СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АГРЕГАЦИИ ТРОМБОЦИТОВ В ПЛАЗМЕ КРОВИ И ВРЕМЕНИ ЕЕ КОАГУЛЯЦИИ Российский патент 2008 года по МПК G01N33/49 

Изобретение относится к медицине, а именно к способам исследования крови. В медицине существует большая потребность в способах анализа функциональной активности тромбоцитов и коагуляционной способности плазмы крови. Активация тромбоцитов, приводящая к их агрегации, и свертывание плазмы крови определяют внутрисосудистое тромбообразование при многих сердечно-сосудистых заболеваниях. Агрегацию тромбоцитов и свертывание крови необходимо исследовать при разработке лекарств антиагрегантного и антикоагулянтного типа действия в целях профилактики и лечения опосредованных тромбоцитами тромбозов, при разработке способов диагностики тромботических состояний. Способность тромбоцитов к агрегации необходимо также контролировать при консервировании и хранении тромбоцитарной массы, предназначенной для борьбы с кровотечениями. Широко распространено лабораторное исследование смеси тромбоцитов и плазмы крови и, в особенности, суспензии, называемой богатой тромбоцитами плазмой, которую получают путем удаления из крови эритроцитов и лейкоцитов. Существуют способы, позволяющие раздельно исследовать либо агрегацию тромбоцитов, либо процесс коагуляции плазмы крови.

Известен оптический турбидиметрический способ исследования агрегации тромбоцитов (Born, G.V.P. Aggregation of blood platelets by adenosine diphosphate and its reversal. "Nature", 1962. о.194, о.4832, pp.927-929), который заключается в том, что на богатую тромбоцитами плазму крови направляют пучок света, измеряют интенсивность пучка света, прошедшего через исследуемый образец. Способность тромбоцитов к агрегации оценивают по величине увеличения интенсивности этого прошедшего света.

Известен также способ анализа агрегации тромбоцитов, описанный в заявке РСТ 89/10562. Способ заключается в том, что через суспензию тромбоцитов пропускают пучок света, измеряют интенсивность прошедшего света и параметры ее флуктуации, возникающих при перемешивании образца тромбоцитов, на основании этих параметров определяют средний размер агрегатов.

Указанные способы не предусматривают измерение коагуляционной способности исследуемого образца.

Имеется изобретение (патент GB 1325730, заявитель TECHNICON INSTRUMENS CORP), которое предлагает оптический способ определения времени коагуляции (свертывания) жидкостей, включая кровь. Способ заключается в том, что исследуемый образец смешивают с коагулирующим агентом и опаковыми магнитными частицами, смесь перемешивают магнитной мешалкой, направляют на образец пучок света и регистрируют момент изменения мутности, которое происходит при коагуляции. Этот способ не включает измерение агрегационной способности тромбоцитов.

Задача изобретения состояла в создании простого оптического способа, предназначенного для одновременного исследования агрегации тромбоцитов и времени коагуляции плазмы в образце, представляющем собой смесь тромбоцитов и плазмы крови. Одновременное исследование агрегации тромбоцитов и времени коагуляции плазмы на одном и том же образце позволяет более точно и эффективно оценивать способность крови к коагуляции.

Эта задача решается тем, что смесь тромбоцитов и плазмы крови постоянно перемешивают, пропускают через нее параллельный пучок света, выделяют пучок света, прошедшего через образец в определенном направлении, добавляют агент, вызывающий агрегацию клеток и свертывание плазмы, измеряют параметры выделенного пучка света. Одним из измеряемых параметров является интенсивность пучка света, прошедшего через образец с отклонением от первоначального направления распространения в интервале малых углов, входящих в диапазон от 0,5 до 10 градусов. Агрегационную способность тромбоцитов устанавливают по величине, на которую возрастает интенсивность выделенного пучка света до того, как произойдет коагуляция плазмы. Это достигается за счет того оптического явления, что образование небольших тромбоцитарных агрегатов вызывает увеличение интенсивности света, изменившего направление распространения в результате рассеяния и распространяющегося под малыми углами. Другой параметр представляет собой зависимость от времени стандартного отклонения (его синонимом является среднее квадратическое отклонение) интенсивности прошедшего через образец пучка света от ее средней величины. Непрерывно, с частотой не менее 10 Гц, фиксируют интенсивность какого-либо пучка света, прошедшего через смесь тромбоцитов и плазмы крови. Каждое значение стандартного отклонения и соответствующие ему величины интенсивности света определяют в пределах ограниченного периода, зависимость от времени стандартного отклонения получают путем последовательного смещения по времени такого периода на одно или более измерений величины интенсивности света. Время коагуляции плазмы крови устанавливают по промежутку времени с момента введения в нее коагулянта до момента наибольшего значения стандартного отклонения. Это значение стандартного отклонения достигается вследствие скачка интенсивности прошедшего света в момент коагуляции плазмы, в который прекращается перемешивание как результат остановки мешалки. Измерение стандартного отклонения по сравнению с регистрацией изменения интенсивности света обладает тем преимуществом, что оно отражает скорость изменения интенсивности, является объективным параметром. Наибольшее значение стандартного отклонения достигается в момент перегиба временной зависимости интенсивности прошедшего света.

На фиг.1 дана схема использованного аппарата для выделения пучков света, прошедших через исследуемый образец; на фиг.2 - иллюстрация временной зависимости интенсивности пучка света, прошедшего через образец богатой тромбоцитами плазмы крови кролика с отклонением в пределах 0,5-10 градусов; на фиг.3 - иллюстрация временной зависимости интенсивности пучка света, прошедшего через образец богатой тромбоцитами плазмы крови кролика без отклонения от первоначального направления распространения и иллюстрация временной зависимости стандартного отклонения интенсивности прошедшего пучка света; на фиг.4 - зависимость интенсивности пучка света, прошедшего через образец богатой тромбоцитами плазмы крови человека с отклонением в пределах 0,5-10 градусов, и зависимость от времени стандартного отклонения интенсивности этого пучка света; на фиг.5 - зависимость интенсивности пучка света, прошедшего через образец с отклонением в пределах 0,5-10 градусов, в случае богатой тромбоцитами плазмы крови человека с добавкой гепарина и без него и зависимость от времени стандартного отклонения интенсивности этого пучка света.

Осуществление предлагаемого способа одновременного исследования агрегации тромбоцитов и времени коагуляции плазмы крови подтверждается следующими примерами.

Пример 1

Кровь кролика из краевой вены уха, стабилизированную цитратом натрия (9:1 по объему), разливали в пластиковые пробирки и центрифугировали при 460 g в течение 15 минут при комнатной температуре. Полученный супернатант, представляющий собой богатую тромбоцитами плазму крови, использовали для одновременного исследования процессов агрегации тромбоцитов и коагуляции плазмы. Агрегацию тромбоцитов и коагуляцию плазмы стимулировали введением в образцы коллагена в конечной концентрации 10 мкг/мл и ионов кальция в конечной концентрации 12 мМ. Момент введения этих реагентов служил точкой отсчета начала агрегации тромбоцитов и коагуляции плазмы. Для сравнения коагуляцию исследуемого образца фиксировали также визуально, при этом временем ее окончания служил момент остановки вращения мешалки. Время коагуляции исследуемого образца составляло 154 секунды.

В данном примере использовали два пучка света, один из которых проходит через исследуемый образец без отклонения от первоначального направления распространения, а другой проходит с отклонением. Измерения интенсивностей двух пучков света проводили на кинетическом нефелометре (Рощупкин Д.И., Соколов А.Ю. Патент РФ №2067764), который имеет два канала и позволяет получать зависимость от времени (t) интенсивностей рассеянного света (нефелометрия) и света, прошедшего без изменения направления распространения (турбидиметрия). Схема аппарата представлена на фиг.1. Исследуемый образец богатой тромбоцитами плазмы крови в объеме 1 мл помещали в пластиковую кювету толщиной 0,3 см (2), перемешивание образца осуществляли с помощью магнитной мешалки (3). На образец направляли пучок излучения гелий-неонового лазера (1) с длиной волны 631,8 нм. В канале для измерения интенсивности света, прошедшего через образец с отклонением от исходного направления распространения, выделяется пучок, который проходит в окрестности вокруг отражательного зеркала (4) и попадает на собирательную линзу (5). Эта линза направляет свет на детектор (фототранзистор) (6) для измерения интенсивности. Прямой пучок света, т.е. прошедший через образец без изменения направления распространения, попадает на круглое отражательное зеркало (4), которое направляет его на второй детектор (фототранзистор) (7). Электрические сигналы фотодетекторов, пропорциональные интенсивности света, непрерывно поступали в компьютер с аналогово-цифровым преобразователем (плата ЛА-70) (8) и обрабатывали с помощью специального программного обеспечения. Отсчет интенсивности света в обоих каналах (I) проводили с частотой 10 Гц, т.е. через 0,1 с. Стандартное отклонение (σ) для центра данного периода определяли по обычной формуле для этого параметра

В этой формуле n обозначает количество измерений интенсивностей данного пучка света, оно было равно 40 за период 4 секунды. Нижний индекс j обозначает текущее значение интенсивности. Зависимость от времени получали, смещая период на 1 измерение (0,1 с).

После стимуляции образца интенсивность света, прошедшего через образец с отклонением от первоначального направления распространения, увеличивалась в начальный временной интервал до 44 секунд, когда коагуляция еще не происходила (фиг.2). Величина, на которую увеличивается интенсивность света, служит мерой агрегационной способности тромбоцитов. В более поздний период на временной зависимости обнаруживается резкий скачок, обозначенный стрелкой. Параллельно на временной зависимости интенсивности прямого пучка света (фиг.3, кривая 1) и ее стандартного отклонения (фиг.3, кривая 2) регистрируется резкий скачок. Период от момента стимуляции до этого скачка стандартного отклонения составляет 154 секунды, практически совпадает с величиной времени коагуляции, определяемой визуально. Таким образом, для одновременного анализа агрегационной способности тромбоцитов и времени свертывания плазмы в богатой тромбоцитами плазме крови допустимо одновременное измерение интенсивности света, прошедшего через образец с отклонением, и определение момента скачка стандартного отклонения интенсивности прямого пучка света.

Пример 2

Кровь человека, взятую из локтевой вены здорового донора, стабилизировали цитратом натрия (9:1 по объему), разливали в пластиковые пробирки и центрифугировали при 460 g в течение 12 минут при комнатной температуре. Полученный супернатант, представляющий собой богатую тромбоцитами плазму крови, использовали для одновременного исследования процессов агрегации тромбоцитов и коагуляции плазмы. Процедура стимуляции образца и используемый аппарат описаны в примере 1. Время коагуляции, определяемое визуально, составляло 273 секунды. В данном примере использовали один пучок света, проходящий через исследуемый образец с отклонением от первоначального направления распространения.

Как и в предыдущем примере, после стимуляции образца интенсивность света возрастала в начальный период (0-200 с). Это отражает агрегацию тромбоцитов (фиг.4, кривая 1). Позднее интенсивность отклоненного пучка света скачкообразно падает (фиг.4, кривая 1) и на временной зависимости ее стандартного отклонения (фиг.4, кривая 2) возникает резкий скачок (этот момент обозначен стрелкой). Время от момента стимуляции до этого скачка стандартного отклонения есть время коагуляции. Действительно, оно составляет 269 секунд, близко к величине времени коагуляции, определяемой визуально. Таким образом, для одновременного анализа агрегационной способности тромбоцитов и времени свертывания плазмы в богатой тромбоцитами плазме крови удобно измерение интенсивности света, прошедшего через образец с отклонением, в сочетании с определением момента скачка стандартного отклонения для интенсивности прямого пучка света.

Пример 3

Получали богатую тромбоцитами плазму крови человека, как это описано в примере 2. Анализировали параметры пучка света, прошедшего через образец с отклонением от первоначального направления, на описанном в примере 1 аппарате. Процедуры стимуляции образца и измерения параметров пучка света описаны в примере 2. Измерения параметров пучка света проводили два раза: в присутствии антикоагулянта гепарина, введенного в образец до его стимуляции в конечной концентрации 0,1 МЕ/мл и без антикоагулянта. Время коагуляции при ее визуальном определении в присутствии гепарина было равно 565 секунд и, как это должно быть, оно почти в 2 раза больше времени коагуляции образца без антикоагулянта, составившее 283 секунды. В обоих случаях в начальный промежуток времени после стимуляции (фиг.5, кривые 1 и 2) имело место увеличение интенсивности пучка света за счет агрегации тромбоцитов. Период до скачка (момент скачка обозначен стрелкой) стандартного отклонения в присутствии гепарина (фиг.5, кривая 4) достигал 570 секунд, превышал тот же параметр, равный 283 секунды, в отсутствие гепарина (фиг.5, кривая 3) в 2 раза. Таким образом, предлагаемый способ позволяет проводить анализ веществ на их способность оказывать антиагрегационный или антикоагулянтный эффекты.

Изобретение относится к медицине, а именно к способам исследования крови, к анализу функциональной активности тромбоцитов и коагуляционной способности плазмы крови. Предложен оптический способ одновременного исследования агрегации тромбоцитов и времени коагуляции плазмы. Для осуществления способа смесь тромбоцитов и плазмы крови постоянно перемешивают, пропускают через нее параллельный пучок света, выделяют пучок света, прошедшего через образец в определенном направлении, добавляют агент, вызывающий агрегацию клеток и свертывание плазмы, измеряют параметры выделенного пучка света. Одновременное исследование агрегации тромбоцитов и времени коагуляции плазмы на одном и том же образце позволяет более точно и эффективно оценивать способность крови к коагуляции. 4 ил.

Способ одновременного исследования агрегации тромбоцитов и времени коагуляции плазмы крови, заключающийся в том, что образец смеси тромбоцитов и плазмы крови непрерывно перемешивают, направляют на него параллельный пучок света, стимулируют агрегацию тромбоцитов и коагуляцию плазмы, выделяют пучок света, прошедший через образец с отклонением от первоначального направления распространения в интервале углов отклонения от 0,5 до 10°, определяют интенсивность этого пучка света и по ее величине определяют агрегационную способность тромбоцитов, измеряют зависимость от времени стандартного отклонения интенсивности прошедшего через образец пучка света от ее средней величины, при этом каждое значение стандартного отклонения и соответствующие ему величины интенсивности света определяют в пределах ограниченного периода, а зависимость от времени стандартного отклонения получают путем последовательного смещения такого периода на одно или более измерений величины интенсивности света, определяют время коагуляции плазмы как разницу между моментом резкого увеличения стандартного отклонения интенсивности прошедшего света и моментом стимуляции тромбоцитов и плазмы крови.