СПОСОБ ПОВЫШЕНИЯ РЕЗИСТЕНТНОСТИ ОРГАНИЗМА К ОПУХОЛЯМ Российский патент 1997 года по МПК A61N1/18 

Изобретение относится к медицине, в частности к онкологии, и может быть использовано как средство профилактики и лечения злокачественного роста и предотвращения метастазирования, а также для многократного снижения объемов использования цитостатических препаратов при операциях по пересадке тканей организма.

Известны способы химиотерапии опухолей, основанные на внутривенных инъекциях противоопухолевых химиопрепаратов циспластина, метатрексата, блеоцина. (Патент СССР N 2012337, 1994). Недостатком данного способа является низкая степень регрессии опухоли, только у 0,5% больных наступает полная регрессия опухоли и у 0,20% частичная. В процессе лечения отмечаются значительные токсические реакции в виде лейкопений (50%), тошноты, рвоты (60%), нарушений почечных функций (25%), эпителита слизистых (30%). Характерной особенностью противоопухолевых препаратов является их иммуносупрессивное действие, которое может ослабить защитные силы организма и облегчить развитие инфекционных осложнений. Одной из причин малой эффективности терапии является быстрое исчезновение цитостатика из крови после инъекции, вследствие этого короткий, недостаточный для удовлетворения противоопухолевого действия контакт цитостатического агента с опухолевыми клетками. Токсическое поражение нормальных тканей организма обусловлено воздействием высоких разовых пиковых концентраций противоопухолевого химиопрепарата.

Известно использование магнитной восприимчивости зонда при лечении рака. Для лечения пораженной раком области организма, используют микрочастицы, которые способны индуктивно нагреваться, причем размеры частиц таковы, что
они могут поглощаться раковыми клетками. По истечении метаболического периода на организм воздействуют переменным, колеблющимся или пульсирующим электромагнитным полем с целью нагрева упомянутых частиц в такой момент метаболического периода, когда возникает максимальная разница между магнитной восприимчивостью раковых и нормальных клеток. Затем продолжают индукционный нагрев указанных частиц с целью увеличения внутриклеточной температуры и селективного уничтожения раковых клеток (Патент США N 4662359, А 61 N 43/110, 1987).

Недостатком известного способа является то, что часть частиц задерживается здоровыми клетками. При их нагреве полем до t > 44^oС происходит гибель внутриклеточного содержимого, самой клетки, т. е. повреждаются здоровые ткани. Возникновение резко возросшего числа погибших клеток может привести к стрессовому воздействию на иммунную систему.

Известно также использование излучения вращающегося магнитного поля для лечения рака и других заболеваний. Лечение осуществляют, располагая пораженную ткань в центральной зоне поля, вращающегося в тканях по меньшей мере в трех взаимноперпендикулярных плоскостях, для приведения в нормальное состояние деполяризованных электронов ткани [1,2]
Недостатками этих способов является то, что для внешнего воздействия требуются значительные напряженности поля, что является небезвредным для организма и приводит к наличию побочных реакций.

Известен эффект низкой частоты и малой энергии пульсирующего электромагнитного поля (РЕМF, индукция электрического поля 2,5 mV, частота импульсов 80-100 Гц) на мышей, которым вводили противоопухолевый химиотерапевтический препарат циклофосфамид (СY) или проводили рентгеновское облучение. Установлено, что РЕМF потенциирует цитостатический эффект данных воздействий на органы кроветворения (костный мозг, селезенка и т.д.). Возможность потенциирования эффекта СY в сочетании с РЕМF делает продуктивным его использование при лечении злокачественных опухолей [3 прототип]
Однако известный способ показал, что РЕМF может усиливать стресс-реакцию организма, что в сочетании с СY отрицательно влияет на выживание клеток.

Целью изобретения является разработка способа, позволяющего повысить резистентность организма к опухолям за счет воздействия переменного электромагнитного поля, а также при фармакологическом лечении злокачественных опухолей, уменьшить побочные эффекты известных противоопухолевых лекарственных препаратов за счет снижения их дозировки с усилением или сохранением лечебного эффекта.

Это достигается способом повышения резистентности организма к опухолям путем воздействия переменным электромагнитным полем, в котором воздействие осуществляется изнутри организма электромагнитным полем, создаваемым дипольным излучателем длиной не более 50 мм, модулированным электрическим сигналом с амплитудой не более 100 мА частотой переменной составляющей от 4 Гц до 40 Мгц и амплитудой постоянной составляющей от 0 до 1 мА.

При этом воздействие осуществляют на фоне или без противоопухолевых лекарственных препаратов.

В качестве лекарственных препаратов рекомендованы метатрексат (Ebewe Anzneittel, Austria) и растительный препарат винкристин (Гедеон Рихтер, Венгрия).

Способ осуществляется следующим образом.

Для проверки действия электромагнитного поля на опухолевые клетки были проведены исследования прямой и непрямой туморицидной активности и краткосрочных и долговременных клеточных структурах непосредственно и в сочетании с противоопухолевыми лекарственными препаратами.

Объектом исследования служили перитонеальные макрофаги крыс, асцитная лимфома ЕL 4Е и саркома МСА/77-23 (клон Н). Опухоли перевивались на 8-10 недельных мышах линии С57ВL (Н-2К).

Клетки перитонеального эксудата выделяли по общепринятой методике с незначительными модификациями. Крысам, находящимся под легким эфирным наркозом, вводили внутрибрюшинно 5-10 мл подогретого до 37 градусов раствора Хенкса, брюшную стенку массировали в течение 3-5 мин и вскрывали ножницами. Содержимое брюшной полости центрифугировали. Осадок клеток после 3-х кратной промывки холодным раствором Хенкса окончательно ресуспендировали в 1 мл раствора Хенкса с 10% сывороткой теленка, инактивированной нагреванием. Клетки хранили при температуре таящего льда и использовали для исследования в течение 4 ч после процедуры изолирования.

Пример 1. Влияние электромагнитного поля на продукцию кислородных радикалов и фактора некроза опухолей перитонеальными макрофагами. Продукцию свободных радикалов кислорода макрофагами оценивали по интенсивности люминолзависимой и люцегенин-зависимой хемилюминесценции (ХЛ) (спонтанной и активированной частицами латекса). Регистрировали интенсивность спонтанного свечения в суспензии макрофагов в течение 3 мин, затем, не нарушая светоизоляции системы, вносили суспензию частиц латекса (0,1%) и измеряли максимальную величину хемилюминесцентного ответа на активатор (разница между интенсивностью активированного и спонтанного свечения клеток). Для исследования влияния на продукцию кислородных радикалов источник импульсов сигналов, имеющий форму капсулы, помещали в культуру макрофагов и производили отбор клеток для анализа через 30, 60, 120 и 180 мин. В контрольную культуру помещали неработающий источник.

Продукцию фактора некроза опухолей (альфа-ТНФ) перитонеальными макрофагами определяли с помощью иммуноферментного метода. Источник электромагнитного поля с параметрами: дипольный излучатель длиной 23 мм с амплитудой тока 10 мА при электрическом сопротивлении среды эквивалентной 100 ом с частотой переменных составляющих 4 Гц, 60 Гц и 20 мГц и амплитудой постоянной составляющей 0,05 мА, 1 мА помещали в культуру макрофагов на 1, 2 и 2,5 ч, а продукцию альфа-ТНФ измеряли через 24 ч инкубации клеток в стерильных условиях.

Было обнаружено, что при воздействии электромагнитного поля статистически значимо усиливается спонтанная люминол-зависимая ХЛ и угнетается спонтанная люцигенин-зависимая ХЛ (табл.1).

Одновременно наблюдается угнетение активированного частицами латекса люминол- и люцигенин-зависимого свечения. Максимальное активирующее воздействие поля отмечено через 60 мин совместной инкубации (эффект усиления 280% ). Усиление люминол-зависимой ХЛ указывает на усиление продукции кислородных радикалов, образующихся в результате разложения пероксида водорода. Как было показано в ряде исследований, именно эти радикалы обладают наибольшей цитотоксичностью по отношению к опухолевым клеткам. Напротив, люцигенин зависимая ХЛ регистрирует образование важных в физиологическом отношении супероксидных радикалов, которые, однако, практически не влияют на жизнеспособность опухолевых клеток.

Примечательно, что через 60 мин инкубации источник излучений (ИИ) с суспензией макрофагов наблюдалось максимальное усиление продукции фактора некроза опухолей фагоцитирующими клетками (табл.2).

Таким образом, воздействие переменного электромагнитного поля с заявленными характеристиками повышает противоопухолевую активность клеток - фагоцитов, усиливая продукцию ими свободных радикалов кислорода, регистрируемых с помощью люминол-зависимой ХЛ, и увеличивая продукцию клетками факторами некроза опухолей.

Пример 2. Влияние электромагнитного поля и химиопрепаратов на жизнеспособность клеток в культуре. Воздействие полем проводилось со следующими параметрами: дипольный излучатель длиной 14 мм, модулированный электрический сигнал амплитудой 7 мА, частотой переменных составляющих 6 Гц, 40 Гц и 10 мГц, амплитудой постоянных составляющих 0 мА, 0,25 мА, 1 мА.

Оценку жизнеспособности клеток в культуре определяли по окраске витальным красителем трипановым синим, для чего добавляли в культуру 5%-ный раствор красителя и через 5 мин микроскопически определяли количество окрашенных нежизнеспособных клеток. Вычисляли процентное содержание некрашенных (жизнеспособных) клеток в культуре.

Химиопрепарат метатрексат использовался в количестве, равном одной терапевтической дозе (ТД) 3 мкг/мл, 0,5 ТД, 0,1 ТД, растительный препарат винкристин также в количествах, равных 1 ТД (0,1 мкг/мл), 0,5 ТД, 0,1 ТД.

Количество жизнеспособных клеток в культуре лимфомы составляло в среднем 91,9±3,6% Через 4 ч инкубации количество жизнеспособных клеток в культуре практически не изменялось и было равно 89,2±2,1% В опытных культурах соответствующий показатель был равен, в культурах с источников излучения 88,2±1,9; в культурах с метатрексатом 85,6±2,7; в культурах с винкристином 86,1±2,3% в культурах с комбинацией источник излучения + метатрексат 83,9±2,0; в культурах с комбинацией источник излучения + винкристин 82,9±3,1.

Во всех случаях статистические различия между контрольной и опытной культурами были недостоверными. Следовательно ни исследованные аппараты, ни электромагнитное излучение не влияют на скорость некротических процессов, т. е. не изменяют существенно проницаемость клеточных мембран для ионов и воды.

Пример 3. Влияние электромагнитного поля и химиопрепаратов на скорость пролиферации клеток опухоли в культурах. Параметры излучения см. пример 1.

Клетки ЕL-4 и МСА/77-23 культивировали в 24-луночных планшетах (Costar) в среде RPMI 16.40, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки, буфер НЕРЕS, L-глютамин, незаменимые аминокислоты, пируват натрия, антибиотики и 2-меркаптоэтанол. В различные сроки после начала культивирования определяли уровень включения 3Н-тимидина, для чего клетки приносили в 96-луночные планшеты (NUNC), по 5000 клеток на 1 лунку, добавляли 3Н-тимидин и культивировали в течение 1 ч. После этого клетки с помощью харвестера переносили на фильтр и определяли уровень радиоактивности с помощью бета-счетчика (Beckman).

Интенсивность синтеза ДНК в опухолевых клетках определяли по включению 3Н-тимидина, для чего 5000 опухолевых клеток инкубировали в присутствии меченого по тритию тимидина в течение 1 ч, переносили клетки на фильтр и определяли уровень радиоактивности. Результаты выражали в виде индекса угнетения включения 3Н-тимидина.

И равно количеству импульсов в опытной культуре, деленному на количество импульсов в контрольной группе.

Каждая точка измерялась в трипликате. Проводили постановку пяти независимых экспериментов. Статистическую обработку результатов проводили методом Стьюдента, приняв 5% в качестве критерия достоверности различий опытных и контрольных результатов.

Результаты данных экспериментов приведены в табл.3.

Видно, что инкубация клеток опухоли с источником излучения приводила к угнетению включения радиоактивной метки в ДНК. Практически неотличимые результаты были получены при определении индекса угнетения непосредственно после окончания его воздействия. На основании этого можно заключить, что отдаленный ингибирующий эффект электромагнитного поля сохраняется в культуре жизнеспособных опухолевых клеток как минимум в течение одних суток.

Исследование влияния метатрексата и винкристина на угнетение пролиферации клеток лимфомы непосредственно после прекращения воздействия показало полное отсутствие эффекта: клетки продолжали синтезировать ДНК с прежней скоростью. Обнаружено, что непосредственно после окончания инкубации весь наблюдаемый эффект ингибирования пролиферации зависел от воздействия электромагнитного поля в среде инкубации клеток.

Ингибирующее действие химиопрепаратов становилось выраженным лишь через 24 ч после инкубации.При этом метатрексат и винкристин, взятые в дозах 1 и 0,5 ТД, практически нацело отключали синтез ДНК в опухолевых клетках, что свидетельствовало о 100% гибели клеток лимфомы. Интересно, что гибель опухолевых клеток под влиянием химиопрепаратов была преимущественно апоптопической, но не некротической. При таких условиях практических полной гибели клеточных элементов в культуре оценить синергистический эффект обоих факторов не представлялось возможным. Однако при снижении дозы индекс угнетения пролиферации был существенно ниже. При этом синергистическое воздействие слабого электромагнитного поля и препарата оказывалось значительно выше,чем таковое, обнаруженное при индивидуальном воздействии исследуемых ингибиторов синтеза ДНК. Уровень подавления включения меченого тимидина при сочетанном воздействии препаратов и электромагнитного излучения был практически равен таковому, обнаруженному при воздействии химиопрепаратов, взятых в значительно больших количествах (1 и 0,5 ТД).

Пример 4. Клонообразующая способность опухолевых клеток под воздействием источника излучения (ИИ) и химиопрепаратов. Параметры излучения следующие: дипольный излучатель длиной 20 мм, модулированный электрический сигнал амплитудой 10 мА, при электрическом сопротивлении среды, эквивалентном 200 Ом, частотой переменных составляющих 5 Гц, 50 Гц, 15 мГц, амплитудой постоянных составляющих 0 мА6 0,5 мА, 1 мА.

Оценку клоногенной активности опухолевых клеток проводили в доросиликонированных капиллярах. Опухолевые клетки в количестве 50000 клеток/мл в полной среде RPMI-1640 с 10%-ной эмбриальной телячьей сывороткой смешивали с 0,32% агаром, приготовленном на дистиллированной воде, и помещали в капилляр. Капилляры инкубировали 14 дней при 37 градусах в атмосфере 5% СО₂. За колонию принимали скопление не менее 50 опухолевых клеток. Эффективность колониеобразования (ЭКО) оценивали в
ЭКО равно отношению количества колоний, количеству высеянных клеток, в
Для каждой точки заполняли по три капилляра. Статистический анализ проводили по методу Стьюдента.

Влияние ИИ и химиопрепаратов изучено на лимфоме ЕL-4 в фазе логарифмического роста опухоли при максимальном включении тимидина в нее. Исходно количество колоний, образовавшихся в капилляре, было равно 20,3±2,1; ЭКО= 0,004% Через 4 ч количество колоний достоверно снижалось, достигая величины 8,0±0,6; ЭКО=0,0016%
До такого же уровня снижалось количество колоний после четырехчасовой инкубации с винкристином (при 1 ТД количество колоний 7,0±0,6; ЭКО=0,0014%). При инкубации с метатрексатом эффект ингибирования был существенно ниже (при 1 ТД количество колоний 16,0±1,4; ЭКО=0,0032% при 0,1 ТД количество колоний 16,0±1,3; ЭКО=0,0032%). Сочетанное воздействие ИИ и химиопрепаратов не приводило к дальнейшему увеличению ингибирующей активности на процесс колониеобразования в культуре клеток лимфомы (при ИИ + винкристин количество колоний 8,0±0,5; ЭКО= 0,0016% при ИИ + метатрексат количество колоний 7,0±0,6; ЭКО= 0,0014%).

Количество колоний в контрольных капиллярах практически не изменялось в зависимости от времени инкубации.

На основании полученных в данной серии экспериментов результатов можно заключить, что слабое электромагнитное поле, создаваемое капсулой и источником электромагнитного поля, ингибирует колониеобразующую активность опухолевых клеток лимфомы на уровне действия винкристина, взятого в большой концентрации, равной 1 ТД. В то же время первичное (собственное) электромагнитное воздействие ИИ и вторичное (продуцируемое им в тканях) является значительно более эффективным ингибитором колониеобразования опухолей в культуре по сравнению с метатрексатом. Из-за его высокой ингибирующей активности оказалось невозможным продемонстрировать его синергистический эффект с химиопрепаратами. Ингибирование колониеобразования опухолевых клеток в культуре является хорошим прогностическим показателем ингибирования метастазирования опухолей в организме.

Пример 5. Влияние электромагнитного поля на внутриклеточные дегидрогеназы митохондрий опухолевых клеток в культуре. Параметры излучения, как и в примере 4.

Активность работы клеточных ферментов оценивали по интенсивности включения и восстановления солей тетразолия. Метод основан на исследовании способности некоторых дегидрогеназ митохондрий живых активно функционирующих клеток восстанавливать соли тетразолия, в частности бромистый МТТ. При этом бледно-желтый водорастворимый субстрат (МТ) превращается в темно-синие кристаллы формазана, нерастворимые в воде. Интенсивность реакции измеряется количественно колориметрически. Количество образовавшегося формазана служит критерием активности окислительно-восстановительных ферментативных реакций в живых клетках под влиянием различных агентов. Опухолевые клетки после инкубации с ИИ, химиопрепаратом или их сочетанием раскапывали в триплете в 96-луночных планшетах из расчета 50000 клеток на лунку в объеме 100 мкл. В каждую лунку добавляли 25 мкл МТТ (Sigma) в концентрации 5 мг/мл физиологического раствора. Затем после трехчасовой инкубации при 37^oС в атмосфере 5% СО₂ в каждую лунку добавляли по 150 мкл изопропанола и центрифугировали при 3000 об/мин в течение 10 мин. Окончательно из каждой лунки отбирали по 100 мкл надосадочной жидкости, которую раскапывали в чистые лунки 96-луночного планшета и определяли цветной показатель на мультискане (МСС 340 Р, Lab System) при длине волны 540 нм.

Анализ параметров, полученных с помощью МТТ тестов, выявил следующие закономерности. Если цветной показатель включения тетразолия в опухолевые клетки до начала какихлибо воздействий равнялся 0,132±0,012, то через 4 ч инкубации с ИИ этот параметр существенно снижался до 0,150±0,012. Это составляло 52% от контрольной величины. Такая же величина цветного показателя была получена после инкубации клеток в присутствии винкристина, взятого в максимальной концентрации (0,153±0,006, 51% от контроля).

Сочетанное воздействие ИИ и винкристина не приводило к дальнейшему угнетению активности дегидрогеназ (0,149±0,009, 54% от контроля). Метатрексат был значительно менее эффективным ингибитором метаболической активности опухолевых клеток, поскольку после инкубации с ним цветной показатель снижался лишь до 0,257±0,020, что составляло 82% от контроля при концентрации метатрексата 0,1 ТД. При увеличении концентрации препарата до 1 ТД степень угнетания дегидрогеназ не изменялась (0,243±0,012, 77,8% от контроля).

В то же время сочетанное воздействие метатрексата и приводила к достоверному и существенному усилению ингибирования активности ферментов (0,135±0,005, 57% от контроля, р < 0,05).

Из приведенных примеров видно, что электромагнитное поле предлагаемых параметров приводит к значительным структурно-функциональным нарушениям в опухолевых клетках. Механизм его ингибирующего действия сходен с механизмом действия винкристина. Более того, сочетанное применение электромагнитного излучения с химиопрепаратами значительно усиливает их опухолецидные свойства, так что использование малых доз препаратов вместе с ИИ приводит к такому же эффекту, как действие препаратов, взятых в максимальных дозировках.

Капсулу с ИИ рекомендуется вводить в организм человека проглатыванием или любым другим методом до соприкосновения со слизистой оболочкой организма. С целью экономии ресурса источника питания капсулы и совпадения стимулирующих сигналов с положительной фазой собственных квазистационарных биоэлектрических колебаний стенки желудочно-кишечного тракта, авторами выбраны заявленные параметры стимулирующих импульсных сигналов. Это сериалы монополярных импульсных сигналов относительно уровня постоянной составляющей тока с длительностью импульса t_l=1-20 мс и с провалом синусоидальной формы вершины импульса до половины его амплитуды (или без него), периодом следования импульсов t_l=10-26 мс, длительностью пачки импульсов t₂ от 200 мс до 20 мин, периодом следования пачек t₃ от 2 до 1 ч, амплитудой импульса тока 7 мА (при R_нагр= 100 Ом).

Указанный диапазон генерируемых сигналов является имитацией естественных сигналов нормально работающих органов.

Для повышения эффективности воздействия импульсных сигналов и обеспечения возможности избирательности самим организмом оптимальных для него сигналов исходя из сигналов взаимного общения органов длительность импульсов в пачке может меняться, длительность каждого последующего импульса относительно предыдущего уменьшается на одну миллисекунду при остающемся постоянным периоде следования импульсов в пачке.

Способ может быть использован в качестве способа профилактики злокачественного роста и предотвращения метастазирования, а также для значительного снижения дозировок цитостатических препаратов при лечении онкологических заболеваний и при операциях по пересадке тканей.

Изобретение относится к медицине, в частности к онкологии, и может быть использовано как средство лечения и профилактики злокачественного роста и предотвращения метастазирования, а также для снижения дозировок цитостатических препаратов. Сущность изобретения заключается в способе повышения резистентности организма к опухолям путем воздействия переменным электромагнитным полем, причем воздействие осуществляется изнутри организма электромагнитным полем, создаваемым дипольным излучателем длиной не более 50 мм с модулированным электрическим сигналом с амплитудой не более 100 мА, частотами от 4 Гц до 40 МГц и амплитудой постоянной составляющей от 0 до 1 мА. При этом воздействие осуществляют на фоне или без противоопухолевых лекарственных препаратов. 1 с. и 1 з.п.ф-лы, 3 табл.

1. Способ повышения резистентности организма к опухолям путем воздействия переменным электромагнитным полем, отличающийся тем, что воздействие осуществляют изнутри организма электромагнитным полем, создаваемым дипольным излучателем длиной не более 50 мм с переменным или модулированным электрическим сигналом амплитудой не более 100 мА, частотой переменных составляющих от 4 Гц до 40 МГц и амплитудой постоянной составляющей от 0 до 1 мА. 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что воздействие осуществляют на фоне или без противоопухолевых лекарственных препаратов.