ПРОТИВООПУХОЛЕВЫЙ ПЕПТИДНЫЙ ПРЕПАРАТ НА ОСНОВЕ ФРАГМЕНТА АЛЬФА-ФЕТОПРОТЕИНА, ЕГО КОНЪЮГАТ, ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ И СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ ГОРМОНЗАВИСИМЫХ ОПУХОЛЕЙ Российский патент 2006 года по МПК A61K38/12 A61P35/00 

Предлагаемое изобретение относится к области биофармакологии и медицины и может быть использовано для приготовления противоопухолевых препаратов и терапии злокачественных новообразований.

Изучение строения, функции и путей использования альфа-фетопротеина (АФП) имеет свою предысторию и подробно описано в статье Г.И.Абелева ("25 лет изучения α-фетопротеина", Онтогенез, 1989, т.20, №6, стр.607-615). В последние годы получено много новых данных, свидетельствующих о перспективности дальнейшего исследования этого белка.

Альфа-фетопротеин представляет собой крупный гликопротеин (70 кДа), состоящий из одной полипептидной цепи, и является одним из основных циркулирующих белков, обнаруживаемых у млекопитающих и других позвоночных в процессе развития эмбриона и плода. Ген АФП вместе с другими генами семейства альбумина расположен в регионе 4q11-q22 4-й хромосомы [1]. Он считается онкофетальным маркером, поскольку секретируется различными опухолями, включая гепатоклеточную карциному и тератому. Установлено также, что изменения уровня АФП во время беременности могут вызывать нарушения развития плода, включая синдром Дауна и расщепление позвоночника [2]. Обнаружено, что АФП выполняет многие важные биологические функции, главная из которых - транспортная. Известно, что АФП обладает высоким сродством к жирным кислотам, содержит сайт высокоаффинного связывания билирубина и эффективно связывает катионы меди и никеля [3]. Установлено также, что этот белок принимает участие в регуляции метаболизма и деления клеток, а также взаимодействия макрофагов с Т-лимфоцитами. В пользу последнего утверждения говорят данные о роли АФП в подавлении иммунного ответа организма матери на развивающийся эмбрион [4].

Считается, что АФП состоит из одной полипептидной цепи размером в 590 аминокислотных остатков, подразделенной на три домена, именуемых домен 1, домен 2 и домен 3. Каждый домен состоит примерно из 195 аминокислот, и в них располагаются 4, 5 и 6 дисульфидных связей соответственно [5].

Патентные исследования показали, что на основе АФП разработаны препараты и способы их получения из природных источников путем выделения и очистки (патент РФ 2121350, 1998 г., патент РФ 2123009, 1998 г., патент РФ 2154468, 2000 г.), способы лечения с помощью таких препаратов (патент РФ 2105567,1998 г.).

Для использования в терапевтических целях необходимы большие количества белка, которые весьма трудно обеспечить его выделением из природных источников. Актуальной задачей для обеспечения необходимых количеств АФП является привлечение методов генной инженерии и биотехнологии. Однако получение рекомбинантного АФП осложнено рядом его особенностей. Во-первых, это крупный, гликозилированный белок, обеспечение нативной конформации которого в клетках штаммов-продуцентов является подчас неразрешимой задачей. Кроме того, образующийся в ходе трансляции в клетках штамма-продуцента денатурированный АФП содержит большое количество свободных тиольных групп. Поэтому в процессе ренатурации белка возможно образование как межмолекулярных, так и внутримолекулярных дисульфидных связей. Образование межмолеклярных связей приводит к большим потерям белка в результате образования его крупных конгломератов и выпадения в осадок. Положение внутримолекулярных связей, образующихся в ходе ренатурации рекомбинантного белка, часто отличается от такового в природном АФП. Поскольку корректное образование дисульфидных связей является необходимым фактором для формирования нативной третичной структуры белка, нарушения порядка формирования этих связей в рекомбинантном белке обусловливают конформационную гетерогенность препарата и приводят к потере его активности.

В значительной мере избежать этих затруднений при получении рекомбинантного АФП позволяет использование генно-инженерных конструкций, обеспечивающих продукцию не целого белка, а его биологически активных пептидных фрагментов. Это позволяет значительно удешевить, упростить процедуру получения препарата и увеличить выход биологически активного белка. Современные разработки, связанные с получением рекомбинантных молекул АФП и его фрагментов, изложенные в публикациях США, заявке 2002031520, 2002 г. и патенте 6627440, 2003 г. являются наиболее близкими аналогами нашего изобретения. Полученные с помощью этих работ генно-инженерным методом фрагменты АФП предназначены для усиления клеточного иммунитета при некоторых онкологических заболеваниях.

Однако известные короткоцепочечные фрагменты АФП не всегда достаточно эффективны и не применялись при гормонзависимых опухолях.

Техническим результатом настоящего изобретения является устранение указанных недостатков, а также расширение арсенала противоопухолевых средств и методов лечения злокачественных заболеваний.

Технический результат достигается тем, что разработан противоопухолевый пептидный препарат на основе фрагмента альфа-фетопротеина человека, представляющий собой пептид с аминокислотной последовательностью, представленной на фиг.1, имеющий в первичной структуре 237 аминокислотных остатка и молекулярную массу около 27 кДа, способный связываться с рецептором альфа-фетопротеина и ингибировать эстрадиол-индуцированный рост клеток гормонзависимых опухолей, а также выполнять функцию векторной молекулы для направленной доставки цитотоксического препарата в опухолевые клетки. Препарат может быть получен рекомбинантным методом при культивировании клеток Е. coli, трансформированных плазмидным вектором, содержащим кДНК гена третьего домена альфа-фетопротеина человека; полученный пептидный продукт модифицирован добавочным метиониновьм остатком (Met) на N-конце и двумя аминокислотными остатками (Leu-Glu) на С-конце.

Другим объектом изобретения является конъюгат пептидного препарата и цитотоксического агента, способный целенаправленно проникать в опухолевую клетку, представляющий собой препарат, охарактеризованный выше, ковалентно связанный с цитотоксическим агентом в молярном соотношении от 1:1 до 1:10. Конъюгат в качестве цитотоксического агента может содержать вещество, выбранное из группы: паклитаксел, доцетаксел, доксорубицин, дауномицин, карминомицин, винкристин, винбластин, мелфалан, метотрексат, цитарабин. Все названные препараты являются противоопухолевыми или цитотоксическими веществами, не имеющими достаточного избирательного действия в отношении опухолевых клеток. В виде конъюгата с нашим пептидным препаратом эти вещества приобретают исключительную избирательность в отношении злокачественных клеток.

На основе пептидного препарата и конъюгата разработана фармацевтическая композиция, обладающая противоопухолевым действием, содержащая противоопухолевый компонент и подходящий для внутривенного введения фармацевтический носитель, при этом в качестве противоопухолевого компонента композиция содержит разработанный нами пептидный препарат или конъюгат в количестве, достаточном для получения терапевтического эффекта. В качестве носителя для внутривенного введения может быть использован физиологический раствор или фосфатно-солевой раствор, рН 7.4, приготовленный на воде для инъекций.

В основе изобретения лежат два новых вещества - разработанный и полученный нами пептидный препарат на основе фрагмента АФП и его конъюгат с цитотоксическим агентом, которые отличаются высокой избирательностью и эффективностью противоопухолевого действия и могут быть получены с помощью технологичных методов генной инженерии и химического синтеза.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами:

Пример 1. Конструирование плазмидного вектора и экспрессия рекомбинантного пептидного препарата (фрагмента АФП) в клетках Е. coli.

1) Получение кДНК гена АФП человека

Тотальную РНК выделяли из клеток гепатоцеллюлярной карциномы человека линии HepG2, продуцирующей АФП. кДНК гена АФП человека синтезировали на мРНК с помощью обратной транскриптазы вируса миелобластоза птиц (RTAMV). В качестве затравки использовали праймер на 3'- нетранслируемую область mPHK: 5'-CTTCCCCTGAAGTAAT-3'. Реакцию проводили в 2 этапа: 1) отжиг праймера, 2) синтез кДНК. На первом этапе смесь, составленную из 18 μlH₂O, 10 μl 5-кратного буфера (50 mM Трис-HCl, рН 8.3, 50 mM MgCl₂, 700 mM KCl), 8 μl смеси четырех дезоксинуклеотидтрифосфатов dNTP (1.25 mM каждого dNTP), 10 μl раствора мРНК (2 мкг/мл) и 25 μМ праймера, нагревали до 70°С в течение 10 мин, затем постепенно охлаждали до комнатной температуры. К реакционной смеси добавляли 1 μl ингибитора РНКаз RNазина (40 ед/μl) и 2.5 μl RTAMV (12.5 ед/μd). Конечный объем смеси составил 50 μl. Реакцию проводили при 40°С в течение 2 часов, а затем инактивировали реакционную смесь выдерживанием при 95°С в течение 5 мин. Качество кДНК проверяли методом PCR, используя праймеры на 5'-и 3'-концевые области молекулы ДНК АФП. Полосы амплификации соответствовали ожидаемому размеру 1773 пар оснований (bp).

2) Конструирование экспрессионного вектора.

Предварительно на основе последовательности мРНК АФП человека с помощью компьютерной программы DNA-SUN была получена рестрикционная карта ДНК-последовательности АФП для определения отсутствующих и уникальных сайтов рестрикции. По результатам анализа этих данных были подобраны и синтезированы праймеры для амплификации фрагмента ДНК АФП, соответствующего третьему домену белковой молекулы (с 357 по 590 аминокислоту). Прямой праймер 5'ttttCCATGGGATACCAGGAGTTATTG 3' содержит сайт для Ncol рестриктазы. Обратный праймер 5' ttttCTCGAGAACTCCCAAAGCAGCAC 3' содержит сайт для Xhol рестриктазы. Очищенный методом электрофореза в 1.2% агарозном геле с последующей экстракцией фрагмент ДНК встроили в вектор рЕТ28а(+) (Novagene) по сайтам рестрикции Ncol и Xhol. Данная генная конструкция позволяет при трансляции получить пептид AFP28D3, который по аминокислотной последовательности соответствует третьему домену молекулы АФП с добавочным метионином (Met) на N-конце и несколькими аминокислотами на С-конце (Leu-Glu-His-His-His-His-His-His). Шесть концевых гистидинов необходимы для выделения белка методом хелатной хроматографии. Размер нового пептида составляет 237 аминокислотных остатков или примерно 27 кДа. Клонирование проводили методом кальциевой трансформации компетентных клеток DH5a штамма E.coli с селекцией на чашках Петри с агаризованной питательной средой LB, содержащей канамицин. Отбор колоний с генной конструкцией проводили методом полимеразной цепной реакции с помощью стандартных векторных праймеров T7prom и T7ter по длине продуктов амплификации. Отобранные колонии наращивали в LB с канамицином, и из клеточной массы выделяли экспрессионные плазмиды для секвенирования. По результатам секвенирования (отсутствие ошибок амплификации) для дальнейшей работы была выбрана плазмида pAFP28D3.

3) Экспрессия рекомбинантного пептидного фрагмента АФП в E.coli.

Экспрессирующий штамм E.coli BL21(DE3) трансфецировали плазмидой pAFP28D3. Ночную культуру бактериальных клеток разводили в 50 раз в среде LB, содержащей канамицин (30 мкг/мл), и наращивали клетки при 37°С до уровня мутности культуральной среды 0.6-0.8. Затем добавляли IPTG до конечной концентрации 0.4 мМ и инкубировали клеточную суспензию 3 часа при интенсивном перемешивании. Клеточные осадки собирали центрифугированием и хранили при -30°С.

Пример 2. Выделение конечного продукта (пептидного препарата) из штамма-продуцента Е.coli.

1) Приготовление буферных растворов

Готовили растворы A, B, C, D, E. F:

А: 0.1 М трис-HCl буфер, 6 М гуанидинхлорид, рН 8,0.

В: 0.02 М Трис-HCl. 0.3 М NaCl, рН 8.0.

С: 0.05 М трис-HCl буфер, 6 М мочевины, 0.4 М NaCl и 0.02 М имидазола, рН 8.0.

D: 0.05 М трис-HCl буфер, 6 М мочевины, 0.4 М NaCl и 0.3 М имидазола, рН 8.0.

E: 0.1 М трис-HCl буфер, 0.5 М NaCl и 2 мМ ЭДТА, рН 8.0.

F: 0.01 М трис-HCl буфер, 0.15 М NaCl, рН 8.0.

2) Выделение пептидного препарата АФП (рер-АФП) из биомассы.

К биомассе из 600 мл культуральной среды добавляли 3 мл буфера В с 2 мМ PMSF. Суспензию обрабатывали ультразвуком на дезинтеграторе High Intensity Ultrasonic Processor 750 Watt Series при 0°С. Суспензию центрифугировали 10 мин (12000 g, 4°C). Супернатант отбрасывали, осадки суспендировали в 5 мл буфера В и центрифугировали при указанных выше условиях. Промывку осадка повторяли 5 раз. К отмытому осадку телец включения добавляли 4 мл буфера А, обрабатывали ультразвуком для растворения белка и центрифугировали 30 мин (12000 g, 4°С). Супернатант наносили на колонку (диаметр 0,5 см) с 1 мл иминодиацетат-сефарозы Chelating Sepharose CL-6B, насыщенной ионами никеля (2⁺) и промытой 2 мл буфера А. Сорбент последовательно промывали 10 мл буфера А и 10 мл буфера С. Белок элюировали 6 мл буфера D. К элюату добавляли 42 мкл β-меркаптоэтанола (до конечной концентрации 0,1 М) и раствор перемешивали 1 ч при комнатной температуре. Раствор восстановленного белка выливали при перемешивании в 60 мл холодного (4°С) буфера Е. Через 48 ч белок диализировали сначала против 3 л буфера Е (48 ч, 4°С), затем против 3 л буфера F (24 ч, 4°С). Диализат концентрировали на ячейке Amicon (мембрана РМ-10) до 400 мкл, концентрат фракционировали на колонке Superdex™ 200 10/30, элюируя буфером F со скоростью протока 0,5 мл/мин и детекцией при 280 нм. Выделяют две фракции - димер (фракция I) и мономер (фракция II). Профиль элюции суммарного белка приведен на фиг.2 (I - димер, II - мономер). Как видно на фигуре, эффективность получения мономера II достигает 40% от суммарного белка. Концентрацию белка определяли по методу ВСА (ВСА-набор Sigma), выход - 3 мг. Проводили электрофорез выделенных фракций белка в восстанавливающих и невосстанавливающих условиях в 13%-ном полиакриламидном геле по Лэммли. Целевую фракцию II концентрировали на ячейке Amicon (мембрана РМ-10) до 1,5 мл.

На фиг.3 представлен электрофорез в 13%-ном ПААГ фракций, соответствующих димеру и мономеру рер-АФП, в восстанавливающих и невосстанавливающих условиях (полосы 1,2- без восстановления; полосы 3-5 с восстановлением β-меркаптоэтанолом; 1,4 - фракция I (димер); 2,5 - фракция II (мономер); 3 - маркеры молекулярной массы).

Пример 3. Анализ связывания и захвата FITC-меченого пептидного препарата (рер-АФП) в опухолевых клетках и лимфоцитах с помощью проточной цитофлуориметрии.

1) Получение FITC-меченого производного рер-АФП.

К раствору 1 мг рер-АФП в 1 мл 0,1 М бикарбоната натрия, рН 8,5, добавляли 6,5 мкл (4-кратный молярный избыток) раствора FITC (флуоресцеин-изотиоцианат) в ДМСО (10 мг/мл). Реакцию проводили в темноте в течение 1 ч при комнатной температуре, затем 18 ч при +4°С, после чего наносили на колонку (1х30 см) с сефадексом G-25, уравновешенную PBS, рН 7,4, и элюировали указанным буфером при скорости протока 1 мл/мин и детекции при 280 нм. Собирали белковую фракцию в свободном объеме, концентрировали до 1 мл. Концентрацию белка определяли с помощью бицинхониновой кислоты, концентрацию FITC - по поглощению в области 498 нм. Молярное соотношение FITC- пептид составило 1,4:1.

2) Анализ связывания и захвата FITC-меченого рер-АФП в опухолевых клетках и лимфоцитах с помощью проточной цитофлуориметрии.

Клетки аденокарциномы молочной железы линии MCF-7 и аденокарциномы яичника человека линии SKOV3 культивировали в пластиковых флаконах (Coming-Costar) в среде DMEM (ICN), содержащей 10% FBS (фирма Gibco) и 50 мкг/мл гентамицина (ICN) в CO₂-инкубаторе при 37°С в увлажненной атмосфере, содержащей 5% СО₂. Лимфоциты периферической крови здоровых добровольцев выделяли с помощью центрифугирования крови через градиент раствора фиколл-пак по методу Boyum [(Boyum A., llin. Invest. 21: 9-18, 1968]. Клетки рассевали в 6-луночные планшеты за сутки до эксперимента. Перед началом эксперимента клетки инкубировали 2 часа в среде DMEM без FBS. Для анализа связывания рер-АФП-FITC в диапазоне концентраций 30-4000 нм добавляли к суспензии клеток и инкубировали при 4°С в течение 1 часа. При исследовании эндоцитоза инкубацию проводили при 37°С. После окончания инкубации клетки трижды отмывали холодным PBS и фиксировали с помощью 2% параформальдегида. Интенсивность флуоресценции измеряли на проточном цитофлуориметре EPICS-XL. Для возбуждения флуоресценции использовали аргоновый лазер (λ488 нм, полоса пропускания 520 нм). В каждом образце (10⁵ клеток) определяли среднее значение интенсивности флуоресценции и процент клеток, флуоресценция которых превышала аутофлуоресценцию. Специфичность связывания рер-АФП-FITC с рецептором АФП определяли путем инкубации клеток с рер-АФП-FITC в присутствии 30-кратного избытка АФП.

Было показано, что рер-АФП-FITC связывается с опухолевыми клетками (MCF-7 и SKOV3) в отличие от лимфоцитов периферической крови (фиг.4а). При этом интенсивность флуоресценции клеток, обработанных рер-АФП-FITC до концентрации 1 мкМ, была близка к флуоресценции клеток, обработанных АФП-FITC. Эти исследования показывают избирательность нашего препарата в отношении гормонзависимых опухолей.

Исследование захвата рер-АФП-FITC опухолевыми клетками и лимфоцитами периферической крови человека показало, что опухолевые линии MCF-7 и SKOV3 активно эндоцитируют рер-АФП-FITC (фиг.4б), в отличие от лимфоцитов. В лимфоцитах эндоцитоз рер-АФП-FITC практически отсутствовал. Для исследования специфичности связывания, клетки SKOV3 инкубировали с рер-АФП-FITC с добавлением 30-кратного избытка немеченого АФП в тех же условиях. АФП в значительной степени ингибировал связывание рер-АФП-FITC с клетками (фиг.5). Эти данные подтверждают, что наш препарат (фрагмент рер-АФП) действительно связывается с рецептором АФП на опухолевых клетках и конкурирует с целым белком АФП за сайт связывания.

Пример 4. Исследование гормонзависимой активности нового пептида.

Клетки MCF-7 высевали в 96-луночные планшеты с плотностью 4×10⁵ клеток/лунку. На следующий день меняли среду на DMEM без фенолового красного с добавлением 5% телячьей сыворотки и инкубировали клетки в стандартных условиях до достижения плотного монослоя (4 суток). Далее к клеткам добавляли гормон 17 β-эстрадиол (E₂) в концентрации 10^-9 М, рер-АФП и АФП (оба в концентрациях 10^-11-10^-6 М). Через 3 суток в лунки вносили [³Н]-тимидин (1 мкCi/мл, удельная активность 50 Ci/ммоль) на 2 часа, после чего клетки собирали на фильтры и измеряли радиоактивность на жидкостном сцинтилляционном счетчике RackBeta. Через 72 часа инкубирования для стимуляции пролиферации клеток, ее оценивали по включению [³H]-тимидина в ДНК. Пролиферация составляла в среднем 165% от контроля (контроль - 100%). При одновременном с E₂ добавлении к клеткам АФП или рер-АФП в диапазоне концентраций 10^-11-10^-6 М включение [³H]-тимидина значительно снижалось (117±5.85% для АФП и 120±4.8% для рер-АФП), как показано на фиг.6.

Таким образом, рер-АФП ингибирует 17 β-эстрадиол-индуцированный рост гормонзависимой линии клеток MCF-7.

Пример 5. Получение конъюгата рер-АФП с паклитакселом.

0.63 мг паклитаксела и 1.2 мг N,N-карбонилдиимидазола смешивали в 20 мкл диметилформамида. Раствор выдерживали 20 мин при 55°С, затем добавляли при перемешивании к 1 мл раствора рер-АФП (2 мг) в фосфатно-солевом буфере (PBS), рН 7.4. Реакционную смесь выдерживали в течение ночи при комнатной температуре, затем центрифугировали в течение 5 мин при 13 400 об/мин. Супернатант отделяли и наносили на хроматографическую колонку с носителем Sephadex G-25f, уравновешенную PBS. Фракции, содержащие конъюгат, собирали и концентрировали до конечного объема 1 мл. Для определения молярного соотношения рер-АФП/паклитаксел отдельно определяли концентрацию каждого компонента конъюгата. Концентрацию рер-АФП в конъюгате определяли по методу Лоури. Для определения содержания паклитаксела в конъюгате аликвоту концентрата переносили в 0.2 М раствор ацетата натрия, рН 4.0, и выдерживали 48 ч при комнатной температуре. В данных условиях паклитаксел полностью отделялся от белка и выпадал в осадок. Выпавший паклитаксел экстрагировали хлороформом и высушивали на воздухе. Сухое вещество растворяли в ацетонитриле и проводили количественное определение паклитаксела с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии. Молярное соотношение рер-АФП/паклитаксел в полученном конъюгате составляло 1:1.

Испытания противоопухолевой активности были проведены на моделях и подтверждаются следующими примерами.

Пример 6. Эффективность конъюгата рер-АФП с паклитакселом в отношении клеток карциномы молочной железы линии MCF-7.

Клетки культивировали в пластиковых флаконах ("Costar") в среде RPMI ("Sigma"), содержащей 10% эмбриональной бычьей сыворотки ("Sigma"), 100 ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина, в увлажненной атмосфере 5% CO₂ при 37°С. Клетки рассевали в 96-луночные планшеты (Costar) по 10 тысяч клеток/лунку, добавляя исследуемые препараты в различных концентрациях, и инкубировали 72 ч. За 2-4 ч до окончания инкубации в каждую лунку добавляли по 50 мкл раствора (1 мг/мл) МТТ (3-[4,5-диметилтиазол-2-ил]-2,5-дифенилтетразолия бромид, Sigma) в среде для культивирования клеток. После развития окраски среду удаляли, растворяли кристаллы формазана в 150 мкл диметилсульфоксида и спектрофотометрически измеряли интенсивность окраски по поглощению при 540 нм. Выживаемость клеток, подвергшихся воздействию паклитаксела и конъюгата, оценивали в процентах, принимая за 100% выживаемость контрольной культуры.

Значения IC₂₀ составляли 21 нМ для свободного паклитаксела и 13 нМ для конъюгата. Из представленных данных следует, что предлагаемый конъюгат рер-АФП с паклитакселом оказывает значительно более высокое цитотоксическое действие в отношении опухолевых клеток дикого типа, чем свободный препарат паклитаксела.

Аналогичные исследования были проведены с каждым веществом из группы: доцетаксел, доксорубицин, дауномицин, карминомицин, винкристин, винбластин, мелфалан, метотрексат, цитарабин.

При использовании нового пептидного препарата и его конъюгата был разработан способ лечения злокачественных опухолей, при этом экспериментальным животным с гормонзависимыми опухолями вводили наш противоопухолевый пептидный препарат или его конъюгат с цитотоксическим агентом. Для лечения использовали также фармацевтическую композицию, охарактеризованную выше, в эффективном для терапевтического результата количестве. При терапии дополнительно можно вводить адъюванты, иные противоопухолевые препараты, различные иммуномодуляторы или антиангиогенные средства. В качестве иммуномодуляторов можно применять интерферон-α, интерферон-γ, интерлейкин-2, интерлейкин-4, интерлейкин-6, интерлейкин-12, полиоксидоний, в качестве антиангиогенных средств - ангиостатин, эндостатин, талидомид, витаксин, пентозан, сурамин, фумагиллин, скволамин, комбретастатин, приномастат, маримастат, неовастат.

Пример 7. Противоопухолевая активность конъюгата рер-АФП-паклитаксел на модели перевиваемых опухолей мышей.

Для сравнительной оценки терапевтической активности конъюгата рер-АФП-паклитаксел в отношении солидных опухолей, полученных подкожным введением мышам опухолевых клеток линии В 16 использовали внутривенный способ введения нашего конъюгата. Препараты вводили в дозах 0,2 мкг/кг по паклитакселу по схеме один раз в 2 дня, всего пять инъекций, начиная с 3-го дня после прививки опухоли. Данные об ингибировании роста опухолей у мышей при введении препаратов представлены на фиг.7. Как видно из чертежа, конъюгат, в отличие от свободного паклитаксела, значительно замедлял время появления опухолей и скорость их роста. Кроме того, введение конъюгата увеличивало среднюю продолжительность жизни животных на 37%.

Таким образом разработана полная система, предназначенная для лечения гормонзависимых опухолей, на основе пептидного фрагмента АФП, содержащая новый пептидный препарат, его конъюгат с цитотоксическим агентом, фармацевтическую композицию и способ лечения. Разработанная система против гормонзависимых опухолей весьма избирательна и эффективна в отношении злокачественных клеток.

ЛИТЕРАТУРА

1. Yang F. et al., Nucleic Acids Res. 13: 8007-8017, 1985.

2. Deutsch H.F. et al., Adv. Cancer Res. 56: 253-312, 1991.

3. Hisa J. et al., J. Biol. Chem. 255: 4224-4227, 1980.

4. Dudich E. et al., Eur. J. Biochem. 266: 750-761, 1999.

5. Mizejewski G., Proc. Soc. Exp.Biol. Med. 215: 333-362, 1997.

Изобретение относится к области медицины и биотехнологии. Разработан противоопухолевый пептидный препарат, представляющий собой фрагмент альфа-фетопротеина (АФП) человека, с аминокислотной последовательностью, представленной в описании на (фиг.1), имеющий в первичной структуре 243 аминокислотных остатка и М.м. около 27 кДа, способный связываться с рецептором АФП и ингибировать эстрадиол-индуцированный рост клеток гормонзависимых опухолей, а также выполнять функцию векторной молекулы для доставки цитотоксического препарата в опухолевые клетки. Препарат получен культивированием клеток Е. coli, трансформированных плазмидным вектором, содержащим кДНК гена третьего домена АФП человека. Пептидный продукт модифицирован добавочным метиониновым остатком (Met) на N-конце и двумя аминокислотными остатками (Leu-Glu) на С-конце. Другими объектами изобретения являются конъюгат пептидного препарата и цитотоксического агента, фармацевтическая композиция и способ лечения. Конъюгат в качестве цитотоксического агента содержит вещество, выбранное из группы: паклитаксел, доцетаксел, доксорубицин, винбластин, дифтерийный токсин, рицин и др. Способ лечения заключается во введении пациенту конъюгата или композиции в эффективном количестве. Технический результат - повышение эффективности и избирательности при лечении гормонзависимых опухолей. 4 н. и 3 з.п. ф-лы, 7 ил.

1. Противоопухолевый пептидный препарат на основе фрагмента альфа-фетопротеина (АФП) человека, представляющий собой пептид с аминокислотной последовательностью, представленной на фиг.1, имеющий в первичной структуре 237 аминокислотных остатка и молекулярную массу около 27 кДа, способный связываться с рецептором альфа-фетопротеина и ингибировать эстрадиол-индуцированный рост клеток гормонзависимых опухолей, а также выполнять функцию векторной молекулы для направленной доставки цитотоксического препарата в опухолевые клетки.2. Препарат по п.1, отличающийся тем, что может быть получен рекомбинантным методом при культивировании клеток Е. coli, трансформированных плазмидным вектором, содержащим кДНК гена третьего домена альфа-фетопротеина человека; полученный пептидный продукт модифицирован добавочным метиониновым остатком (Met) на N-конце и двумя аминокислотными остатками (Leu-Glu) на С-конце.3. Конъюгат пептидного препарата и цитотоксического агента, способный целенаправленно проникать в опухолевую клетку, представляющий собой препарат, охарактеризованный в п.1 или 2, ковалентно связанный с цитотоксическим агентом в молярном соотношении от 1:1 до 1:10.4. Конъюгат по п.3, который в качестве цитотоксического агента содержит вещество, выбранное из группы паклитаксел, доцетаксел, доксорубицин, дауномицин, карминомицин, винкристин, винбластин, мелфалан, метотрексат, цитарабин.5. Фармацевтическая композиция, обладающая противоопухолевым действием, содержащая противоопухолевый компонент и подходящий для внутривенного введения фармацевтический носитель, отличающаяся тем, что в качестве противоопухолевого компонента содержит препарат, охарактеризованный в пп.1 и 2 или конъюгат, охарактеризованный в пп.3 и 4, в эффективном количестве.6. Способ лечения злокачественных опухолей, включающий введение противоопухолевого агента, отличающийся тем, что пациенту с гормонзависимой опухолью вводят фармацевтическую композицию, охарактеризованную в п.5, в эффективном количестве.7. Способ лечения по п.6, отличающийся тем, что пациенту дополнительно вводят адъюванты, иные противоопухолевые препараты, иммуномодуляторы, или антиангиогенные средства.