях суппозитории могут быть сформированы из смесей, содержащих, например, активный ингредиент в диапазоне от приблизительно 0,5% до приблизительно 10% и предпочтительно от приблизительно 1% до приблизительно 2%.

Композиция должна быть стабильной в условиях производства и хранения и должна быть защищена от контаминирующего действия, микроорганизмов, таких как бактерии и грибы. Следует понимать, что загрязнение эндотоксином следует поддерживать на минимально безопасном уровне, например меньше чем 0,5 нг/мг белка.

В конкретных воплощениях пролонгированная абсорбция инъецируемой композиции может быть осуществлена путем применения в композициях агентов, задерживающих абсорбцию, таких как, например, моностеарат алюминия, желатин или их комбинация.

E. Наборы

Любые композиции из описанных здесь могут быть включены в набор. Наборы, таким образом, будут включать в себя антитело и/или дополнительный агент настоящего изобретения в подходящем контейнерном устройстве. Авторы настоящего изобретения предусматривают другие компоненты, которые могут быть включены в набор. Терапевтические наборы настоящего изобретения включают в себя в подходящем контейнерном устройстве фармацевтически приемлемую композицию антитела в фармацевтически приемлемой композиции. Набор может иметь одно контейнерное устройство и/или может иметь отдельное контейнерное устройство для каждого соединения.

Если компоненты набора предоставлены в одном и/или более жидких растворах, жидкий раствор представляет собой водный раствор, стерильный водный раствор является особенно предпочтительным. Антитело также может быть включено в состав композиции, вводимой шприцом, и в этом случае как таковое может быть шприцом, пипеткой и/или другим подобным приспособлением, из которого композиция может быть нанесена на пораженную область тела, инъецирована животному и/или даже применена и/или смешана с другими компонентами набора.

Однако компоненты набора могут быть предоставлены в виде сухого порошка (порошков). Если реагенты и/или компоненты предоставлены в виде сухого порошка, порошок может быть растворен путем добавления подходящего растворителя. Предусматривается, что растворитель также может быть предоставлен в другом контейнерном устройстве.

Контейнерное устройство обычно включает в себя по меньшей мере один пузырек, пробирку, флакон, бутылку, шприц и/или другое контейнерное устройство, в которое помещают антитело/композицию антитела, предпочтительно, соответственно размещенную. Наборы также могут включать в себя второе контейнерное устройство, которое вмещает в себя стерильный, фармацевтически приемлемый буфер и/или другой дилюент.

Наборы настоящего изобретения также включают в себя устройства, чтобы содержать пузырьки в закрытой защитной оболочке для коммерческой продажи, такой как, например, инъекция и/или изготовленные выдувным формованием пластиковые контейнеры, внутри которых хранят желаемые пузырьки.

Независимо от числа и/или типа контейнеров, наборы изобретения также могут включать в себя и/или быть упакованы вместе со вспомогательным инструментом для инъекции/введения и/или размещения итогового антитела внутри тела животного. Такой инструмент может представлять собой шприц, пипетку, пинцет и/или любое подобное медицински утвержденное средство для доставки лекарства.

F. Примеры

Следующие примеры включены, чтобы продемонстрировать предпочтительные воплощения изобретения. Специалистам в данной области техники следует понимать, что способы, раскрытые в примерах, которые следуют далее, представляют собой техники, раскрытые автором изобретения для правильного функционирования изобретения на практике, и таким образом могут рассматриваться как представляющие собой предпочтительные способы осуществления изобретения на практике. Однако специалистам в данной области техники следует понимать в свете настоящего раскрытия, что многочисленные изменения могут быть внесены в конкретные воплощения, которые раскрыты, и при этом получен одинаковый или сходный результат без нарушения сущности и изобретения.

ПРИМЕР 1. Способы скрининга идентификации и применения человеческого MAb настоящего изобретения

Материалы. Человеческий протеин С, бычий тромбин получали, как описано (Esmon et al., 1993; включено в описание во всей полноте посредством ссылки).

Рекомбинантный APC (Xigris) получали от Eli Lilly. Spectroxyme PCa получали из American Diagnostica. 1-пальмитоил-2-олеоил-фосфатидилхолин (PC), 1-пальмитоил-2-олеолил-фосфатидилсерин (PS) и 1-пальмитоил-2-олеолил-фосфатидилэтаноламин (PE) получали из Avanti Polar Lipids, Inc. Эндотелиальные клетки человека линии EA.hy926 культивировали в среде DMEM (модифицированная по способу Дульбекко среда Игла), дополненной 10% эмбриональной телячьей сывороткой, L-глутамином и HAT (гипоксантин, аминоптерин, тимидин). Меченный флуоресцеином APC (FL-APC) получали с помощью набора для мечения белков Fluorescein-EX от Molecular Probes согласно инструкциям производителя. В указанных примерах "протеин C" без определения "активированный" относится к неактивированному протеину C.

Получение мышиных антител против протеина С человека и APC моноклональных антител. Мышиное моноклональное антитело (mAb) против человеческого протеина С или APC получали с помощью стандартных методик (Rezaie и Esmon, 1992).

Скрининг специфического mAb к протеину C или APC. Моноклональное антитело к человеческому протеину C mAb 1575 и 1580 (HPCl575 и HPCl580) получали путем скрининга блокирующей способности mAb при связывании FL-APC с клетками EA.hy926 с помощью анализа FACS. Кратко, клетки EA.hy926 инкубировали с 50 нМ FL-протеина C и 100 нМ различных моноклональных антител против протеина С в буфере HBSS (сбалансированный солевой раствор Хенкса), содержащем 0,5% BSA, 3 мМ CaCl₂ и 0,6 мМ MgCl₂, в течение 30 мин на льду и проводили анализ FACS. Антитело против человеческого APC, mAb1573 (HAPC1573) получали путем скрининга связывающей способности mAb с APC, но не с протеином C, с применением метода ELISA. Кратко, в 96-луночный планшет MaxiSorp (NUNC) наносили 5 мкг/мл различных mAb в буфере 15 мМ Na₂CO₃, 35 мМ NaHCO₃, pH 9,6, оставляли на ночь при 4°C. Планшет отмывали раствором TTBS (TBS, содержащий 0,05% Tween-20), содержащим 1 мМ CaC1₂ (TTBS-кальциевый буфер), блокировали 0,1% желатином в TBS (20 мМ Tris-HCl, 150 мМ NaCl, pH 7,5) в течение 1 часа, вновь отмывали TTBS-кальциевым буфером, инкубировали с 100 нг/мл протеина C или APC в TTBS-кальциевом буфере в течение 1 часа. После отмывки TTBS-кальциевым буфером планшет инкубировали с 2 мкг/мл биотинилированного HPC1580 в течение 1 часа, вновь отмывали TTBS-кальциевым буфером, инкубировали с 1 мкг/мл конъюгата стрептавидин-щелочная фосфатаза в TTBS-кальциевом буфере в течение одного часа. Абсорбцию в конечной точке при 405 нМ считывали с помощью микропланшетного ридера производства Vmax после заключительной отмывки TTBS-кальциевым буфером и добавления жидкого субстрата p-нитрофенил фосфат (Sigma).

Метод ELISA для определения APC в плазме крови. Метод модифицировали на основе ранее описанного метода ELISA для скрининга mAb против APC. Кратко, в планшет наносили 5 мкг/мл HAPC1573, блокировали TBS, содержащим 1X казеин (Vector Lab), и вновь отмывали TTBS-кальциевым буфером. Вносили рекомбинантный APC в концентрациях 0-8 нг/мл в TTBS, содержащем 10 мМ бензамидин, 1 мМ EDAT и 0,25X казеиновый буфер (буфер для разведения), или в разведении плазмой человека 1:4 и инкубировали образцы в планшете в течение одного часа. После отмывки TTBS-кальциевым буфером планшет инкубировали с 1 мкг/мл биотинилированного HPCl575 в TTBS, содержащем 10 мМ бензамидина, 5 мМ CaCl₂ и 0,25X казеиновый буфер, в течение одного часа. После отмывки TTBS-кальциевым буфером планшет инкубировали с 0,5 мкг/мл стрептавидина-HRP в TTBS, содержащем 10 мМ бензамидина, 5 мМ CaCl₂ и 0,25X казеиновый буфер, в течение одного часа, вновь отмывали TTBS-кальциевым буфером и проводили окрашивание с субстратом Ultra-TMB (Pierce). Определяли OD450 после добавления 0,5 M H₂SO₄ для остановки ферментативной реакции с пероксидазой хрена.

Влияние mAb на связывание FL-APC на эндотелии. Клетки EA.hy926 инкубировали с 50 нМ FL-APC в буфере HBSS, содержащем 0,5% BSA, 3 мМ CaCl₂ и 0,6 мМ MgCl₂, без и в присутствии HAPCl573 или HPCl575 в различных концентрациях в течение 30 мин на льду и проводили анализ FACS.

Влияние mAb на антикоагулянтную активность APC в анализе коагулирующей активности плазмы крови. Влияние mAb на антикоагулянтную активность APC в плазме крови определяли с помощью модифицированного одностадийного анализа коагулирования плазмы крови с фактором Xa с применением коагулометра ST4 (Diagnostica Stago). В стандартном анализе в нормальную человеческую пулированную плазму добавляли установленное количество X-CP, фактор X-активирующего фермента из яда гадюки Рассела, для получения 30-секундного времени свертывания в смеси фосфолипидных пузырьков (конечная концентрация 10 мкг/мл 40% PE, 20% PS и 40% PC, масс/об) и CaCl₂ (6,25 мМ) в TBS, содержащем 0,1% BSA. Коагуляцию инициировали добавлением CaCl₂. Перед добавлением CaCl₂ добавляли APC (конечная концентрация 200 нг/мл) или HAPC 1573 (конечная концентрация 20 мкг/мл).

Влияние mAb на амидолитическую активность APC по отношению к хромогенному субстрату. Амидолитическую активность 50 мкл 10 нМ APC в буфере HBSS (HBSS, содержащий 0,1% бычьего сывороточного альбумина, 3 мМ CaCl₂, 0,6 мМ MgCl₂) без или в присутствии 66,7 нМ HPC1555 или HAPC1573 определяли при добавлении 50 мкл 0-2 мМ Spectrozyme PCa, серийно разведенного в 50 мМ буфере HEPES, 100 мМ NaCl, pH 7,5.

Анализ цитотоксичности гистонов. Клетки EA.hy926 инкубировали с гистонами тимуса теленка H3 или H4 (Roche) без и в присутствии 100 нМ APC и 200 нМ HAPC1573 в среде Opti-MEM (Invitrogen) в течение 1 часа при 37°C и затем в течение 5 мин при комнатной температуре после добавления 10 мкг/мл иодида пропидия (PI). Клетки отмывали и отделяли с помощью EDTA/PBS и проводили анализ методом проточной цитометрии по PI-положительному окрашиванию.

ПРИМЕР 2. Результаты скрининга, идентификации и применения человеческого MAb настоящего изобретения

HAPC1573 усиливает связывание APC на эндотелии. Чтобы проверить имеет ли HAPC 1575 какое-либо влияние на APC-связывание на эндотелии, авторы изобретения инкубировали клетки EA.hy926 с FL-APC без и в присутствии HAPC1573 или HPC1575 и измеряли связывание FL-APC на клетках с помощью метода проточной цитометрии. Гистограмма данных анализа проточной цитометрии показала, что HAPC1573 усиливал связывание FL-APC на эндотелиальных клетках, тогда как HPC1575 ингибировал связывание FL-APC на клетках (ФИГ.2). HAPC1573 способствует интернализации APC на эндотелии. FL-APC мог быть интернализирован в клетки EA.hy926 за счет взаимодействия GIa-домена APC и EPCR на клетках, и указанная интернализация могла быть блокирована либо EPCR-блокирующим Ab (JRK1494), либо домен GIa-блокирующим Ab (HPCl575) (ФИГ.3). HAPCl573 могло способствовать интернализации FL-APC в клетки, и указанный эффект мог быть полностью блокирован EPCR-блокирующим Ab (ФИГ.3).

HAPC 1573 изменяет амидолитическую активность APC по отношению к хромогенному субстрату. Поскольку HAPC1573 распознавало APC на планшете в методе ELISA и на эндотелиальной клетке, авторы изобретения заинтересовались, может ли HAPC1573 воздействовать на амидолитическую активность APC по отношению к хромогенному субстрату. Синтетические пептидные субстраты обычно представляют собой небольшие молекулы с молекулярным весом несколько сотен дальтон, большинство антител против сериновых протеаз в плазме крови оказывают незначительный эффект на ферментативную активность указанных небольших субстратов. Однако HAPC1573 резко изменяло кинетические параметры APC для его хромогенного субстрата, Spectrozyme PCa (ФИГ.4). Значение km APC для Spectrozyme PCa составляло 15 нМ в присутствии HAPC1573, по сравнению с 270 нМ без Ab или в присутствии HPC1555. Значение kcat APC для Spectrozyme PCa составляло 18 в присутствии HAPC1573, по сравнению с 67 без Ab или в присутствии HPC1555. Данное выраженное изменение активности APC по отношению к небольшому пептидному субстрату в присутствии HAPC1573 показывает, что указанное mAb распознает эпитоп, расположенный рядом с активным центром APC, и взаимодействие Ab и антигена резко увеличивало афинность APC к небольшому пептидному субстрату, но снижало скорость диссоциации продукта из каталитического участка APC.

HAPC1573 блокирует антикоагулянтную активность APC в плазме крови. На ФИГ.5 показано, что HAPC1573 почти полностью уменьшает пролонгированное действие APC в анализе одностадийного коагулирования плазмы крови, инициированного фактором Ха, что позволяет предположить, что взаимодействие HAPC1573 и APC препятствует расщеплению APC фактора Va.

Влияние HAPC1573 на расщепление APC внеклеточных гистонов. Недавно авторы изобретения обнаружили, что APC может расщеплять внеклеточные гистоны и защищать эндотелий от цитотоксичности гистонов (рукописи готовятся к изданию). Поскольку HAPCl573 изменяло амидолитическую активность APC к хромогенному субстрату и блокировало антикоагулянтную активность APC в плазме крови, авторы изобретения заинтересовались, может ли mAb изменять APC-расщепление внеклеточных гистонов H3 и H4 и воздействовать на цитопротекцию APC на эндотелии против цитотоксичности гистонов H3 и H4. Как ни удивительно, HAPCl573 не ингибировало, а действительно усиливало расщепление APC гистонов H3 и H4 (ФИГ.6). Сообразно, HAPC1573 не ингибировало, но несколько усиливало цитопротективное действие APC на эндотелий против гистонов H3 и H4 (ФИГ. 7A-B).

ПРИМЕР 3. Обсуждение скрининга, идентификации и применения человеческого MAb настоящего изобретения

Протеин С активируется комплексом тромбина и тромбомодулина на поверхности эндотелия. В отличие от очень короткого времени полужизни активного тромбина in vivo, составляющего несколько секунд, человеческий APC имеет время полужизни примерно 20 минут после его образования в круге кровообращения (Berg, et al., 2003). Поэтому возможно на практике измерить уровень APC в плазме крови, чтобы изучить его регуляцию в различных патологических ситуациях.

Существующие способы измерения APC основаны на анализе захвата фермента, при котором применяют антитело, захватывающее APC, и затем измеряют активность с помощью хромогенных субстратов. Поскольку все антитела, применяемые в указанных анализах, распознают не только APC, но также его профермент, протеин C, и поскольку концентрация протеина C приблизительно в 1000 раз выше, чем концентрация APC при обычном кровообращении, измерения APC с применением указанных способов не являются клинически значимыми. Быстрый и надежный способ измерения APC востребован как для диагностики, так и для лечения. Результаты, представленные выше, показывают, что mAb, HAPC1573 распознает APC, но не протеин С, и демонстрирует создание удобного метода ELISA для измерения уровня APC в плазме крови in vivo. Обычно измерение указанным способом одного образца плазмы крови, содержащего 1 нг/мл APC, занимает менее 4 часов, по сравнению с 19 часами или даже неделями при измерении с помощью анализов на основе захвата фермента (Gruber and Griffen, 1992; Liaw et al., 2003).

Недавние исследования показали, что антикоагулянтная активность APC является необязательной для его цитопротективной функции, но расщепляющая активность APC относительно PARl может быть необходимой для его антиапоптотического действия (Mosnier et al., 2004). Однако цитопротективное действие APC было показано не только на эндотелиальных клетках, которые экспрессируют EPCR, но также и на других клетках, таких как нейрон и кератиноциты, которые не экспрессируют EPCR на своей клеточной поверхности (Guo et al., 2004; Berg et al., 2003), что указывает на возможность существования других механизмов кроме PARl-опосредованной сигнальной системы APC. HAPC1573 изменяло расщепляющую активность APC по отношению к хромогенному пептидному субстрату и также блокировало антикоагулянтную активность APC в анализе коагулирующей активности плазмы крови, что позволяет предположить, что данное mAb распознает эпитоп рядом с активным центром APC и изменяет его каталитическую активность при связывании антиген-антитело.

С другой стороны, HAPC1573 не ингибировал, но действительно усиливал расщепление APC внеклеточных гистонов и увеличивал цитопротективную активность APC на эндотелии против гистонов, что указывает, что антикоагулянтная активность APC в расщеплении активированных факторов V и VIII не требуется для его цитопротективной активности при расщеплении внеклеточных гистонов. Расщепление внеклеточных гистонов, независимое от антикоагулянтной активности, может быть одним из молекулярных механизмов APC-регуляции воспаления и цитопротекции.

Например, HAPC1573 может быть применено в лечении пациентов с гемофилией А. APC расщепляет фактор VIIIa и фактор Va и, таким образом, отрицательно регулирует свертывание крови. У пациентов с гемофилией А уровни фактора VIII являются низкими, и инактивация фактора Va с помощью APC является, вероятно, основным путем регулирования гемостаза и тромбообразования у таких пациентов. Недавние клинические отчеты показали, что лейденская мутация, при которой фактор V является устойчивым к APC-расщеплению, являлась благоприятной для пациентов с гемофилией A в отношении симптома кровотечения (van't Zant el. ah, 1997). Блокирование антикоагулянтной активности APC против фактора Va in vivo с помощью mAb, такого как HAPC1573, может быть альтернативным подходом в лечении гемофилии А, особенно у тех пациентов, которые имеют высокий уровень ингибиторов фактора VIII, при условии, что заместительная терапия фактора VIII на имела особого эффекта.

Другим возможным клиническим применением HAPC1573 является применение в лечении травматологических пациентов, у которых нарушен гемостаз, возможно обильное кровотечение, и хирургическое вмешательство откладывают для восстановления гемостатического статуса. Лечение HAPC1573 может селективно восстановить прокоагулянтное состояние без удаления цитопротективной или противовоспалительной активности активированного протеина C.

Другим возможным клиническим применением HAPC1573 является его сочетание с APC при лечении сепсиса. В настоящее время APC является единственным утвержденным FDA лекарственным препаратом для лечения тяжелого сепсиса. Его побочный эффект в виде кровотечения у пациентов обусловлен антикоагулянтной активностью APC. HAPC1573 блокировало антикоагулянтную активность APC и в то же время сохраняло и даже усиливало цитопротективное действие APC. Указанный комплекс mAb-APC может быть лучшим лекарством, чем применяемый отдельно APC, принимая во внимание его побочный эффект, кровотечение.

ПРИМЕР 4. Способы скрининга и применения мышиного моноклонального антитела настоящего изобретения

Материалы и методы. Рекомбинантный мышиный протеин C, APC, крысиное mAb MPC1609 и MAPC1591 получали в лаборатории в соответствии со стандартными методиками. Меченный флуоресцеином APC (FL-APC) получали с применением набора для мечения белков Fluorescein-EX от Molecular Probes в соответствии с инструкциями производителя.

Исследование на животных. Самцов мышей породы BL6 в возрасте 6-12 недель использовали в настоящем исследовании в соответствии с протоколом, утвержденным комитетом по институциональному уходу за животными и их использованию Фонда медицинских исследований Оклахомы.

Клеточная культура. Клетки bEnd3 (линия эндотелиальных клеток головного мозга мыши) культивировали в среде DMEM (модифицированная по способу Дульбекко среда Игла), дополненной 10% эмбриональной телячьей сывороткой и L-глутамином. Клетки EA.hy926 (линия эндотелиальных клеток человека) культивировали в среде DMEM, дополненной 10% фетальной бычьей сыворотки, L- глутамином и HAT (гипоксантин, аминоптерин, тимидин).

Связывание FL-APC и активация протеина С на эндотелии. Клетки bEnd3 инкубировали с 100 нМ FL-APC в буфере HBSS, содержащем 0,5% BSA, 3 мМ CaCl₂ и 0,6 мМ MgCl₂ без или в присутствии 125 нМ MPC1609 или MAPC1591 в течение 15 мин на льду и проводили анализ методом FACS.

Влияние mAb на активацию протеина С на эндотелиальных клетках. Клетки bEnd3 в 24-луночном планшете отмывали однократно буфером HBSS (HBSS, содержащий 0,1% бычьего сывороточного альбумина, 3 мМ CaCl₂, 0,6 мМ MgC1₂) и преинкубировали в течение 5 мин с буфером HBSS, содержащем 0,1 мкМ протеина C и 0,1 мкМ MPC1609 или MAPC1591. Реакции активации инициировали добавлением 5 нМ бычьего тромбина в общем объеме 0,2 мл. Реакции проводили 15 мин при 37°C, останавливали добавлением 50 мкл бычьего антитромбина III (1,67 мг/мл). Пятьдесят мкл супернатантов переносили в 96-луночный микропланшет и определяли показатель активации протеина C с помощью планшетного ридера Vmax при 405 нМ с 50 мкл субстрата 0,4 мМ Spectrozyme PCa в буфере 100 мМ NaCl, 50 мМ HEPES-NaOH, pH 7,5.

Анализ антикоагулянтной активности APC. Влияние mAb на антикоагулянтную активность APC в плазме крови определяли с помощью модифицированного анализа одностадийного коагулирования плазмы крови с фактором Xa с применением коагулометра ST4 (Diagnostica Stago). В данном анализе в плазму (50% мышиной плазмы и 50% человеческой нормальной пулированной плазмы) добавляли установленное количество X-CP, фактор X-активирующего фермента из яда гадюки Рассела для получения 30-секундного времени свертывания в смеси фосфолипидных везикул (конечная концентрация 10 мкг/мл 40% фосфатидилэтаноламина, 20% фосфатидилсерина и 40% фосфатидилхолина, мас./об.) и CaCl₂ (6,35 нМ) в буфере 20 мМ Tris-HCl, 150 мМ NaCl (pH 7,5), содержащем 0,1% BSA. Коагулирование инициировали добавлением CaCl₂. APC (конечная концентрация 200 нг/мл) и MPC1609 (конечная концентрация 5 мкг/мл) или MAPCl591 (конечная концентрация 5 мкг/мл) вносили перед добавлением CaCl₂.

Анализ цитотоксичности гистонов. Клетки EA.hy926 инкубировали с 50 мкг/мл гистонов тимуса теленка (Sigma) без или в присутствии 100 нМ APC и 200 нМ MAPCl 591 в среде Opti-MEM (Invitrogen) в течение 1 часа при 37°C и затем в течение 5 мин при комнатной температуре после добавления 10 мкг/мл иодида пропидия (PI). Клетки отмывали и отделяли с помощью 0,526 мМ EDTA в PBS и проводили анализ методом проточной цитометрии по PI-положительному окрашиванию.

Анализ IL-6, мочевины и креатинина. В сыворотке мышей определяли концентрацию мочевины и креатинина с помощью биохимического анализатора Vitros 250 (Ortho-Clinical Diagnostics). Уровень сывороточного IL-6 измеряли с помощью набора Quantikine для проведения колориметрического сэндвич-варианта метода ELISA (R&D Systems).

ПРИМЕР 5. Результаты скрининга и применения мышиного моноклонального антитела настоящего изобретения

MPC1609 было направлено против протеина C и APC и могло ингибировать связывание протеина C и APC на эндотелии (ФИГ.8A и данные не показаны). MAPC1591 было направлено против APC, но не против протеина C, и могло усиливать связывание APC на эндотелии (ФИГ.8A и данные не показаны). Активация протеина C на эндотелии резко снижалась в присутствии MPC1609 (ФИГ.8B). MAPC1591 также отчасти уменьшало активацию протеина С, вероятно в результате усиления им связывания APC на клетках (ФИГ.8B). Оба антитела MPC1609 и MAPC1591 могли полностью ингибировать антикоагулянтную активность APC в анализе коагулирующей активности плазмы крови (ФИГ.8C). На основании указанных исследований in vitro авторы изобретения пришли к заключению, что MPC1609 ингибировал связывание протеина C и APC на эндотелии или с фосфолипидом путем маскировки Gla-домена протеина C или APC, который ответственен за связывание протеина C или APC на эндотелии или с фосфолипидом. MAPC1591 распознавало APC, но не протеин C путем взаимодействия с эпитопом, расположенным рядом с активным центром APC, и указанное взаимодействие ингибировало антикоагулянтную активность APC, вероятно, путем предотвращения расщепления APC фактора Va.

Для изучения молекулярного механизма защитного действия APC при LPS-индуцированном септическом шоке авторы изобретения вводили мышам инъекцию сублетальной дозы LPS с MPC1609 или MAPC1591, и они обнаружили, что мыши, которым вводили LPS и MPC1609, погибли в течение 48 часов, мыши, которым вводили LPS и MAPC1591, выжили (ФИГ.9). Через 18 часов после инфузии у мышей, которым ввели LPS и MPC1609, наблюдали симптомы тяжелого септического шока, включая низкую температуру тела, высокое содержание нейтрофилов и низкое содержание лимфоцитов и тромбоцитов в периферической крови (ФИГ.10A и данные не показаны). Сывороточный уровень IL-6 был очень высоким у данных мышей (ФИГ.10B), но не наблюдали существенной разницы в уровнях мРНК IL-6 в сердце, легких, печени, селезенке, тимусе и периферической крови у данных мышей и мышей, получавших инъекцию LPS и MAPC1591 (данные не показаны), что позволяет предположить, что синтез IL-6 de novo может быть неглавной причиной устойчивого повышенного уровня IL-6 при септическом шоке у мышей. Сывороточные уровни мочевины и креатинина у мышей, получивших LPS и MPC1609, были выше, чем у других мышей (ФИГ.10C-D), что указывает на острую почечную недостаточность у данных мышей, которая может способствовать низкому клиренсу IL-6. Интересно, что уровни мочевины и креатинина у мышей, получивших инъекцию LPS и MAPC1591, были даже ниже, чем указанные уровни у мышей, которым ввели только LPS (ФИГ.10C), что позволяет предположить, что комплекс MAPC1591 и APC может быть более эффективным, чем APC для защиты почек in vivo эксперименте с LPS.

Внеклеточные гистоны были обнаружены на активированных нейтрофилах и макрофагах и на апоптотических клетках (Brinkmann et al., 2004; Radic et al., 2004), и они являлись цитотоксическими для клеток млекопитающих (Abakushin et al., 1999; Currie et al., 1997; Kleine et al., 1997). APC мог расщеплять гистон H3 и гистон H4, и MAPC1591 не ингибировало, но действительно усиливало расщепление APC указанных гистонов (ФИГ.10A). APC мог уменьшать цитотоксичность гистонов в отношении эндотелия, и MAPC1591 могло усиливать указанную цитопротективную активность APC (ФИГ.11B). Внеклеточный гистон в действительности обнаруживали в септической мышиной сыворотке после введения инъекции LPS и MPC1609, но не обнаруживали у мышей, которым вводили инъекцию LPS или LPS и MAPC1591 (ФИГ.11C), что указывает на корреляцию in vivo между недостаточной активацией протеина С, присутствием внеклеточного гистона в кровообращении и летальность мышей при септическом шоке. Принимая во внимание данные, полученные in vitro, и результаты, полученные in vivo, авторы изобретения смогли отделить цитопротективную активность APC от его антикоагулянтной активности с помощью MAPC1591, и расщепление цитотоксических гистонов APC независимо от его антикоагулянтной активности дает новый молекулярный механизм действия APC, предотвращающий у мышей развитие LPS-индуцированного септического шока.

ПРИМЕР 6. Обсуждение скрининга и применения мышиного моноклонального антитела настоящего изобретения

Путь обмена протеина С играет важную роль в регулировании свертывания крови и воспаления (Esmon, 2006). Показано, что человеческий APC существенно снижает смертность при тяжелом сепсисе, и APC был утвержден в качестве первого лекарственного препарата при лечении тяжелого сепсиса (Bernard et al., 2001). Однако молекулярный механизм протективных эффектов APC при сепсисе еще плохо изучен. Исследование мутагенеза показало, что антикоагулянтная активность APC была, по-видимому, несущественна для антиапоптотического действия APC на эндотелиальные клетки (Mosnier et al., 2004), и противовоспалительные и антиапоптотические эффекты сигнальной системы APC были опосредованы активируемым протеазой рецептором 1 (PAR-1) в эндотелиальных клетках (Reiwald et al., 2002). Однако мыши, дефицитные по PAR-1, имели сходный фенотип с контрольными мышами дикого типа при проведении эксперимента с LPS, что позволяет предположить, что PAR-1 может быть не главным участником для APC в регуляции воспаления и цитопротекции in vivo (Pawlinski et al., 2004; Camerer 2006). Принимая во внимание центральную роль APC в регулировании патофизиологических функций in vivo, авторы изобретения разработали два mAb против мышиного протеина C и мышиного APC и использовали указанные два mAb, чтобы исследовать слабо изученные механизмы протективного эффекта APC при LPS-вызванном септическом шоком у мышей.

Все композиции и/или способы, раскрытые в описании и включенные в пункты формулы изобретения, могут быть произведены и осуществлены без проведения специальных экспериментов в свете настоящего раскрытия. Несмотря на то, что композиции и способы настоящего изобретения описаны на примере предпочтительных воплощений, специалистам в данной области техники должно быть очевидно, что могут быть внесены изменения в композиции и/или способы и в стадии или в последовательность стадий способа, описанного здесь без нарушения концепции, сущности и объема изобретения. Более подробно, очевидно, что определенные агенты, которые являются химически и физиологически родственными, могут быть замещены агентами, описанными здесь, в то время как могут быть получены аналогичные или похожие результаты. Подразумевается, что все подобные похожие заменители и модификации, очевидные для специалистов в данной области техники, находятся в пределах сущности, объема и концепции изобретения, как определено прилагаемой формулой изобретения.

Ссылки

Ссылки, упомянутые на всем протяжении данной заявки, включая следующие ссылки, в тех случаях, когда они предоставляют типичные методические или другие детали дополнительно к деталям, изложенным в настоящем документе, специально включены здесь посредством ссылки.

U.S. Patent 4,196,265.

Abakushin et al., Biochemistry (Mosc), 64:693-698, 1999.

Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York, 1988.

Beidler et al., J. Immunol, 141:4053-4060, 1988.

Berg et al., Proc. Natl. Acad. Set USA, 100:4423-4428, 2003.

Bernard et al., New England J. Medicine, 344:699-709, 2001.

Better et al., Science, 240:1041-1043, 1988.

Brinkmann, Science, 203:1532-1535, 2004.

Camerer, Blood, 107:3912-3921, 2006.

Currie et al., Biochim. Biophys. Acta, 1355:248-258, 1997.

EP Appln. 125,023.

EP Appln. 171,496.

EP Appln. 173,494.

EP Appln. 184,187.

Esmon, In: Natural anticoagulants and their pathways, Handbook of Exper. Pharm., 132:447-476, Born et al. (Eds.), Springer-Verlag, NY, 1999.

Esmon, J. Biol. Chem., 264; 4743- 4746, 1989.

Esmon, Proteolytic Enzymes in Coagulation, Fibrinolysis, and Complement Activation, Part A, 222:359-385, 1993.

Esmon, Semin. Thromb. Hemost., 32 Suppl 1:49-60, 2006.

Gruber and Griffin, Blood, 79:2340-2348, 1992.

Guo et al., Neuron., 41:563-572, 2004.

Jones et al., Nature, 321:552-525, 1986.

Kleine et al., Am. J. Physiol 273:C1925-C1936, 1997.

Liaw et al., J. Thrombosis and Haemostasis, 1:662-670, 2003.

Liu et al., J. Immunol, 139:3521-3526, 1987.

Liu et al., Proc. Natl Acad Sci. USA, 84:3439-3443, 1987.

Morrison, Science, 229:1202-1207, 1985.

Mosnier et al., Blood, 104:1740-1744, 2004.

Nishimura et al., Canc. Res., 47:999-1005, 1987.

Oi et al., BioTechniques, 4:214, 1986.

Pawlinski et al., Blood, 103:1342-1347, 2004.

PCT Appln. PCT/U.S.86/02269.

PCT Appln. WO 86/01533.

Radic et al., J. Immunol., 172:6692-6700, 2004.

Remington's Pharmaceutical Sciences, 18^th Ed., Mack Printing Company, 1289-1329,10 1990.

Remington's Pharmaceutical Sciences, 15^th Ed., 1035-1038 and 1570-1580, 1990.

Rezaie and Esmon, J. Biol. Chem., 267:26104-26109, 1992.

Riewald et al., Science, 296:1880-1882, 2002.

Shaw et al., J. Natl. Cancer Inst., 80:1553-1559, 1988.

Sun et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:214-218, 1987.

van't Zant et al., Blood, 90(8):3067-3072, 1997.

Verhoeyan et al., Science, 239:1534, 1988.

Wood et al., Nature, 314:446-449, 1985.

Изобретение относится к области иммунологии и биотехнологии. Представлено моноклональное антитело или его функциональный фрагмент, где указанные антитело и фрагмент связываются с активированным протеином С и ингибируют антикоагулянтную активность, но не связываются и не ингибируют активацию неактивированного протеина С, где указанное антитело получают иммунизацией млекопитающего APC и скринингом связывающей способности указанного антитела с APC, но не с протеином С. Также описана фармацевтическая композиция для лечения заболеваний, связанных с антикоагулянтной активностью APC, включающая указанное антитело в эффективном количестве и фармацевтически приемлемый носитель. Предложены: способ ингибирования антикоагулянтной активности активированного протеина С у субъекта; способ ингибирования амидолитической активности активированного протеина С у субъекта; способ лечения субъекта, который нуждается в коагуляции крови; способ лечения субъекта с гемофилией; способ модулирования гемостаза у субъекта; а также способ модулирования тромбообразования у субъекта, которые включают введение эффективного количества указанного антитела субъекту. Кроме того, описан способ лечения субъекта с сепсисом, включающий введение эффективного количества указанного антитела и активированного протеина С. Изобретение позволяет получить моноклональное антитело или его функциональный фрагмент, где указанные антитело и фрагмент связываются с активированным протеином С и ингибируют антикоагулянтную активность, но не связываются и не ингибируют активацию неактивированного протеина С. 9 н. и 8 з.п. ф-лы, 11 ил., 6 пр.

1. Моноклональное антитело или его функциональный фрагмент, где указанные антитело и фрагмент связываются с активированным протеином С и ингибируют антикоагулянтную активность, но не связываются и не ингибируют активацию неактивированного протеина С, где указанное антитело получают иммунизацией млекопитающего APC и скринингом связывающей способности указанного антитела с APC, но не с протеином С.

2. Моноклональное антитело по п.1, где указанное связывание с активированным протеином С происходит в активном центре активированного протеина С и не ингибирует цитопротективных эффектов активированного протеина С.

3. Моноклональное антитело по п.1, где указанное ингибирование активированного или неактивированного протеина С происходит in vivo.

4. Моноклональное антитело по п.1, где указанное ингибирование активированного или неактивированного протеина С происходит in vitro.

5. Моноклональное антитело по п.1, где антитело является антителом мыши.

6. Моноклональное антитело по п.1, где антитело является антителом человека.

7. Моноклональное антитело по п.1, где фрагмент антитела дополнительно определен как Fab', Fab, F(ab')2, однодоменное антитело, Fv или scFv.

8. Фармацевтическая композиция для лечения заболеваний, связанных с антикоагулянтной активностью APC, включающая антитело по п.1 в эффективном количестве и фармацевтически приемлемый носитель.

9. Способ ингибирования антикоагулянтной активности активированного протеина С у субъекта, включающий введение эффективного количества моноклонального антитела по п.1 указанному субъекту.

10.Способ по п.9, где цитопротективные эффекты активированного протеина С не снижены под влиянием указанного моноклонального антитела.

11. Способ ингибирования амидолитической активности активированного протеина С у субъекта, включающий введение эффективного количества антитела по п.1 указанному субъекту.

12. Способ лечения субъекта, который нуждается в коагуляции крови, включающий введение указанному субъекту эффективного количества антитела по п.1.

13. Способ лечения субъекта с сепсисом, включающий введение эффективного количества антитела по п.1 и активированного протеина С.

14. Способ лечения субъекта с гемофилией, включающий введение эффективного количества антитела по п.1.

15. Способ модулирования гемостаза у субъекта, включающий введение эффективного количества антитела по п.1.

16. Способ по п.15, где субъект представляет собой травматологического пациента.

17. Способ модулирования тромбообразования у субъекта, включающий введение эффективного количества антитела по п.1.