СПОСОБ ПРОФИЛАКТИКИ БОЛЕЗНИ НЬЮКАСЛА Российский патент 2010 года по МПК A61K39/17 

Изобретение относится к ветеринарии, точнее к ветеринарной иммунологии и вирусологии, в частности к способам иммунизации домашней птицы, преимущественно кур, против болезни Ньюкасла.

Болезнь Ньюкасла (псевдочума птиц) это наиболее распространенная высококонтагиозная вирусная инфекция домашней птицы, наносящая птицеводству огромный экономический ущерб. Для предотвращения этой болезни используются различные профилактические воздействия.

В частности, для указанной цели используют различные лекарственные средства (RU 2118163, 1994; SU 1805967, 1993), прединкубационную обработку эмбрионов кур лазерным облучением (кроме того, при таком способе иммунизации остаются без защиты цыплята первых дней жизни; 3212903, 1999) и т.п.

Однако применение лекарственных средств не обеспечивает достаточно полную защиту, поэтому основным методом профилактики заболевания является вакцинация птиц. В настоящее время для специфической профилактики псевдочумы птиц применяют вакцины двух типов: живые (FR 2388564, 1978; FR 2357256, 1978; WO 90/06131, 1990; SU 326584, 1979) и инактивированные (GB 1170508, 1977; RU 2035917, 1992). Имеющиеся разработки в отношении живых вакцин представляют собой большое число композиций, в состав которой входит вируссодержащий материал и вспомогательные добавки, обеспечивающие его эффективность при различных методах применения (RU 2153356, 1999; RU 2259844, 2004; RU 2236255, 2003; RU 1124585, 1982). Однако известные схемы иммунизации не в достаточной степени стимулируют необходимый уровень антител для создания напряженного иммунитета. Установлено, что одним из осложняющих факторов при этом является наличие у вакцинируемых цыплят материнских антител, ингибирующих размножение вакцинного вируса в организме и тем самым препятствующих формированию напряженного иммунитета. Если же иммунизацию проводить в возрасте 1-3 недели, когда уровень материнских антител значительно снижен, то при аэрозольной форме введения у цыплят, не имеющих материнских антител, может проявляться острая реакция на вакцинацию в виде респираторных симптомов (кашель, насморк, катар и т.д.). Кроме того, иммунизация цыплят старшего возраста активизирует латентные инфекции, подавляет рост цыплят, что при массовом разведении птицы может привести к существенным потерям.

Наиболее близким к предлагаемому по технической сущности является способ профилактики болезни Ньюкасла путем аэрозольного введения суточным цыплятам живой вакцины из лентогенного (например, шт. Ла-Сота) или мезогенного штаммов в сочетании с иммуномодулятором на основе минерального и растительных масел (ЕР 0292293, 1988). Недостатком известного способа является возможность прорыва иммунитета у вакцинированной птицы, а также необходимость принятия защитных мер при работе с вируссодержащим материалом.

Технической задачей, решаемой авторами, являлось создание более надежного и безопасного метода вакцинации птиц.

Было найдено, что указанная задача может быть решена созданием способа вакцинации на основе введения препарата, в котором в качестве вируссодержащего начала используют дефектные интерферирующие вирионы болезни Ньюкасла.

Дефектные интерферирующие вирионы (_дичвирионы) были обнаружены в 1950 г. американским вирусологом von Magnus, который обратил внимание на то, что при заражении куриных эмбрионов очень большой дозой вируса гриппа в их организме накапливаются вирусные частицы, которые сохраняли гемагглютинирующую активность, но теряли инфекционность. Если препарат из таких частиц вводили мышам, то у выживших животных возникала длительная резистентность к острой форме экспериментального гриппа. Биофизиками методом центрифугирования в градиенте плотности из вирусных популяций были получены препараты «дефектных интерферирующих частиц» (ДИЧ), [defective interfering particles, DIP] и «стандартных», «полноценных» вирионов. Геном у первых оказался меньше, чем у вторых (Huang, A.S. and Baltimore, D. Defective viral particles and viral disease process. Nature 1970. 226:325-327).

К настоящему времени ДИЧ найдены почти у всех групп вирусов животных и растений, а также у бактериофагов, что указывает на универсальный характер этого явления. Они обнаружены практически у всех РНК-содержащих вирусов животных. Высокие концентрации ДИЧ находят в живых аттенуированных вакцинах, и, следовательно, могут иметь значение для эффективности их, однако вопросы практического применения ДИЧ до настоящего времени не рассматривались.

Нами было высказано предположение, что дефектные интерферирующие вирионы, поскольку, несмотря на их геномную ущербность, генетически полноценны и способны успешно репродуцироваться в пермиссивных клетках, обуславливая адаптивный иммунитет организма. При этом в организме птицы будет наблюдаться гомологичная интерференция, механизм которой возможно состоит в том, что _дичвирионы непосредственно занимают в цитоплазме определенную экологическую нишу, общую с гомологичными «стандартными» вирионами, конкурируют с последними за РНК-полимеразу в основном на стадии репликации вирусной нуклеиновой кислоты и имеют при этом селективные преимущества («место занято»).

Кроме того, _дичвирионы РНКвирусов, благодаря защищенности от рибонуклеаз, активно стимулируя клетки на продукцию цитокинов, являются мощными индукторами интерферонов, что обеспечивает дополнительную защиту птиц от инфекции. Нами было установлено, что уже через 2 часа инкубации инфицированных вирусом болезни Ньюкасла лимфоцитов в среде появляются интерфероны, концентрация которых достигает максимума через 5 часов и удерживается обычно в течение 24 - 48 часов.

Таким образом, техническая задача решается путем аэрозольного введения цыплятам вакцины, содержащей дефектные интерферирующие вирионы болезни Ньюкасла, полученной путем множественного заражения куриных эмбрионов материалом, содержащим вирус болезни Ньюкасла, отбора эмбрионов, выживших до 19-дневного возраста, их убоя путем охлаждения, подготовки вирусной суспензии из их хориоаллантоисной жидкости и печени и выделения из них дефектных интерферирующих вирионов.

Препарат оптимально вводить цыплятам аэрозольно не менее чем за сутки до даты возможного заражения.

Пример 1. Приготовление препаратов _дичвирионов и их испытания

Было получено два препарата _дичвирионов: один - из вирус-вакцины «B₁», второй - из изолята «Vin 07».

Биопрепарат _дичвирионов из вируса Bi

Селекцию _дичвирионов проводили по признаку устойчивости к «множественному заражению» на хориоаллантоисную оболочку 7-дневных КЭ (стадия предплода) в 3-х пассажах по десяти яиц в каждом. Вирус-вакцину сухую разводили 1:10 и инокулировали на ХАО 7-дневного КЭ в объеме 0,1 мл («множественное заражение»). Яйца инкубировали при 37°С. Для дальнейших опытов отбирали эмбрионы, выживавшие до 19-дневного возраста, и убивали путем охлаждения. От них получали хориоаллантоисную жидкость и печень, из которых готовили вируссодержащую суспензию. Подобная биофильтрация вируса оказалась достаточной, чтобы получить препарат _дичвирионов, который обладал гемагглютинирующими свойствами до титра 1:512, гемолизировал эритроциты, сохранял антигенное родство с исходным вирусом (РЗГА) и был апатогенным для всех КЭ в стадиях предплода и плода.

Биопрепарат _дичвирионов из изолята Vin 07

Препарат _дичвирионов из изолята Vin 07 был получен нами путем 5 пассажей на КЭ 7-дневных КЭ методом инфицирования на ХАО, что обеспечило стабильность свойств препарата. Эти свойства оказались сходными со свойствами препарата _дичвирионов из штамма В1, что позволяет нам дать им единое описание.

Безвредность препаратов _дичвирионов

Патогенностъ препаратов _дичвирионов для однодневных КЭ (стадия зародыша) была изучена путем инокуляции вируссодержащего материала в латебру в дозе 0,05 мл. В результате исследований было найдено, что инфицированные зародыши замирают в течение 48 ч и выглядят как непрозрачный слой зародышевых клеток в виде запятой, окруженный прозрачной зоной ферментации. Общий диаметр зародыша 8-10 мм. Кровяных островков не было.

Патогенность препаратов _дичвирионов для 4-дневных зародышей была испытана путем инокуляции неразведенного вируссодержащего материала в желток в дозе 0,05 мл. В результате было найдено, что нарушений в развитии эмбрионов на этой стадии в течение 24 ч не было, а затем их рост замедлился, хотя они продолжали жить еще 3-5 дней и замирали. Таким образом, следует считать, что _дичвирионы вызывают дистрофические изменения у зародышей, приводящие к летальному исходу.

Безвредность препаратов _дичвирионов для КЭ в стадии предплода и плода.

Безвредность препарата для 7-дневных КЭ (стадия предплода) была испытана интравазальным методом, т.е. путем нанесения вируссодержащего материала на ХАО в месте образования искусственной пуги, и для 11-дневных КЭ (стадия плода) методом инфицирования в ХАП. В результате было найдено, что эмбрионы оставались здоровыми вплоть до вывода цыплят. Таким образом, показано, что препараты _дичвироны вируса НБ безвредны для КЭ в стадии предплода и плода.

Кроме того, исходные вирусы и _дичпрепараты из них были проверены на гемолитические и гемагглютинирующие свойства, содержание нейраминидазы, инфекционность и болезнетворность. Результаты исследований суммированы в таблице 1.

Таблица 1 Свойства вирус-вакцины B₁, а также препаратов _дичвирионов из штамма B₁ и из изолята Vin 07 Признаки и свойства штамм В_{1 дич}вирионы Bi _дичвирионы Vin 07 Патогенность для КЭ       - в стадии зародыша (1-дневный) + + + - в стадии зародыша (4-дневный) + - - - в стадии предплода + - - - в стадии плода - - - Отек ХАО у инфицированных КЭ + - - Гемолитические + - - Гемагглютинирующие + + + Нейраминидаза + - - Инфекционность + + + Болезнетворность ± - - Гомологичная интерференция ± + +

Приведенные материалы позволяют заключить, что препараты _дичвирионов из вируса НБ лентогенного типа могут быть патогенами для КЭ в стадии зародыша, но являются апатогенными для КЭ в стадии предплода и плода.

Исследование реакции гомологичной интерференции _дичвирионов (РГИ) показали, что положительная РГИ со стороны _дичвирионов в отношении тест-вируса выражалась в том, что видимых патологических изменений у подопытных КЭ в стадии плода не находили. Цыплята выводились вполне жизнеспособными, а при их вынужденном убое и вскрытии паренхиматозные органы выглядели «нормальными».

Было найдено, что уже через 24 ч после иммунизации 7-дневного КЭ в 25% случаев предплоды становились невосприимчивыми к тест-вирусу, а через 48 ч этот показатель увеличивался до 50%, но даже 72 ч период иммунизации был недостаточен для развития полной иммуноадаптации. Об этом можно было судить по патологоанатомической картине изменений печени, поверхность которой была покрыта как бы мельчайшими очажками гиперемии, которые чередовались с серыми очажками точечного некроза. При патологогистологическом уточнении характера патологического процесса были обнаружены очажки капилляроза (как мы считаем, пула иммуннокомпетентных клеток-мишеней, содержащих _дичвирионы) и зеленовато-серые пропитанные желчью очажки клеток в состоянии деструкции.

Рассчитанная нами по результатам опытов кинетика интерферирующей защиты 90% привитых _дичпрепаратом эмбрионов (КЗ₅₀), при иммунизации в 7-дневном возрасте и тестировании в 12-дневном, составляет 120 ч.

Пример 2. Для определения конечного разведения _дичпрепарата, которое еще создает адаптивный иммунитет, проводили титрование препаратов _дичвирионов. Титрование проводили с помощью РГИ на чувствительных тест-системах, например на куриных эмбрионах (биопроба). Поскольку количество _дичвирионов в препарате неизвестно и оно в процессе инкубации инфицированных КЭ должно увеличиваться, а взаимодействие _дичвириона с тест-вирусом опосредовано через клетку, то развитие такой трехчленной живой тест-системы весьма динамично и результат во многом зависит от стандартизации всех входящих в нее компонентов. Поэтому _дичпрепараты титровали следующим образом.

1. Все пробы до титрования хранят в холодильнике (+4°С), но не более одной недели, иначе титр _дичвирионов снижался. При необходимости длительного хранения проб их замораживали при -70°С.

2. Готовили ряд последовательных десятикратных (10^-1, 10^-2, 10^-3 и т.д.) разведений испытуемого препарата _дичвирионов. Количество разведений должно быть тем больше, чем выше предполагаемый титр. Для каждого разведения под опыт брали не меньше 4-х КЭ, иначе статистически рассчитываемая величина титра могла иметь слишком большую погрешность.

3. РГИ ставили в два этапа: вначале КЭ в возрасте 7-дней иммунизировали препаратом в 10-кратных разведениях в количестве 0,1 мл на ХАО, а затем в 12-дневном возрасте, заражали тест-вирусом в ХАП в дозе 100 ЭЛД₅₀/0,1 мл.

4. Промежуток времени между инфицированием КЭ _дичпрепаратом и заражением тест-вирусом постоянно - 120 ч (хотя для разных вирусов он разный).

5. Результат РГИ учитывали через 72 ч после заражения плодов КЭ тест-вирусом. За положительную реакцию принимали отсутствие гибели эмбрионов, а за отрицательную - замирание их.

6. За титр _дичвирионов принимали наибольшее разведение _дичпрепарата, вызывавшее общую защиту КЭ, рассчитанную по 50% эффекту (например, по методу Рида и Менча) и выраженную в виде десятичного логарифма.

7. В случае замирания КЭ, зараженных тест-вирусом в 12-дневном возрасте (отрицательная РГИ), считали, что интерферирующая активность _дичпрепарата недостаточная.

Таким образом, в случае положительной РЭ эмбрионы развиваются нормально и выводятся цыплята. Если _дичвирионы не успевают «занять место» в пермиссивных клетках, то возникает только локальный адаптивный иммунитет, что позволяет тест-вирусу репродуцироваться в незащищенных клетках, вызывая микроинфаркты в миокарде и микронекрозы в печени. При этом плод болеет, но остается живым, за счет заместительного восстановления специфической ткани. В случае отрицательного результата РГИ развивается литический вироз от _патвирионов тест-вируса. Патологоанатомическая картина вироза характерна и позволяет оценивать и титровать препараты _дичвирионов по их активности.

Пример 3. Вакцинный препарат использовали для профилактики НБ в условиях опытной базы НИИ птицеводства, распыляя ее в помещении, объемом 30 куб м с помощью генератора ВАГ-2 в течение 20 мин со скоростью 10 мл/мин. Напряженность поствакцинального иммунитета определяли через 28 суток после вакцинации. Полученные результаты представлены в таблице 2.

Таблица 2 Напряженность поствакцинального иммунитета к НБ. № Доза, мл на птицу К-во птиц Титр антител до вакцинации (log2) Титр антител на 28 день после вакцинации (log2) Иммунная птица 1 0,05 25 0 4,0 90 2 0,1 25 0 5,7 100 3 1 25 0 5,8 100 4 контроль 25 0 0 0

Полученные результаты показали, что заявляемая вакцина перспективна для профилактики болезни Ньюкасла у птиц.

Изобретение относится к области ветеринарной иммунологии и вирусологии. Способ включает аэрозольную обработку цыплят вакциной. При этом цыплят обрабатывают вакциной, полученной путем множественного заражения куриных эмбрионов материалом, содержащим вирус болезни Ньюкасла, отбора эмбрионов, выживших до 19-дневного возраста, их убоя путем охлаждения, подготовки вирусной суспензии из их хориоаллантоисной жидкости и печени и выделения из нее дефектных интерферирующих вирионов. Способ является надежным и безопасным методом вакцинации птиц. 1 з.п. ф-лы, 2 табл.

1. Способ профилактики болезни Ньюкасла, включающий аэрозольную обработку цыплят вакциной, отличающийся тем, что цыплят обрабатывают вакциной, полученной путем множественного заражения куриных эмбрионов материалом, содержащим вирус болезни Ньюкасла, отбора эмбрионов, выживших до 19-дневного возраста, их убоя путем охлаждения, подготовки вирусной суспензии из их хориоаллантоисной жидкости и печени и выделения из нее дефектных интерферирующих вирионов.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что аэрозольную обработку цыплят вакциной осуществляют не менее чем за сутки до даты возможного заражения.