СПОСОБ ОТБОРА ЛЕКАРСТВЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ ДЛЯ КОРРЕКЦИИ НАРУШЕНИЙ ИММУННОГО СТАТУСА ПРИ ОПУХОЛЕВОЙ БОЛЕЗНИ Российский патент 1999 года по МПК G01N33/49 

Изобретение относится к биологии и медицине, и его результаты могут быть использованы для диагностики и коррекции различных типов взаимоотношений между целостным макроорганизмом и какой-либо его структурой, на территории которой сложилась иммуноконфликтная ситуация. Предлагаемый способ может быть успешно использован при диагностике и индивидуальном подборе лекарственных средств для общего и местного лечения широкого спектра заболеваний современного человека, характеризующихся выраженным иммунопатогенезом (среди которых особое место занимают опухолевые процессы различной локализации и генеза, аутоиммунные заболевания, хронические и персистентные формы инфекций, в том числе и иммунного бесплодия, а также в процессе пре- и посттрансплантационного мониторинга).

Следует особо подчеркнуть, что ключевым моментом исследования является одновременное тестирование явления иммунного воспаления как одного из аспектов реализации общего состояния макроорганизма, учитываемого по иммунологическим параметрам периферической крови, и функционирования на его фоне собственно иммуноконфликтной структуры. О состоянии последней можно судить либо непосредственно при аналитическом исследовании соответствующих клеточных образований, либо опосредованно по наличию и определению функциональной активности иммуноцитов, присутствующих in situ. При этом особый случай представляет опухолевая болезнь, когда исследуют влияние широкого спектра фармакологических препаратов и других лечебных воздействий на аутологичную опухолевую ткань с целью исключения веществ и влияний, способных стимулировать ее пролиферацию in vivo. Решение этой задачи позволит по данным лабораторного исследования прогнозировать возможность возникновения отрицательных реакций со стороны иммуноконфликтной ткани на различные компоненты предполагаемого общего лечения.

В доступной литературе авторам не удалось обнаружить аналога/ов предлагаемого способа. Необходимо отметить, что в специализированных изданиях имеются описания некоторых подходов, используемых для прогнозирования реакции собственно опухоли либо иммуннокомпетентных клеток на лекарственные и другие воздействия. По нашим данным, в литературе отсутствуют сведения о способах интегральной одновременной оценки вышеуказанных явлений у конкретного больного, которые могли бы служить основой для назначения индивидуально обоснованного лечения.

Что касается известных методов диагностики и прогнозирования поведения аутологичной опухоли, то большинство из них базируются на изучении синтеза (репликации) ДНК, ибо гибель клеток, вызываемая большинством химиотерапевтических препаратов, обусловлена нарушением структуры ДНК. При этом независимо от механизма действия повреждающего агента, если клетки чувствительны к нему (! ), это проявляется в виде подавления репликации ДНК. Метод состоит в том, что через 4 суток инкубации тестируемые с интересующим цитостатическим препаратом опухолевые клетки (различные саркомы) и контрольные нормальные фибробласты метили 3H-тимидином и по уровню его включения в ДНК судили об интенсивности ее репликации по сравнению с исходным уровнем и уровнем контрольной культуры. В суспензии клеток 18 из 23 разных опухолей включение не превышало 300 импульсов/мин/чашку, когда включение в нормальные фибробласты составило всего 97 имп/мин/чашку. Чувствительность к адриамицину, 5-фторурацилу, цисплатине, винкристину и др., измеренная радиометрически, в 54 из 61 случая совпадала с результатами определения чувствительности по выживаемости (снижение включения на 60% и более и уменьшение числа выросших колоний на 70% и более). При сравнении кривых доза-эффект совпадение было еще больше - 95%.

Принципиальным недостатком приводимого способа является отсутствие одновременного исследования влияния исследуемых in vitro препаратов на клеточное звено иммунного ответа. Что лишает возможности выбора тех из них, которые, наряду с выраженным цитотоксическим влиянием на аутологичную опухолевую ткань, обладают наименьшим иммунотоксическим эффектом. Этот способ также не предусматривает испытание иммунотропных веществ, используемых у опухолевых больных для коррекции опухольассоциированного иммунодефицита (интерферонов и других медиаторов иммунного ответа), необходимого для исключения их возможного опухольстимулирующего действия.

Следует отметить, что предлагаемая технология лабораторного определения чувствительности перерожденных клеток к различным цитостатикам не пригодна для массового скрининга ввиду дороговизны и длительности воспроизведения.

Наиболее близким по технической сущности является способ определения состояния макроорганизма, включающий исследование иммунокомпетентных клеток из периферической крови, вначале изолированных, а затем в естественных (в присутствии белокассоциированной и безбелковой фракции нативной аутологичной плазмы, а также других клеток лейкоконцентрата) и искусственных (в присутствии гормональных, противовоспалительных, иммуномодулирующих препаратов) микроокружений с последующей совместной компьютерной и программной оценкой всех регистрируемых показателей, что позволяет формулировать индивидуальные показания и противопоказания к различным компонентам предполагаемого комплексного лечения. Использование этого способа позволяет по параметрам изолированных иммунокомпетентных клеток (эффекторов специфического иммунитета: T- и B-лимфоцитов, иммунорегуляторных клеток и эффекторов системы естественной резистентности: гранулоцитарных лейкоцитов и моноцитов/макрофагов), получаемых из периферической крови, и изменению их поведения в моделируемых in vitro естественных и искусственных микроокружениях диагностировать наличие, выраженность и пути реализации иммунного воспаления, с вычленением иммунных реакций, направленных против собственных клеточных образований, и определять способы их купирования.

Но цитируемый способ не позволяет прогнозировать поведение клеточных элементов, реализующих выраженное иммунное воспаление в иммуноконфликтной области, и тем более прогнозировать изменение жизнедеятельности опухолевой ткани, так как он не предполагает лабораторные манипуляции с ними в in vitro условиях. То есть цитируемый способ не позволяет прогнозировать возможность возникновения отрицательных реакций со стороны иммуноконфликтной ткани на те или иные компоненты общего комплексного лечения. В связи с вышеуказанными обстоятельствами анализируемый способ недостаточен для решения задачи совместной оценки многоплановых взаимоотношений, имеющих место между макроорганизмом пациента и его иммуноконфликной тканью, определяющих особенности патогенеза заболевания либо конкретного состояния.

В доступной литературе, к сожалению, нам не удалось найти описания способа, который бы ставил цель, близкую к сформулированной нами.

Настоящее изобретение направлено на создание способа тестирования и индивидуализации коррекции состояния макроорганизма, содержащего иммуноконфликтную ткань, для тех случаев, когда функционирование иммуноконфликтной ткани является определяющим фактором иммунопатогенеза.

Задача состоит в том, чтобы в процесс диагностики, наряду с общими показателями иммунного воспаления, вовлечь сущностные для нее параметры иммуноконфликтной ткани, совместная оценка которых позволила бы оценить характер динамического взаимодействия целостного макроорганизма с его иммуноконфликтной областью. Следует подчеркнуть, что в роли последней может выступать любое образование, включенное в структуру макроорганизма и образующее с ним целостность более высокого уровня организации. В качестве примера можно привести развивающееся новообразование и организм-опухоленоситель, взаимодействующие посредством онкологического статуса - характерных и индуцированных присутствием опухоли многоплановых изменений в метаболизме, иммунном и гормональном гомеостазе и т.д. Как пример иммуноконфликтной микросистемы, лишенной признаков злокачественного перерождения, можно привести заселение аутоагрессивными лимфоцитами пространства ликвора, ассоциированное с поражениями центральной нервной системы различной этиологии (туберкулезным менингитом, вирусным арахно-энцефалитом и т.д.). В перечне такого рода примеров следует также упомянуть аутоиммунные процессы в репродуктивных органах, особенно в яичках, являющихся, как и мозг, забарьерной тканью. В этом случае в роли клеточных реализаторов иммунного воспаления, приводящего к иммунному бесплодию, выступают иммуноциты и различные индуцируемые ними медиаторы, которые и формируют необходимое для их функционирования микроокружение. В соответствии с этой логикой можно оценивать и посттрансплантационные локальные и общие реакции на аллотрансплантат.

Выполнение этой задачи при современном уровне техники в данном вопросе возможно при воспроизведении в in vitro условиях на клеточном уровне физической модели иммунокомпетентной сферы и иммуноконфликтной области макроорганизма, расшифровать их взаимные влияния, определив носителей иммунного воспаления (клетки, компоненты биологических сред), и путем in vitro апробации эффекта различных фармакологических препаратов и других лечебных манипуляций на иммуноциты периферической крови и иммуноциты либо клетки иммуноконфликтной ткани, смоделировать именно те искусственные микроокружения, которые позволят снизить и в конечном итоге полностью блокировать реакции макроорганизма, поддерживающие иммуноконфликтную локальную ситуацию in vivo.

Реализация данного изобретения позволит получить лабораторную диагностику взаимоотношений, сложившихся между макроорганизмом и иммуноконфликтной тканью, посредством иммунологических и показателей пролиферации испытуемой иммуноконфликтной ткани при широком спектре заболеваний и состояний человека, в патогенезе которых значительно увеличен удельный вес аутоиммунных реакций, при этом особое место занимает опухолевая болезнь.

Для решения поставленной задачи предложен способ диагностики и индивидуальной корреции состояния макроорганизма, содержащего иммуноконфликтную ткань, включающий исследование иммунокомпетентных клеток из периферической крови, вначале изолированных, а затем в естественных (белокассоциированная и безбелковая фракции нативной аутологичной плазмы и другие клетки лейкоконцентрата) и искусственных в присутствии гормональных, противовоспалительных, иммуномодулирующих препаратов) микроокружений, в котором, согласно изобретению, одновременно с исследованием периферической крови определяют параметры иммуноконфликтной ткани, или иммуноцитов, получаемых in situ, а именно: 1) в случае опухолевой болезни - уровень синтеза ДНК в изолированных клетках новообразования, а затем при внесении факторов естественных (белокассоциированная и безбелковая фракции нативной аутологичной плазмы) и искусственных микроокружений (различных доз гормональных, противовоспалительных, иммуномодулирующих и цитостатических препаратов); 2) в случае иммуноконфликтной ткани, лишенной признаков злокачественного перерождения - способность изолированных иммуноцитов, инфильтрировавших эту ткань, взаимодействовать с мембранассоциированными структурами аутологичных тканей, например, представленных на поверхности собственных эритроцитов, сперматозоидов и т. д., а затем при внесении факторов естественных (например, белокассоциированная и безбелковая фракция аутологичного ликвора, части собственного эякулята и т. д.) и искусственных (различных доз гормональных, противовоспалительных, иммуномодулирующих и цитостатических препаратов) микроокружений. При этом все полученные параметры оцениваются совместно с полученными иммунологическими показателями периферической крови при помощи компьютерной обработки и программного обеспечения, и по результатам интегральной оценки всех вышеуказанных параметров' назначается индивидуально обоснованное комплексное лечение, в котором, кроме гормональных, противовоспалительных и иммуномодулирующих препаратов, используются цитостатики.

Благодаря отличительным признакам, а именно включению информации о взаимоотношениях иммуноконфликтной ткани с макроорганизмом в процесс диагностики, предлагаемый способ позволяет оценивать не только общую реакцию на проводимое лечение, но и назначать индивидуально обоснованную и поэтому оптимизированную терапию, адекватную конкретному состоянию макроорганизма и его иммуноконфликтной ткани.

Насколько известно авторам, пока не существует литературного источника, где бы параметры иммуноконфликтной ткани вообще использовались в контексте оценки состояния пациента, поскольку взаимоотношения макроорганизма и включенной в него иммуноконфликтной ткани еще недостаточно изучены и не применяются в практике клинического ведения больных.

Способ осуществляется следующим образом.

У пациента забирают:
1) 15 мл венозной периферической крови, которую стабилизируют 2,7% раствором NaЭДТА (трилон Б) в соотношении 1:10;
2) материал иммуноконфликтной области макроорганизма:
- биоптат опухолевой ткани либо любой другой интересующей ткани/органа;
- аспирационный биоптат трансплантированного органа;
- ликвор в количестве, как минимум, 1-2 мл;
- эякулят в количестве, как минимум, 1-2 мл.

Обработка периферической крови. Из 10 мл крови в стандартном градиенте плотности фиколл-верографина (1.076-1078) выделяют пул мононуклеарных клеток, из которых инкубацией на пластиковых поверхностях удаляют прилипающие клетки (моноциты/макрофаги). Из оставшейся крови (5 мл) отбирают максимально освобожденный от эритроцитов и плазмы лейкоконценрат (около 2 мл), клетки которого отмывают от жидкой части плазмы трехкратным центрифугированием с физиологическим растворим. Половину отобранной жидкой части плазмы пропускают через фильтры с диаметром пор 0,17 ммк (нарезанных из диализных колонок аппарата "искусственной почки") и таким образом отделяют безбелковую фракцию от белокассоциированной.

In vitro традиционными методами определяют способность выделенных лимфоцитов участвовать в феномене Е- и ЕАС-розеткообразования, розеткообразовании с аутологичными эритроцитами и Е-розеткообразовании лимфоцитов, после прединкубации с теофиллином; показатели НСТ-спонтанного и индуцированного LPS ("Sigma") теста нейтрофилов и моноцитов; активность естественных киллерных клеток и способность трансформироваться в бласты при внесении различных митогенов. Все указанные реакции проводят в соответствии с рекомендациями, описанными в способе-прототипе.

I. - НСТ-спонтанный и индуцированный тетст нейтрофилов и моноцитов, учитываемый в лейкоконцентрате (естественном клеточном, гуморальном и пространственном микроокружениях).

II. - Е-розеткообразование (экспрессия характерных Т-клеточных маркеров):
а) изолированных лимфоцитов (процентное и абсолютное содержание Е-розеткообразующих клеток);
б) прединкубированных с теофиллином лимфоцитов лейкоконцентрата Т-хелперные и Т-супрессорные клетки (процентное и абсолютное содержание и их соотношение);
в) в присутствии других клеток лейкоконцентрата (определяют отклонение от а);
г) в присутствии безбелковой фракции нативной аутологичной плазмы (в качестве эффекторных клеток используют изолированные лимфоциты и клетки лейконконцентрата) определяют отклонение от а и в);
д) в присутствии белокассоциированной фракции аутоплазмы (в качестве эффекторных клеток используют изолированные лимфоциты и клетки лейкоконцентрата, определяют отклонение от а и в).

III. - ЕАС-розеткообразование (экспрессия характерных В-клеточных маркеров):
а) изолированных лимфоцитов (определяют процентное и абсолютное содержание ЕАС-розеткообразующих клеток);
б) в присутствии других клеток лейконконцентрата (определяют отклонение от а);
в) в присутствии безбелковой фракции нативной аутоплазмы определяют отклонение от а и б (в качестве эффекторных клеток используют изолированные лимфоциты и клетки лейкоконцентрата);
г) в присутствии белокассоциированной фракции нативной аутоплазмы (определяют отклонение от а и б, эффекторные клетки - изолированные лимфоциты и лейкоконцентрат).

IV. - Розеткообразование с аутологичными эритроцитами (АуГемРОК):
а) изолированных лимфоцитов (определяют процентное и абсолютное содержание АуГем-розеткообразующих клеток);
б) в присутствии других клеток лейкоконцентрата (определяют отклонение от а);
в) в присутствии безбелковой фракции нативной аутоплазмы (определяют отклонение от а и б, эффекторные клетки - изолированные лимфоциты и клетки лейкоконцентрата);
г) в присутствии белокассоциированной фракции нативной аутоплазмы (определяют отклонение от а и б, эффекторные клетки - изолированные лимфоциты и клетки лейкоконцентрата).

V. - Определение Е-розеткообразования лимфоцитов лейкоконцентрата в с присутствии иммунотропных препаратов * (прединкубация с препаратом длится в течении 30 минут при 36,7^oC):
- терапевтическая доза индометацина;
- терапевтическая доза дексазона;
- субтерапевтическая (0,1 терапевтической) и терапевтическая дозы интерферона.

VI. - Определение розеткообразования лимфоцитов с аутологичными эритроцитами согласно условий этапа V.

VII. - Определение естественной киллерной активности (против аутологичных опухолевых клеток, при отсутствии последних в качестве мишеневых можно использовать клетки перевиваемой линии человеческого миелолейкоза - К-562):
а) изолированных лимфоцитов;
б) в присутствии белокассоциированной фракции нативной аутоплазмы (определяют отклонение от а);
в) в присутствии безбелковой фракции нативной аутоплазмы (определяют отклонение от а).

VIII. - Реакция бласттрансформации лимфоцитов на Т-клеточный митоген (например, фитогемагглютинин, ФГА, SERVA, 30 мкг/мл) и преимущественно В-клеточный митоген (например, липополисахарид, LPS, SIGMA, 100 мкг/мл):
а) изолированных лимфоцитов (учет уровня синтеза ДНК в лимфоцитах по включению 3H-тимидина);
б) в присутствии безбелковой фракции нативной аутоплазмы (определяют отклонение от а);
в) в присутствии белокассоциированной фракции нативной аутоплазмы (определяют отклонение от а);
г) внесение в тест-системы кроме фитогемагглютинина различных иммунотропных препаратов* (согласно этапу V).

* В зависимости от заказа лечащих врачей в схему тестирования вносятся и другие препараты - различные гормоны, например инсулин, глюкагон, кортизол; традиционные иммуномодуляторы - лимфо- и монокины, например интерлейкин-2, гранулоцитарный и макрофагальный колониестимулирующие факторы роста, опухоленекротический фактор и т.д.; антибиотики; цитостатики, внесение которых обязательно при диагностике опухолей болезни и т.д.

Исследование иммунологических параметров периферической крови может быть проведено по двум схемам:
1) короткой, занимающей 4-6 часов рабочего времени, для воспроизведения которой необходимы условия стандартной клинической лаборатории и персональный компьютер для программного построения текста заключения;
2) расширенной, требующей для полного цикла исследования 3-е суток, специальные помещения для работы в стерильных условия и с источниками ионизирующих излучений (стерильный радиоблок) и персональный компьютер для программного построения текста заключения.

Обработка иммуноконфликтной ткани.

Материал для исследования из области иммуноконфликтной ткани может быть получен в следующих видах:
1) собственно материала иммуноконфликтной ткани, например биоптата аутологичной опухоли или опухолевого выпота, обнаруживаемого в полости плевры, брюшины, в ликворе и т.д.; клеточного содержимого эякулята, желчи, мочи;
2) пула иммунокомпетентных клеток, реализующих иммунное воспаление in situ, например лимфоцитов и других клеток крови, реализующих иммунное воспаление в центральной нервной системе и обнаруживаемых в ликворе; тех же клеток, получаемых методом аспирационной биопсии из аллотрансплантированной почки или другого органа и т.д.

Исследование аутологичной опухолевой ткани.

Исследование проводится с целью выяснения биологических особенностей аутологичной опухолевой ткани по определению уровня синтеза ДНК (интенсивности репликации), о котором судят, учитывая скорость включения 3H-тимидина в ДНК культивируемых на протяжении 20 часов аутологичных опухолевых клеток.

Для культивирования использовали 96-луночные плоскодонные планшеты ("LIMBRO") с объемом лунки 0,3 мл. В каждой лунке культивировали 0,033 х 10 клеток в 0,1 мл культуральной среды, состоящей из фирменной среды RPM1 1640 и 0,01 М фирменного буфера HEPES. Удельная активность ³H-тимидина составила 10-мки/мл. Каждую пробу разливали в триплет. По истечениb срока культивирования содержимое лунок переносили на фильтры для бета-счета.

Учитывали:
а) исходную интенсивность синтеза ДНК в суспензионной культуре выделенных опухолевых клеток;
б) этот же параметр при внесении белокассоциированной фракции нативной аутологичной плазмы (определяли отклонение от а);
в) этот же параметр при внесении безбелковой фракции нативной аутологичной плазмы (определяли отклонение от а);
г) при наличии жидкой части среды обитания опухолевых клеток (например, жидкой части асцита, плеврита, ликвора и т.д.) ее разделяли на фильтрах на белокассоциированную и безбелковую фракции, аналогично тому, как это делали для жидкой части плазмы, и определяли влияние полученных фракций на исходную интенсивность синтеза ДНК в аутологичных опухолевых клетках по отклонению от а);
д) одновременно в параллельных пробах учитывали уровень репликации ДНК тестируемых клеток в присутствии вышеуказанных иммунотропных и цитостатических препаратов, действующих на все фазы клеточного цикла, например на G1 - митомицин, G1 - S - 5-фторурацил, S - G2 - метатрексат, G2 - циклофосфамид, M - винкристин и т.д.

Исследование пула иммунокомпетентных клеток, полученных из области иммуноконфликтной ткани.

Исследование проводили с целью выяснения способности и интенсивности взаимодействия иммуноцитов с мембранассоциированными структурами тестовых аутологичных клеток, в роли которых в подавляющем большинстве случаев использовались аутологичные эритроциты, но при возможности получения других мишеневых клеток, например сперматозоидов эякулята при обследовании пациентов с аутоиммунным мужским бесплодием, использовались именно эти клетки в качестве тестовых.

Учитывали:
а) способность выделенных из области иммуноконфликтной ткани иммуноцитов участвовать в розеткообразовании с аутологичными тестовыми клетками (например, с аутологичными эритроцитами, сперматозоидами), определяли процентное содержание розеткообразующих клеток;
б) изменение этого показателя в присутствии белокассоциированной фракции нативной аутологичной плазмы (определяли отклонение от а);
в) изменение этого показателя в присутствии безбелковой фракции нативной аутологичной плазмы (определяли отклонение от а);
г) при наличии жидкой части среды обитания иммуноцитов иммуноконфликтной ткани (например, жидкой части ликвора, эякулята и т.д.) ее разделяли на фильтрах на белокассоциированную и безбелковую фракции, аналогично тому, как это делали для жидкой части плазмы, и определяли влияние полученных фракций на исходную способность участвовать в розеткообразовании с аутологичными тестовыми клетками (и определяли отклонение зарегистрированных показателей от а).

Способ испытан на культурах клеток больных с опухолями прямой кишки, мозга, мочевого пузыря, легких, а также больных с различными поражениями центральной нервной системы, с аутоиммунным бесплодием.

Диагностированные состояния макроорганизма, содержащего иммуноконфликтную ткань, и рекомендации по их коррекции, полученные после компьютерной обработки, подтверждаются клиническими наблюдениями и контрольными лабораторными исследованиями.

Источники информации, принятые во внимание при составлении заявки:
1. Friedman H.M., Glaubiger D.L. Assessment of in drugs sensitivity of human tumor cells ising ³H-thymidine incorporation in a modified human tumor stem cell assay. Cancer Res. 1982. v. 42. N 11. p. 4683 - 4689.

Изобретение относится к медицине. Изобретение может быть использовано при диагностике и индивидуальном подборе лекарственных средств для общего и местного лечения широкого спектра заболеваний и состояний человека, характеризующихся наличием иммуноконфликтной ткани. Сущность изобретения: в способе отбора лекарственных препаратов для коррекции нарушений иммунного исследования периферической крови, в течение которого исследуются иммунокомпетентные клетки из периферической крови, в присутствии гормональных, противовоспалительных, иммуномодулирующих и цитостатических препаратов, получают культуру клеток из аутологичного новообразования и исследуют уровень синтеза ДНК, способность иммуноцитов крови взаимодействовать с мембранассоциированными структурами аутологичных тканей, и по изменению чувствительности культур тканей к гормональным, противовоспалительньм, иммуномодулирующим и цитостатическим препаратам выбирают препараты для лечения больного.

Способ отбора лекарственных препаратов для коррекции нарушений иммунного статуса при опухолевой болезни, путем иммунологического исследования периферической крови, в течение которого исследуются иммунокомпетентные клетки из периферической крови, в присутствии гормональных, противовоспалительных, иммуномодулирующих и цитостатических препаратов, отличающийся тем, что получают культуру клеток из аутологичного новообразования и исследуют уровень синтеза ДНК, способность иммуноцитов крови взаимодействовать с мембранассоциированными структурами аутологичных тканей, и по изменению чувствительности культур тканей к гормональным, противовоспалительным, иммуномодулирующим и цитостатическим препаратам выбирают препараты для лечения больного.