СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТА ДЛЯ БОРЬБЫ С БОЛЕЗНЯМИ РАСТЕНИЙ Российский патент 1996 года по МПК A01N63/00 

Изобретение относится к области сельского хозяйства, точнее, к способам получения биологических препаратов и может быть использовано для борьбы с болезнями растений, в частности, пероноспорозом, антракнозом, черной ножкой, серой и белой гнилями, фузариозом.

Известен способ борьбы с болезнью пшеницы Gaeumonnomyces grominis с помощью бактерии Pseudomonas putida штамма 1 МЕТ 11286 (1). В соответствии с этим способом применяют суспензию бактерий. Средство вызывает повышение урожайности, в пересчете на сухую массу, и снижение коэффициента поражения в полевых и лабораторных опытах.

Недостатком данного способа являются эффективность только против Gaeumonnomyces grominis, а также незначительный срок хранения препарата, обусловленный использованием раствора культуры Pseudomonas putida подвергающегося неблагоприятным воздействием внешней среды.

Известен также способ получения биологического препарата для борьбы с болезнями растений на основе Fusarium oxysporum являющийся прототипом заявляемого способа получения препарата. Известный препарат содержит биологически активное вещество Fusarium oxysporum и добавки, включающие цеолит. Биоцид получают путем выращивания биомассы микроорганизмов в жидкой среде, адсорбирования полученной культуральной жидкости на основу из цеолита и сушки в естественных условиях. В другом варианте способа в диспергируемую среду на основе Д-сорбитола с добавкой в значительном количестве соли глутаминовой кислоты диспергируют Fusarium oxysporum и дисперсию подвергают вакуумной сублимационной сушке. Благодаря добавкам цеолита известный препарат обладает пролонгированным сроком хранения и действия, удобной формой.

Однако, существенным недостатком известного способа получения препарата является опасность заражения растений Fusarium oxysporum что обусловлено тем, что Fusarium oxysporum является факультативным паразитом и сильно изменчивым организмом. Д-сорбитол, основа диспергируемой среды, на 50-80% ингибирует фермент полигалактуроназу, играющую основную роль в фузариозном увядании. Таким образом, вероятность отрицательного действия препарата на растения велика. Кроме того, добавки Д-сорбитол и глатуминовая кислота, снижающие вероятность негативного воздействия, относительно дороги, что ограничивает использование препарата.

Задача настоящего изобретения разработка способа получения безопасного, непатогенного для растений препарата широкого спектра действия, эффективного против многих болезней растений, с пролонгированным сроком хранения и действия.

Способ получения препарата осуществляется следующим образом, выращивают биомассу бактерий Pseudomonas species в жидкой среде, затем адсорбируют полученную культуральную жидкость на основе из цеолита с последующим высушиванием в естественных условиях. В смесь культуральной жидкости с цеолитом может добавляться декстрин в количестве 0,5-1,5% Биомассу бактерий выращивают в биологическом реакторе 23-27 часов при продувании стерильным воздухом. Время выращивания культуры Pseudomonas species в жидкой среде обусловлено тем, что данный микроорганизм при выращивании в предлагаемой среде достигает стационарной фазы (стадии, когда уменьшается качество питательных веществ и накопление продуктов метаболизма в среде) через 23-27 часов. За ней наступает фаза, в которой отмирание клеток преобладает над делением, т.е. фаза гибели. Стационарная фаза оптимальная при приготовлении сухого препарата для сохранения жизнеспособности микроорганизмов. Параметры Pseudomonas species (0,51 микрон) вполне соизмеримы с полиэдрическими полостями и даже микропорами структур природных цеолитов, что обеспечивает высокую степень адсорбирования. Декстрин, входящий в состав препарата, является нейтральным нетоксичным веществом, продлевающим срок хранения биопрепарата, повышающим стабильность рабочей суспензии. Кроме того, декстрин выполняет функцию прилипателя в случае использования при опрыскивании растений.

Экспериментально установлено, что добавка декстрина менее 0,5 не обеспечивает упомянутых качеств, а выше 1,5% экономически невыгодно ввиду отсутствия приращения этих качеств.

Пример 1. Осуществление способа получения биопрепарата.

Готовят инокулят на среде, состоящей из мелассы (12%) и пептона (0,81%). Колбы объемом 0,51 и заполняют средой на 1/4 часть, закрывают ватными пробками и стерилизуют. В стерильную остывшую среду вносят иглой кусок культуры Pseudomonas species из пробирки возле пламени спиртовки. Культуру растят на качалке при температуре 25±2 ^o С в течение 24 часов. Готовый инокулят содержит до 10¹³ клеток/мл среды. Используя Кинга на чашках Петри определяют титр действующего начала инокулята. При подсчете учитывают две серии параллельных разведений, расхождение между ними не должно превышать 30% Подсчитывают среднее значение числа колоний для каждого выбранного разведения, а затем определяют средневзвешенное (соответствующее максимальному разведению) число колоний из простых средних, соответствующих двум последовательным разведениям. Результаты подсчета колоний в чашках Петри (клеток (мл) при разведениях 1•10¹⁰ и 1•10¹¹ инокулята приведены в таблице 1. Средне взвешенное число колоний, соответствующее максимальному разведению) составляет 38,8, титр культуры С 38,8•10¹²Я. Потребность инокулята для засева биологического реактора 5% от объема среды в реакторе, стартовый титр инокулята при этом составляет 10⁹ клеток/мл. Для приготовления среды пользуются варочным котлом, в который заливают среду, состоящую из раствора мелассы (1%) и пептона (0,5% ). После остывания среды в реакторе стерильно вносят инокулят в количестве 5% от объема среды) в посевное отверстие. Культивацию проводят в биологическом реакторе при аэрации до 1 л стерильного воздуха на 1 л среды в течение 23-27 часов. К концу культивации в среде образуется 1•10¹³ • 5•10¹³ клеток бактерий Pseudomonas species на 1 мл среды. Полученную биомассу бактериальных клеток сливают и адсорбируют на основу из цеолита. Для этого природный цеолит с размером частиц 13-30 мк заливают культуральной жидкостью в соотношении цеолит: культуральная жидкость, равном (0,8):1 по весу, перемешивают и оставляют при комнатной температуре. Через 24 часа надосадочную жидкость сливают или отсасывают, осадок высушивают в естественных условиях в вентилируемом помещении, раскладывая слоем 0,51 см в течение 24-36 часов. Контролируют титр полученного препарата порошка сероватого или светло-коричневого цвета. Он составляет 1•10¹³ клеток на 1 сухого препарата. Экспериментально установлено, что порошок при заявленном способе получения препарата хранится при +4 ^o С в течение года без потери активности.

Пример 2. Получение биопрепарата с добавлением декстрина.

Все операции по выращиванию биомассы Pseudomonas species проводятся аналогично примеру 1.

К концу 24-часовой культивации в биологическом реакторе известными методами определяют титр культуры Pseudomonas species в среде. Он составляет 18,6•10¹² клеток/мл. Цеолит с размером частиц 10-13 мк заливают культуральной жидкостью в соотношении по весу 1:1, добавляют декстpин в количестве 0,5-1% от веса смеси цеолита с культуральной жидкостью, перемешивают и оставляют на сутки. Далее также, как в примере 1, получают порошок биопрепарата. Определяют титр высушенной культуры на носителе с добавлением декстрина. В таблице 2 даны результаты подсчета количества колоний в чашках Петри высушенной культуры на носителе цеолите с добавлением декстрина (сухая форма). Средневзвешенное число колоний составляет N приблизительно 40,2, титр препарата С 40,2•19¹² клеток/г.

Пример 3. Действие против Fusarium oxysporium на зерновых культурах и овощных.

Для приготовления рабочей суспензии хорошо перемешивали порошок биопрепарата, полученный в примере 1 и 2, в небольшом количестве воды и оставляли на 4-24 часа. Затем разводили препарат до нужной концентрации в зависимости от способа применения: при обработке семян зерновых овощных культур и картофеля 11,5% пролив почвы 0,1-0,2% опрыскивание растений 0,01-0,02% Провели вегетационные опыты и производственные испытания. Стерилизованную нагреванием почву смешивали с суспензией гриба Fusarium oxysporium получая максимальную инфекционную нагрузку почвы 100 спор/г почвы. В качестве чистого контроля взята стерильная почва. Варианты опыта:
1. Чистый контроль (стерильная почва, обработка препаратом, полученным по заявленному способу, не проводилась).

2. Почва заражена Fusarium oxysporium обработка препаратом не проводилась.

3. Почва заражена Fusarium oxysporium, семена овса и огурцов обработаны препаратом за 7 дней до посадки.

4. Почва заражена Fusarium oxysporium, семена овса и томатов обработаны препаратов в день посадки.

5. Почва заражена Fusarium oxysporium семена овса и томатов обработаны препаратом за 7 дней до посадки, почва полита суспензией препарата.

6. Почва заражена Fusarium oxysporium, семена не обработаны, почва пролита суспензией во время посадки культур.

На каждый вариант брали 4 повторности. Через 15 дней корни растений повреждали продольным разрезом ножом вдоль рядка и в сделанную ножом бороздку вводили суспензию конидий и фрагментов гиф Fusarium oxysporium для ускорения развития заболевания. Через 30 дней после посадки учитывали симптомы поражения. Для этого корни растений отмывали в среде и определяли развитие болезни на каждом растении в баллах по шкале ВИЗР (3).

Результаты вегетационного опыта по влиянию полученного по заявляемому способу препарата на развитие заболевания, вызванного Fusarium oxysporium на культурах представлены в таблице 3 (овес) и в таблице 4 (томат).

Эффективность препарата, полученного по заявляемому способу, при предпосевной обработке семян овса составляет 88% по степени поражения корневой системы и 32-39% по количеству пораженных растений, как при обработке в день посева. Дополнительный полив почвы увеличивает эффективность препарата по количеству пораженных растений до 56%
Эффективность полученного по заявляемому способу препарата на томатах против Fusarium oxysporium при предпосевной обработке семян составляет до 92% степени поражения корневой системы и до 76% по количеству пораженных растений.

Пример 4. Действие против черной ножки на томатах.

Проводили вегетационный опыт по выявлению влияния полученного по заявляемому способу препарата против черной ножки на томатах аналогично примеру 3. Эффективность на томатах против черной ножки при поливе почвы составила 94%
Пример 5. Производственные испытания в защищенном грунте против пероноспороза, серой и белой гнилей на огурцах.

После двукратной обработки растений опрыскиванием суспензией полученного препарата, приготовленной как в примере 4, эффективность препарата составила 85-90%

Использование: в сельском хозяйстве для борьбы с болезнями растений, в частности пероноспорозом антракнозом, черной ножкой серой и белой гнилью, фузариозом. Сущность изобретения: разработан способ получения безопасного непатогенного для растений препарата, эффективного против многих болезней растений с пролонгированным сроком хранения и действия, который включается в выращивании биомассы бактерий Pseudomonas species, адсорбировании ее на основу из цеолита с размером частиц 10-30 мк с последующим высушиванием в естественных условиях. Выращивание Pspesies проводят 23-27 часов к биологическом реакторе в жидкой среде при продувании стерильным воздухом. Кроме того, при осуществлении способа получения препарата может быть введен декстрий в количестве 0,5-1,5 вес.проц. 3 з.п. ф-лы, 4 табл.

1. Способ получения препарата для борьбы с болезнями растений, включающий выращивание биомассы бактерий в жидкой среде, адсорбирование полученной культуральной жидкости на основу из цеолита с последующим высушиванием в естественных условиях, отличающийся тем, что для выращивания биомассы используют культуру бактерий Pseudomonas spesies. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что биомассу бактерий P. spesies выращивают в биологическом реакторе 24 27 ч при продувании стерильным воздухом. 3. Способ по пп.1 и 2, отличающийся тем, что полученный культуральной жидкостью заливают цеолит с размером частиц 10 30 мк в соотношении 1 мас. ч. культуральной жидкости на 0,8 мас. ч. 4. Способ по пп.1 и 3, отличающийся тем, что в смесь цеолита и культуральной жидкости добавляют декстрин в количестве 0,5 1,5 мас.