ИММУНОМОДУЛЯТОР И ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ, ОБЛАДАЮЩАЯ ПРОТИВООПУХОЛЕВОЙ АКТИВНОСТЬЮ Российский патент 1998 года по МПК A61K38/05 

Изобретение относится к медицине, в частности касается препаратов, которые позволяют производить коррекцию иммунитета живого организма и представляют собой высокоэффективные иммуномодуляторы.

В настоящее время в комплексной терапии опухолевых заболеваний большое внимание уделяется реактивации естественных защитных реакций организма. С этой целью используются препараты, способные усиливать противоопухолевый ответ - иммуномодуляторы. Среди большого числа эндогенных и экзогенных иммуномодуляторов особое место занимает N-ацетил-муромил-L-аланин-D-изоглютамин (мурамилдипептид МДП).

Известно, что мурамилдипептид способен активировать основные звенья иммунитета, в частности противоопухолевого ответа. Но, обладая высокой гидрофильностью, он быстро выводится из организма, а также обладает довольно высокой пирогенностью. Липофильные производные МДП как правило эффективнее стимулируют туморостатическую и тумороцидную активность макрофагов, длительнее задерживаются в организме и обладают меньшей пирогенностью.

Задачей настоящего изобретения является поиск веществ, эффективных для коррекции иммунитета в случаях серьезных иммунодефицитов и представляющих собой иммуномодуляторы.

В научно-технической литературе известно и описано химическое соединение β- гептилгликозид-N-ацетилмурамил-L-аланил-D-изоглутамин (β- гептилгликозид - МДП, C₇H₁₅ МДП)

(XV Украинская республиканская конференция по органической химии. Тезисы доклада (Ужгород, 1986 г., стр. 409).

Поставленная задача решена тем, что предложена группа изобретений, объединенных общим изобретательским замыслом.

В качестве иммуномодулятора предлагается применение по новому назначению β- гептилгликозид-МДП/C₇H₁₅ МДП/.

На основе данного иммуномодулятора создана фармацевтическая композиция, обладающая противоопухолевой активностью, включающая эффективное количество активного соединения β- гептилгликозид-МДП C₇H₁₅-МДП и фармацевтически приемлемый наполнитель.

Фармацевтическая композиция предназначена для внутривенного введения и содержит активное соединение в дозе от 0,0001 до 30 мг/кг веса. При этом композиция может быть в липосомальной форме при содержании активного соединения в дозе от 0,0001 до 10 мг/кг веса.

Фармацевтическая композиция может быть выполнена в форме для перорального введения и содержит активное соединение в дозе от 0,001 до 100 мг/кг веса.

Экспериментальные исследования показали, что амфильный препарат -гептилгликозид-МДП/C₇H₁₅ МДП/ активирует in vitro основные звенья иммунитета эффективнее МДП и ряда производных, в том числе липофильного гомолога β- гексадецилгликозид-МДП/C₁₆H₃₃ МДП/. Это обусловлено преимуществами амфифильного препарата в проникновении через биологические мембраны и особенностями внутриклеточного движения. Положительные результаты исследований активности C₇H₁₅ МДП in vivo как стимулятора противоопухолевого ответа на мышиных моделях меланомы и лимфоны, а также его низкая токсичность свидетельствует о целесообразности использования этого производного МДП в клинике. Амфифильность является важным качеством производного МДП, позволяющим ему активно проникать через биологические мембраны и влиять на цитоплазматические события, ведущие к активации лимфоцита и макрофага. Амфифильный препарат имеет преимущества над известными за рубежом липофильными дериватами, такими как мурамилтрипептид-фосфатидилэтаноламин(МТП-ФЭ), МДП-глицеролдипальмитат (МДП-ГПД), МТП-холестерол (МТП-Хол), В-30-МДП, тем, что он лучше растворим в водных растворах, что расширяет формы его применения. При этом, обладая определенной липофильностью, он может быть эффективно включен в такие носители, как липосомы, распределяясь и в водной, и в липофидной фазе, а при применении в чистом виде он не будет выводиться быстро из организма, как немодифицированный МДП и его гидрофильные аналоги.

Результаты исследования биологической активности C₇H₁₅ МДП
1. Иммуномодулирующая активность производных МДП in vitro.

Во всех тест-системах in vitro действие амфифильного препарата сравнивалось с активностью липофильного гомолога C₁₆H₃₃ МДП и немодифицированного МДП в эквимолярных концентрациях.

Табл. 1. Действие производных МДП на пролиферацию лимфоцитов в смешанной культуре лимфоцитов (СКЛ).

Цифры в таблице представляют собой индексы пролиферации лимфоцитов в СКЛ (среднее арифметическое ± стандартное отклонение).

Табл. 2. Действие производных МДП на липополисахаридиндуцированную пролиферацию мышиных спленоцитов.

Цифры в таблице представляют собой индексы пролиферации лимфоцитов в ответ на стимуляцию 1 мкг/мл липополисахарида под воздействием производных МДП (среднее арифметическое ± стандартное отклонение).

Табл. 3. Влияние производных МДП на генерацию аллоспецифических цитотоксических Т-лимфоцитов в смешанной культуре лимфоцитов.

Цифры в таблице представляют собой индексы цитотоксичности Т-лимфоцитов по отношению к аллогенным опухолевым клеткам P815 (среднее арифметическое ± стандартное отклонение).

Табл. 4. Влияние производных МДП на продукцию ИЛ-1 и ФНО мышиными перитонеальными макрофагами.

Табл. 5. Влияние производных МДП (10 мм) на цитотоксическую активность естественных киллеров по отношению к ЕК-чувствительным клеткам YAC-1.

Отношение клеток-эффекторов к клеткам-мишеням - 25:1.

Цифры в таблице представляют собой индексы цитотоксичности естественных киллеров по отношению к опухолевым клеткам YAC-l (среднее арифметическое ± стандартное отклонение).

Как показали исследования, амфифильный препарат β- гептилгликозид - мурамилдипептид обладает более значительным, чем немодифицированный МДП и липофильный аналог β- гексадецилгликозид-МДП, стимулирующим действием in vitro на основные популяции клеток - эффекторов противоопухолевого ответа. C₇H₁₅ МДП стимулирует пролиферацию лимфоцитов в смешанной культуре лимфоцитов (СКЛ), усиливает цитотоксичность естественных киллеров (ЕК), активирует генерацию цитотоксических Т-лимфоцитов (ЦТЛ) и продукцию интерлейкина (ИЛ-1) и фактора некроза опухолей (ФНО) макрофагами.

2. Взаимодействие производных мурамилдипептида с модельными мембранами и включение в клетки.

Для того, чтобы объяснить отличия в иммуномодулирующей активности амфифильного и липофильного гомологов, было изучено взаимодействие этих мурамилпептидов с некоторыми модельными мембранами.

На взаимодействие гомологичных производных МДП с клеточными мембранами и проникновение внутрь клетки существенное влияние может оказать их гидро-липофильный баланс. Он же значительно определяет и внутриклеточное движение препаратов. Разница в гидро-липофильном балансе двух гомологов может быть продемонстрирована с использованием простейшей модельной "мембраны" вода/хлороформ.

Обнаружены существенные отличия в распределении препаратов, меченых ¹⁴C, между фазами этой модельной "мембраны". 64% C₇H₁₅ МДП распределялось в водной фазе, а 36% препарата попадало в органический растворитель. Что касается более липофильного гомолога, то водная фаза включала лишь 28% препарата, а органический растворитель - 72%.

Затем проведено исследование с использованием другой модели, позволяющей в динамике наблюдать за движением иммуномодулятора через мембрану из одной водной фазы в другую и определялось количество препарата, задержавшегося в самой модельной мембране.

Использована модельная липидная мембрана, изготовленная из фильтровального диска, пропитанного эквимолярной смесью холестерина и фосфолипидов.

Препарат C₁₆H₃ МДП в следовом количестве появлялся по другую сторону модельной мембраны уже через 1 час от начала эксперимента, а через 6 часов его содержание в другой водной фазе было уже значительным. Но дальнейшее проникновение липофильного препарата через липидный барьер проходило значительно медленнее по сравнению с C₇H₁₅ МДП. Последний появлялся во второй водной фазе только через 24 часа, однако, затем скорость его поступления увеличивалась и через 72 часа C₇H₁₅ МДП первым достигал состояния равновесия в концентрации препарата в двух водных фазах.

Исследование содержания препарата в самой модельной мембране по окончании эксперимента выявило, что значительная часть препарата C₁₆H₃₃ МДП была связана с липидной мембраной, в то время как C₇H₁₅ МДП в четыре раза меньшем количестве был ассоциирован с мембраной.

Для уточнения характера взаимодействия иммуномодуляторов-производных МДП с биологическими мембранами и динамики проникновения этих препаратов внутрь клетки, было изучено включение иммуномодуляторов (C₇H₁₅ МДП и C₁₆H₃₃ МДП), меченых ¹⁴С, в клетки эритролейкемии человека линии K562.

Хотя включение в клетку иммуномодуляторов зависит, помимо их физико-химических свойств, от эндо- и экзоцитоза, структуры плазмалеммы и других факторов, результаты этой серии экспериментов в целом коррелировали с результатами, полученными при исследовании взаимодействия производных МДП с модельной холестерин - фосфолипидной мембраной.

При культивировании клеток в среде, лишенной глутамина (для угнетения клеточного деления) и содержащей меченные препараты, в течение 1 часа липофильный C₁₆H₃₃ МДП связывался с клетками на 50% активнее, чем его амфифильный гомолог (p<0,05). Однако, дальнейшее включение препарата в клетки замедлялось и после двух часов инкубации ассоциированная с клетками радиоактивность практически выходила на "плато". Амфифильный препарат C₇H₁₅ МДП через 2 - 4 часа начинал включаться в клетки в большем количестве, не входя к этому времени в фазу равновесия входа и выхода из клеток. Через 24 часа включение этого препарата в клетки превышало на 25% включение более липофильного гомолога (p<0,05).

Таким образом, значительная часть липофильного производного МДП оставалась связанной с плазмалеммой. Конечно, в результате эндоцитоза препарат, ассоциированный с плазматической мембранной, начинает проникать внутрь клетки, но, по видимому, вскоре этот процесс в значительной степени уравновешивается экзоцитозом. Амфифильный препарат, несколько медленнее связывающийся с плазмалеммой из окружающей среды, легче выходит внутрь клетки из клеточной мембраны.

Как показали исследования, амфифильный C₇H₁₅ МДП эффективнее проникает через модельную холестерин-фосфолипидную мембрану и включается в клетки эритролейкемии человека K562, чем его липофильный гомолог C₁₆H₃₃ МДП. Амфифильность препарата C₇H₁₅ МДП является принципиально важным качеством, позволяющим ему эффективнее проникать через биомембраны, что коррелирует с выраженной активацией основных клеток-эффекторов противоопухолевого ответа.

3. Противоопухолевая активность C₇H₁₅ МДП на мышиных моделях лимфомы и меланомы.

Методика исследования (кратко): Мышам C 56 B 16 подкожно в пятку прививали 1•10⁶ клеток лимфомы EL-4 или меланомы B 16.

Затем мыши проходили курс лечения C₇H₁₅ МДП. Препарат вводили в/в или per os в PBS (phosphate buffer saline). Розовая доза при пероральном применении составила 1 мг/кг веса, при в/в введении 0,5 мг/кг веса. Препарат вводили дважды в неделю в течение трех недель, начиная лечение сразу после имплантации опухолевых клеток. Кроме того, проводили иммунотерапию препаратом, включенным в липосомы, состоящие из смеси фосфатидилхолина и фосфатидилсерина (7:3).

Инкапсуляцию в липосомы веществ проводили, как описано Schroit, Fidler (Cancer Res. 1982, 42:161).

Липосомальный C₇H₁₅ МДП вводился в/в по той же схеме, что и чистое вещество, и разовая доза при этом составляла 0,25 мг/кг веса. В контроле мыши получали PBS без вещества. Противоопухолевый эффект оценивали по двум критериям: 1) увеличение продолжительности жизни мышей-опухоленосителей, 2) угнетение опухолевого роста.

Табл. 6. Влияние C₇H₁₅ МДП на продолжительность жизни мышей опухоленосителей.

Табл. 7. Угнетение роста опухолевого узла под влиянием C H МДП.

Таким образом, препарат обладает значительной противоопухолевой активностью, что проявляется в увеличении продолжительности жизни мышей-носителей меланомы и лимфомы (табл. 6) и угнетении роста этих опухолей (табл. 7). Испытания препарата показали, что если лечение препаратом начинать за 1 неделю до имплантации опухоли, то можно получить еще больший противоопухолевый эффект, а в единичных случаях достичь и полного излечения мышей - опухоленосителей.

Терапия с в/в введением иммуномодулятора, включенного в липосомы, давала несколько больший лечебный эффект в сравнении с препаратом, используемым в чистом виде. Представляются рациональными все три использованных метода введения C₇H₁₅ МДП (пероральный, в/в в чистом виде, в/в в липосомах). Путь введения должен выбираться индивидуально в зависимости от вида и локализации опухоли.

Широкие экспериментальные исследования β-гептилгликозид МДП (C₇H₁₅ МДП) в качестве иммуномодулятора позволили перейти к его клиническим испытаниям, для чего была создана фармацевтическая композиция для перорального и внутривенного введения, в том числе в липосомальной форме.

Фармацевтическая композиция для перорального введения представляет собой твердую лекарственную форму, содержащую активное соединение в дозе от 0,001 до 100 мг/кг веса. В качестве целевой добавки используются общепринятые физиологически приемлемые наполнители.

Фармацевтическая композиция для внутривенного введения, в том числе в липосомальной форме содержит активное соединение в дозе от 0,0001 до 30 мг/кг веса и 0,0001-10 мг/кг веса соответственно.

В качестве целевой добавки используются общепринятые физиологически приемлемые наполнители.

Фармкомпозицию готовят путем обычного смешения или растворения β- гептилгликозид - МДП /C₇H₁₅ МДП/ с целевыми добавками.

Препарат вводят внутривенно или перорально через 1 - 10 дней. Курс лечения от 1 до 100 приемов. При введении препарата в дозе более указанной проявляется токсический эффект, а в дозе ниже указанной терапевтический эффект не достигается.

Клинические испытания проведены на больных меланомой. Как показали клинические испытания, введение препарата на основе - гептилгликозид МДП /C₇H₁₅ МДП/ способствовало активации основных звеньев иммунитета.

Изобретение относится к медицине, в частности касается препаратов, которые позволяют проводить коррекцию иммунитета живого организма и представляют собой высокоэффективные иммуномодуляторы. Предложены применение β-гептилгликозид-N-ацетилмурамил-L-аланил-D-изоглутамина (C₇H₁₅МПД) в качестве иммуномодулятора и фармацевтическая композиция, обладающая противоопухолевой активностью, содержащая эффективное количество β-гептилгликозида МПД и физиологически приемлемые наполнители. Препарат способствует активации основных звеньев иммунитета. Кроме того, является эффективным средством для коррекции иммунитета в случаях серьезных иммунодефицитов. 2 c. и 3 з.п.ф-лы, 7 табл.

1. Применение β-гептилгликозид-N-ацетилмурамил-L-аланил-D-изоглутамина общей формулы

в качестве иммуномодулятора. 2. Фармацевтическая композиция, обладающая противоопухолевой активностью, включающая активное соединение мурамилдипептид и фармацевтически приемлемый наполнитель, отличающаяся тем, что в качестве активного наполнителя она содержит β-гептилгликозид-МДП-(C₇H₁₅МДП) в эффективном количестве. 3. Композиция по п.2, отличающаяся тем, что она предназначена для внутривенного введения и содержит активное соединение в дозе 0,0001 - 30,0 мг/кг веса. 4. Композиция по п.2 или 3, отличающаяся тем, что она выполнена в липосомальной форме и содержит активное соединение в дозе 0,0001 - 10,0 мг/кг веса. 5. Композиция по п.2, отличающаяся тем, что она предназначена для перорального введения и содержит активное соединение в дозе 0,001 - 100,0 мг/кг веса.