СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИСКУССТВЕННОГО ПЕРЕНОСЧИКА КИСЛОРОДА Российский патент 1997 года по МПК A61K35/18 

Изобретение относится к медицине, в частности к созданию заменителя эритроцитов на основе химически модифицированного гемоглобина.

Известны периодические способы получения искусственного кровезаменителя на основе внеэритроцитарного гемоглобина человека, модифицированного пиридоксаль-5'-фосфатом и глутаровым альдегидом (1). Недостатком указанных способов является получение продуктов, содержащих тяжелые (с молекулярной массой 1 млн.дальтон) фракции, которые оказывают отрицательное воздействие на организм животных.

Наиболее близким к предлагаемому изобретению является способ химической модификации гемоглобина с помощью пиридоксаль-5'-фосфата и глутарового альдегида методом непрерывной полимеризации. Способ заключается в том, что 16% -18% раствор дезоксигенированного гемоглобина, содержащего 4-5-кратный молярный избыток пиридоксаль-5-фосфата вводят во взаимодействие с раствором глутарового альдегида в молярном соотношении 1:6-1:8. Полученный этим способом продукт характеризуется сродством к кислороду, выражаемым парциальным давлением кислорода, соответствующим половинному насыщению гемоглобина кислородом (р₅₀), равным 26-28 мм рт.ст. что практически идентично характеристикам донорской крови, а также временем удерживания в кровеносном русле половины введенного вещества (Т_1/2) (определенным в эксперименте на крысах при введении плеторически в дозе 1 г/кг массы тела животных), составляющем 4,8 ч (3).

Недостатком указанного способа получения искусственного переносчика кислорода на основе гемоглобина является образование гетерогенного по молекулярной массе продукта, содержащего тяжелые фракции (с молекулярной массой 600 тыс. дальтон).

Однако известно, что тяжелые фракции полигемоглобина обладают рядом отрицательных воздействий на организм животных, в том числе вызывают агрегацию форменных элементов крови.

Целью изобретения является улучшение качества конечного продукта за счет увеличения его биосовместимости. Указанная цель достигается тем, что в реакцию полимеризации вводят раствор гемоглобина с концентрацией 8% 10% Указанный диапазон концентраций гемоглобина был выбран авторами по результатам проведенных экспериментов по полимеризации гемоглобина с различной исходной концентрацией растворов и по хроматографическому анализу фракционного состава полученных продуктов реакций. В таблице 1 представлены результаты, полученные авторами в серии опытов.

Снижение концентрации ниже 8% 10% нецелесообразно, так как приводит к увеличению содержания в продукте немодифицированного гемоглобина, что повлечет за собой его быстрое выведение из кровеносного русла. При увеличении концентрации исходного раствора (до 16% 18%) аналогично способу прототипа продукт содержит до 50% тяжелых фракций.

Способ осуществляется следующим образом. 8% 10% раствор дезоксигенированного гемоглобина, содержащего 4 5-кратный молярный избыток пиридоксаль-5'-фосфата в физиологическом 0,15 М растворе NaCl с рН 7,2 вводят во взаимодействие с равным объемом раствора также в 0,15 М NaCl глутарового альдегида в молярном соотношении 1:6 1:8. Получаемый таким способом продукт содержит фракции с молекулярной массой, не превышающей 130 тыс.дальтон.

Качественные показатели биосовместимости полученного по предлагаемому способу искусственного переносчика кислорода в сравнительном с прототипом аспекте исследовали в экспериментах на животных. В образцах крови, взятых у 24 крыс, установлено, что содержание свободных, неагрегированных форменных элементов крови при введении в кровеносное русло продукта, полученного по заявляемому способу, составило 63% тогда как при введении вещества, полученного по способу прототипа, свободные клетки практически отсутствуют (таблица 2). При этом полностью сохранены как функциональная активность (р₅₀), так и время циркуляции (T_1/2)
Пример конкретного выполнения.

8,9% раствор гемоглобина в физиологическом растворе NaCl, содержащий 0,18% (4,67-кратный молярный избыток) натриевой соли пиридоксаль-5-фосфата, дезоксигенируют и вводят во взаимодействие с 0,9% раствором глутарового альдегида (6,52-кратный молярный избыток по отношению к гемоглобину). После завершения полимеризации реакционную смесь гидрировали 5-кратным молярным избытком NaBH₄ при рН 7,4, который поддерживали с помощью 1 М раствора NaH₂PO₄. После этого полученный раствор химически модифицированного гемоглобина концентрировали и диализовали против физиологического раствора (0,15М NaCl). Конечный продукт с концентрацией 10,9% при содержании метгемоглобина 6,3% имел р₅₀ 27,0 мм рт.ст. Доля полимерной фракции составила 30% Полученный продукт испытывался на собаках в модели частичной кровопотери при введении в дозе 4 г/кг массы тела животных, при этом не наблюдалось существенной агрегации эритроцитов, в соответствии с чем скорость кровотока не снижалась, диаметр сосудов оставался неизменным.

Таким образом заявляемый способ позволяет получить искусственный переносчик кислорода, который по своим биологическим свойствам (биосовместимость) превосходит продукт, получаемый по прототипу, и его агрегирующее воздействие на форменные элементы крови значительно снижено.

Предлагаемое изобретение относится к медицине, в частности к созданию заменителя эритроцитов донорской крови на основе химически модифицированного внеэритроцитарного гемоглобина. Способ заключается в дезоксигенации 8-10% раствора гемоглобина, содержащего 4-5 кратный молярный избыток пиридоксаль-5'-фосфата, с последующей его полимеризацией с помощью глутарового альдегида и гидрированием. Получаемый продукт диализуют против физиологического раствора хлорида натрия и стерильно фильтруют. Получаемый по заявляемому способу полигемоглобин не обладает побочным отрицательным воздействием на организм животных и имеет качественные характеристики эффективного препарата искусственного переносчика кислорода. 2 табл.

Способ получения искусственного переносчика кислорода на основе химически модифицированного гемоглобина с использованием сшивающего агента глутарового альдегида и регулятора обратимой аксигенации гемоглобина пиридоксаль-5-фосфата методом непрерывной полимеризации, отличающийся тем, что, с целью повышения качества конечного продукта за счет увеличения его биосовместимости, используют раствор гемоглобина с концентрацией 8 10% подвергают его направленной полимеризации.