СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ДНК-СОДЕРЖАЩЕГО ПРЕПАРАТА ДЛЯ ПЕРОРАЛЬНОГО ПРИМЕНЕНИЯ И ПРЕПАРАТ, ПОЛУЧЕННЫЙ ЭТИМ СПОСОБОМ Российский патент 2022 года по МПК A61K35/60 A61K41/13 A61P37/04 

Изобретение относится к биотехнологии и может найти применение в медицине, пищевой и фармацевтической промышленности.

В настоящее время ДНК и ее низкомолекулярные производные широко используются как в составе биологически активных добавок к пище (БАД) в качестве источника нуклеотидов для синтеза дезоксирибонуклеиновых кислот в организме, так и в составе лекарственных средств.

Так известны патент RU 2106149 (A61K 31/70, опубл. 10.03.1998), в котором описано подкожное или внутримышечное введение 1,5%-ного раствора натриевой соли ДНК в 0,1%-ном растворе хлористого натрия (ДЕРИНАТ); SU 1804852 (A61K 35/60, опубл. 30.03.1993) раскрывает парентеральное введение раствора натриевой соли ДНК для лечения лимфогрануломатоза.

Патент GB 808296 (МПК С07С, опубл. 04.02.1959) описывает способ экстракции нуклеиновой кислоты из животных и растительных материалов, путем обработки измельченного материала раствором щелочи, осаждения нуклеата щелочного металла путем добавления спирта, смешивания осадка с водной суспензией сульфата кальция, нагревания и фильтрации смеси и осаждения по существу чистой нуклеиновой кислоты для инъекционного применения с помощью добавления смеси спирта и соляной кислоты к фильтрату;

Описание изобретения к авторскому свидетельству SU 652187 (МПК С07Н 21/04, опубл. 15.03.1979) описывает способ получения дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) для инъекционного применения из спермы рыб путем ее гомогенизации, солевой экстракции дезоксирибонуклеопротеида, диссоциации его на ДНК и белок с последующей детергентной депротеизацией, в котором в качестве сырья используют гонады Ш-У стадий половой зрелости рыб, консервированные в концентрированном этиловом спирте, а гомогенизированную ткань обрабатывают, протеолитическим ферментом - трипсином или проназой;

патент RU 2036652 (МПК А61К 35/60, опубл. 09.06.1995) описывает способ получения ДНК, обогащенного минеральными добавками, включающий нагревание молок лососевых рыб до 100-150°С в 7-10%-ном растворе поваренной соли, отделение экстракта фильтрованием, осаждение нуклеопротеинового комплекса этиловым спиртом, введение раствора микроэлементов в эквимолярных с ДНК количествах, промывание и сушку конечного продукта, который используют в качестве биологически активной добавки к пище, 95% ДНК которой разлагается в кишечнике на отдельные нуклеотиды;

патент RU 2034554 (МПК А61К 35/60, опубл. 10.05.1995) описывает способ выделения ДНК из молок осетровых, который состоит в том, что молоки осетровых рыб гомогенизируют, депротеинизацию ДНК осуществляют непосредственно в гомогенате, для чего гомогенат обрабатывают раствором хлористого натрия при 55-60°С, затем обрабатывают кизельгуром, концентрируют на электродиализной установке либо в мембранном аппарате и озвучивают. ДНК из раствора осаждают спиртом и высушивают в сушильном шкафу при температуре 40°С. Полученный этим способом препарат используют в качестве инъекционного.

Известны способы крупномасштабной промышленной переработки молок рыб, позволяющие быстро перерабатывать большие объемы сырья, так патент JP S552634 (МПК С07Н 21/04, опубл. 10.01.1980) описывает способ экстрагирования ДНК и протамина без использования дорогостоящего устройства и сырья, путем обработки неочищенных молок рыбы непосредственно концентрированным раствором неорганической соли. Нуклеопротамин извлекают из неочищенных молок рыбы непосредственно с помощью 1-2М водного раствора неорганической соли, такой как хлорид щелочного металла, сульфат, нитрат, хлорид аммония, сульфат и т.д., при комнатной температуре - 60 град (Фаренгейт). Экстракт разбавляют водой, и выделяют отдельно ДНК и отдельно протаминсульфат из одной и той же порции сырья;

патент JP S554308 (МПК С07Н 01/08, опубл. 12.01.1980) раскрывает способ выделения ДНК из гомогенизированных молок рыбы, в котором гомогенизированную массу доводят кислотой до рН 4,5-6,5 и перемешивают при 80-100 град. С в течение 0,5-2 часа. Затем добавляют щелочной водный раствор для доведения рН до более 8 и перемешивание продолжают, твердую часть отделяют и добавляют кислоту к фильтрату для выделения ДНК;

патент CN 103865919 (МПК C12N 15/10, опубл. 18.06.2014), описывает способ промышленного производства чистой ДНК из тимуса теленка, спермы рыб или молок рыб, который включает разобщение раствора ДНК после диссоциации SDS додецилсульфата натрия, доведение рН до щелочного, оставление его на 1-2 часа и сбор его центрифугированием. Доведение рН супернатанта до 7,0-7,5, затем добавление этанола для осаждения, сбор осадка, промывку и сушку ДНК продукта;

патент JP S552635, МПК С07Н 21/04, опубл. 10.01.1980, описывает способ простой экстракции ДНК без использования дорогостоящих устройств и материала, путем обработки неочищенных молок рыбы непосредственно 0,5-3 М водным раствором щелочи, например, гидроксида щелочного металла, ацетата щелочного металла, карбоната щелочного металла и т.д. Экстракция проводится при относительно низкой температуре и низкой концентрации щелочи, чтобы предотвратить разложение продукта. Поскольку молоки рыбы не размолоты устраняются такие сложные и малоэффективные операции, как центробежная сепарация, фильтрация и т.д.

Описанные выше способы позволяют получать препараты высокомолекулярной ДНК, содержащие много примесей, но которые, тем не менее, могут быть использованы в виде биологически активных пищевых добавок, ДНК которых разлагается в кишечнике на отдельные нуклеотиды, и в косметических препаратах для наружного применения.

Работ, посвященных механизму действия экзогенной ДНК-Na, немного. При этом наиболее подробно исследован вопрос усвоения ДНК-Na и распределения по органам и тканям в зависимости от молекулярной массы. В частности, было показано (Рыкова Е.Ю. Активирующее влияние ДНК на иммунную систему / Е.Ю. Рыкова, П.П. Лактионов, В.В. Власов // Усп. совр. биол. - 2001. - Т. 121. - № 2. - С. 160-171; Серебряная Н.Б. ДНК как иммуностимулятор / Н.Б. Серебряная, А.А. Новик // Мед. иммунол. - 2001. - Т. 3, № 1. - С. 27-34), что поступающая в организм ДНК-Na накапливается, в основном, в костном мозге, селезенке и эпителии тонкого кишечника.

Нуклеиновые кислоты настолько ценный материал, что все клетки моментально стараются захватить части ДНК, появляющиеся после распада отживших клеток. Захватывают, и вставляют в свою структуру даже без разбора на составные части. Этот механизм был хорошо исследован на бактериях («Как происходит и чем лимитируется горизонтальный перенос генов у бактерий». С.В. Шестаков Экологическая генетика том V №2 2007), а сейчас широко изучается и у человека (Александр Марков, Книга РОЖДЕНИЕ СЛОЖНОСТИ, Эволюционная биология сегодня: неожиданные открытия и новые вопросы, 580 стр., 2014 г, Изд-во: Corpus (АСТ).

Показано, что полимерная ДНК поглощается клеткой намного сильнее, чем гидролизованная (расщепленная на мелкие фрагменты), причем длительное время ДНК остается в первоначальной форме, не разрушаясь (Хаитов Р.М. Иммуномодуляторы: механизм действия и клиническое применение / Р.М. Хаитов, Б.В. Пинегин // Иммунология. - 2003. - Т. 24, № 4. - С. 196-203). Клетки и ткани органов, попадающие в чрезвычайные стрессовые условия, захватывают ДНК чрезвычайно активно (Хаитов Р.М. Иммуномодуляторы и некоторые аспекты их клинического применения / Р.М. Хаитов, Б.В. Пинегин // Клиническая медицина. - 1996. - № 8. - С. 7-13).

Терапевтическая эффективность экзогенной ДНК связана с сохранением ее полимерной структуры. Мелкие фрагменты - олиго или мононуклеотиды гораздо менее эффективны (Получение и свойства производных ДНК из молок лососевых / Ю.И. Касьяненко, Ю.В. Ковалева, Л.М. Эпштейн и др. // Известия ТИНРОцентра. - 1997. - № 120. - С. 37-43)

Универсальным эффектом фрагментов полимерной ДНК при приеме через рот (перорально - лат. Per os), является эффект уменьшения выраженности антинуклеарного синдрома и уменьшения тяжести большинства аутоиммунных заболеваний (Хаитов Р.М. Иммуномодуляторы и некоторые аспекты их клинического применения / Р.М. Хаитов, Б.В. Пинегин // Клиническая медицина. - 1996. - № 8. - С. 7-13; Yerne N.K., Nordin F.N. Plaque formation in agar by single antibody producing / N.K. Yerne, F.N. Nordin // Science. - 1963. - Vol. 140. - P. 405-407.)

В 1959 году Каназир с сотрудниками опубликовали работу по увеличению выживаемости облученных крыс при введении им изологичной ДНК-Na, полученной из селезенки и печени. При этом выживаемость облученных животных возрастала от 2,6% в контроле до 30-40% в опытной группе (Корогодин В.И. Проблемы пострадиационного восстановления, М., Атомиздат, 1966).

Известно RU 2387456 (Опубл. 27.04.2010) инъекционное и в виде микроклизм введение пациенту фрагментированной ДНК человека в комплексе с негистоновым белком протамином, при этом длина фрагментов ДНК человека составляет 200-6000 пар оснований и соотношение фрагментированная ДНК человека/негистоновый белок протамин составляет 1/0,8.

Таким образом, создание новых препаратов двунитевой ДНК, обеспечивающих максимально удобную доставку ДНК для стимулирования клеток костного мозга, и поддержание на высоком уровне иммунной системы человека в неблагоприятных стрессовых условия, является актуальной задачей сегодняшнего и завтрашнего дня.

Основная проблема в обеспечении человека фрагментами полимерной, двунитевой (двухцепочечной) ДНК состоит в том, что нуклеиновые кислоты, поступившие в виде БАД с пищей, на 95-98% разрушаются в тонком кишечнике до пуриновых и пиримидиновых оснований.

Эта проблема частично решена тем, что для перорального введения предложено применение иммобилизированных олигонуклеотидов, представляющих собой фрагменты ДНК молекулярной массой 500-700 кДа, высокоочищенные протеолитическими ферментами, полученные из сырья - «Экстракт молок лососевых - кислота дезоксирибонуклеиновая низкомолекулярная», иммобилизованные на полиэтиленоксиде (патент RU 2414223, опубл.20.03.2011). Там же (патент RU 2414223) описан способ получения препарата ДНК для перорального применения с помощью иммобилизации фрагментов ДНК, высокоочищенных протеолитическими ферментами, молекулярной массой в пределах 500-700 кДа, полученных из сырья - «Экстракт молок лососевых - кислота дезоксирибонуклеиновая низкомолекулярная», которую осуществляют путем облучения 10% водного раствора полиэтиленоксида (ПЭО) с молекулярной массой 1,5 кДа потоком ускоренных электронов в дозе 1,5 Мрад и внесения в облученный раствор олигонуклеотидов ДНК молок лососевых рыб до конечной концентрации 10 мг в 1 мл, смесь перемешивают 10 минут до получения опалесцирующего раствора. Предварительно облученый полиэтиленоксид образует мицеллы, содержащие конденсированную ДНК, что позволяет защитить молекулу ДНК от деструкции в желудочно-кишечном тракте и облегчает проницаемость мицеллы через стенку кишечника.

Однако для осуществления этого способа требуется сложное и дорогое оборудование - ускоритель электронов, специалисты, владеющие техникой облучения, и высокоочищенные фрагменты ДНК.

Техническая задача, на решение которой направлено предлагаемое изобретение, состоит в исключении необходимости использования сложного оборудования, требующего специальных знаний, и высокоочищенных олигонуклеотидов, путем получения препарата ДНК для перорального применения в виде дезоксирибонуклеопротеина (ДНП), в котором наиболее полно сохранена нативная структура ДНК в виде двухцепочечной (двунитевой) полимерной ДНК с сохранением природной упаковки дезоксирибонуклеопротеина, а именно сохранением связи ДНК с белками протаминами, позволяющей обеспечить доставку фрагментов двунитевой полимерной ДНК в тонкий кишечник при пероральном ее поступлении, и затем обеспечить возможность поступления фрагментов ДНК в кровь.

Поставленная задача решена тем, что предложен способ получения ДНК-содержащего препарата для перорального применения из семенных желез (молок) рыб, преимущественно, семейства лососевых или семейства осетровых, заключающийся в том, что проводят гомогенизацию сырья в цитратно-солевом растворе с последующим разбавлением гомогената этим же раствором до получения однородной смеси, в которую вводят при постоянном перемешивании сухой хлористый натрий до образования насыщенного раствора хлористого натрия и повышения вязкости раствора, что свидетельствует о начале выделения ДНК-содержащего препарата, который продолжают перемешивать еще, по меньшей мере, в течение часа, затем раствор разбавляют водой, по меньшей мере, в 10 раз, перемешивание прекращают и выдерживают до появления вязких сгустков, всплывающих наверх раствора, где эти сгустки механически собирают, перерастворяют в цитратно-солевом растворе, обрабатывают ультразвуком до получения фрагментов ДНК длиной не более 500 пар нуклеиновых оснований, целевой продукт очищают и выделяют добавлением, по меньшей мере, 2,5 объемов охлажденного до 4°С этилового или изопропилового спирта, высушивают, измельчают и хранят в темном помещении при температуре не выше 20°С.

При этом в качестве цитратно-солевого раствора берут 0,9% раствор хлористого натрия, приготовленный на 0,01 М растворе лимоннокислого натрия (цитрата натрия) рН 7,14.

Для разбавления раствора берут холодную (температура не выше 15°С) питьевую воду ГОСТ Р 51232-98.

Механический сбор сгустков осуществляют, в частности, ситом.

Очистку и выделение целевого продукта проводят, добавляя к обработанному ультразвуком цитратно-солевому раствору сорбент, перемешивают, выдерживают в течение по меньшей 2-х часов, фильтруют, затем к прозрачному, бесцветному фильтрату с ДНК-содержащим препаратом приливают, по меньшей мере, 2,5 объема холодного этилового или изопропилового спирта, перемешивают и помещают в холодильник при температуре не выше 4°С для формирования плотного осадка, который собирают на сите, промывают 80% спиртом и высушивают в вакуумном сушильном шкафу при температуре не выше 40°С в течение 38-45 часов.

В качестве сорбента используют, например, кизельгур или кромасил, или любой иной мелкопористый силикагель.

Преимущественно обработку ультразвуком ведут до получения фрагментов ДНК длинной не более 400 пар нуклеиновых оснований.

Обработку ультразвуком контролируют, определяя размеры фрагментов ДНК в получаемом препарате, например методом высокоэффективной жидкостной хроматографии образца препарата или путем электрофореза образца в агарозном геле.

В частном случае осуществления способа для обработки ультразвуком используют ванну с мембраной, соединенной с магнитострикционным излучателем, подключенным к ультразвуковому генератору, например, УЗГ17-2,0/22, обеспечивающему ультразвук рабочей частотой 22 кГц, и обработку ведут в течение, по меньшей мере, 20 минут.

Фильтрацию смеси обработанного ультразвуком цитратно-солевого раствора ДНК-содержащего препарата с сорбентом проводят под вакуумом на нутч-фильтре, застеленном слоем бельтинга и бязи, на котором задерживаются остатки нерастворимых фрагментов исходного сырья и сорбент.

ДНК-содержащий препарат для перорального применения, полученный согласно предлагаемому способу, содержит, по меньшей мере, 80,0 мас.% ДНК в виде смеси двухцепочечных фрагментов длиной не более 500 пар нуклеиновых оснований (п.н.о.), и, по меньшей мере, 10,0 мас.% белка в виде смеси белков, имеющих молекулярную массу от 6 кД до 8 кД.

Преимущественно ДНК-содержащий препарат для перорального применения содержит ДНК в виде смеси двухцепочечных фрагментов длиной от 200 до 400 пар нуклеиновых оснований, а в качестве белка - смесь протаминов.

ДНК-содержащий препарат дополнительно содержит воду в количестве 1,0 - 4,0 мас.% и минеральные примеси в виде хлористого натрия до 100 мас.%.

ДНК в получаемом предлагаемым способом препарате имеет, в зависимости от вида сырья, гиперхромный эффект от 35 до 37%.

ДНК-содержащий препарат представляет собой дезоксирибонуклеопротеин - комплекс ДНК с протаминами.

Сущность заявляемого способа заключается в следующем:

- на начальном этапе получения ДНК-содержащего препарата проводят разрушение клеток молок посредством механической гомогенизации, что приводит к разрушению клеточных мембран и выходу растворимых белков в раствор 0,9% хлористого натрия в 0,01М цитрате натрия, что ингибирует действие нуклеаз;

- используют самые щадящие приемы выделения и очистки препарата;

- это приводит к тому, что удается максимально сохранить природную упаковку дезоксирибонуклеопротеина;

- содержащаяся в препарате ДНК имеет диапазон длин двухцепочечных фрагментов от 200 до 400 п.н.о., что соответствует молекулярной массе от 130 до 260 кДа., то есть намного ниже 500 кДа и, следовательно, не содержит в своем составе генов;

- гиперхромный эффект получаемой низкомолекулярной ДНК не ниже 35%;

- ДНК, сохранившая связь с протаминами за счет сохранения компактной упаковки, позволяющей ДНК преодолеть желудок, практически не подвергается атаке ДНКаз в тонком кишечнике и легче сорбируется эпителием кишечника, за счет аргинина - основного компонента белков протаминов, который хорошо экранирует отрицательный заряд ДНК, поэтому полученный препарат в виде дезоксирибонуклеопротеина (ДНП) не обладает отрицательным зарядом и легче проникает в клетки.

Таким образом, удалось чрезвычайно простым способом получить препарат ДНК в виде дезоксирибонуклеопротеина (препарат ДНП), в котором наиболее полно сохранена нативная структура ДНК в виде двухцепочечной полимерной ДНК с сохранением природной упаковки дезоксирибонуклеопротеина, а именно сохранением связи ДНК с белками протаминами, позволяющей обеспечить доставку фрагментов двухцепочечной (двунитевой) полимерной ДНК в тонкий кишечник при пероральном поступлении препарата ДНП.

Изобретение поясняется графическими материалами, где

на Фиг. 1 представлена фотография электрофореза в горизонтальном направлении полученного предлагаемым способом ДНК-содержащего препарата в агарозном геле с визуализацией ДНК добавкой бромистого этидия, где 1 - размытая полоса указанного препарата на этапе его получения после фильтрации через кромасил; 2 - указанный препарат после осаждения его спиртом и высушивания, видна четкая полоса в зоне между 200-500 п.н.о.; 3 - маркеры молекулярной массы, выраженной в парах нуклеиновых оснований (п.н.о.) - 1000 п.н.о., 900 п.н.о.,800 п.н.о., 700 п.н.о., 600 п.н.о., 500 п.н.о., 200 п.н.о.;

на Фиг. 2 представлен ультрафиолетовый спектр, записанный на сканирующем спектрофотометре Перкин Эльмер при измерении в 1 см кварцевой кювете оптической плотности раствора полученного предлагаемым способом препарата ДНК (ДНП) в 0,9% растворе хлористого натрия, - кривая N1. Максимум поглощения препарата ДНП соответствует 260 нм. Кривая N2 представляет собой измерение оптической плотности раствора хлористого натрия, в котором растворяли полученный предлагаемым способом препарат ДНК;

на Фиг 3 представлена гель-фильтрация раствора полученного предлагаемым способом препарата ДНК (препарат ДНП) в физрастворе на колонке TSK 3000 при низких скоростях элюции (см. Остерман Л.А. Хроматография белков и нуклеиновых кислот. М., Наука, 1985. 556 с. Стр. 159-161),

где по оси Х указана величина адсобции (поглощения) при 260 нм полученного препарата ДНП, по оси У указано время 30 и 60 мин, пройденное пером самописца.

Цифры 1, 2, 3 на кривой гель-фильтрации показывают, что есть три заметных пика разной площади, поглощающие при 260 нм. Пик 3 соответствует препарату ДНП. Пики 1 и 2 соответствуют примеси обрывков ДНК из молок лососевых, которые разрушатся в желудочно-кишечном тракте. На профиле элюции видно, что получаемый по предлагаемому способу препарат выходит из колонки и регистрируется в проточной кювете детектора при длине волны 260 нм в виде широкой гауссовой кривой, и содержание низкомолекулярных (пики 1, 2) и высокомолекулярных (на профиле не обозначены) примесей незначительно. Это еще раз подтверждает данные, полученные при электрофорезе получаемого препарата в агарозном геле, об однородности выделяемой фракции фрагментов двуцепочечной ДНК в комплексе с протаминами.

На Фиг 4. представлен график линейной зависимости молекулярной массы полученного предлагаемым способом препарата ДНК (препарат ДНП) от относительного расстояния (в см) миграции при электрофорезе в агарозном геле,

где по оси Х указана молекулярная масса маркеров, обозначенная цифрами 1-1500 п.н.о., 2-1000 п.н.о., 3-800 п.н.о., 4-700 п.н.о., 6-100 п.н.о.

По оси У указано расстояние миграции в см., полученное при измерении расстояния от нижнего края кармана до светящейся полосы каждого маркера: 1,2,3,4,6.

Широкая зона 5 на графике соответствует широкой светящейся полосе кармана, в который внесен образец препарата ДНП, на графике обозначенный цифрой 5. По оси У расстояние миграции в см. для кармана 5 измерено от нижнего края кармана до начала верхнего края светящейся зоны (п.н.о. 450) и от нижнего края кармана до нижнего края светящейся зоны (п.н.о. 200) и обведено на графике вытянутым овалом. Прямая, проведенная через точки, полученные при пересечении прямых проведенных от оси Х и У, образует указанный график линейной зависимости молекулярной массы и расстояния миграции образцов в агарозном геле.

На Фиг. 5 представлена фотография электрофореза внеклеточной ДНК из крови кроликов, получавших с кормом полученный предлагаемым способом ДНК-содержащий препарат (препарат ДНП), и контрольных - без ДНК и с препаратом Деринат (очищенная ДНК), где на первой полосе 1 - маркеры молекулярной массы ДНК, где полосы сверху вниз соответствуют массе: 3000 п.н.о., 2000 п.н.о., 1200 п.н.о., 800 п.н.о., 500 п.н.о., 200 п.н.о.

Полоса 2 - представляет собой образец обработки крови контрольного кролика, получавшего физраствор; Полоса 3 - представляет собой взятый в 5-ти кратном размере по отношению к полосе 2 образец обработки крови контрольного кролика, получавшего физраствор; Полоса 4 - представляет собой образец обработки крови кролика, получавшего препарат Деринат; Полоса 5 - представляет собой взятый в 5-ти кратном размере по отношению к полосе 4 образец обработки крови кролика, получавшего препарат Деринат; Полоса 6 - представляет собой образец обработки крови кролика, получавшего препарат ДНП.

На Фиг. 6 представлен график зависимости lg молекулярного веса низкомолекулярных белков - ось Х, от расстояния (в см) миграции полосы белка в геле с додецилсульфатом натрия (ДДС-Na) - ось У, где 1- химотрипсин, мол.вес 25000 дальтон (Д); 2 - цитохром С, мол.вес 15000Д; 3 - РНКаза А, мол.вес 13700Д; 4 -протамины, мол.вес 6000 - 8000 Д; 5 - инсулин Ч, мол.вес 5700Д; 6 - С - пептид, мол.вес 3000Д. График получен известным методом электрофореза разделения белков по размеру с использованием додецилсульфата натрия (ДДС-Nа) в ПААГеле и добавлением в электродный буфер 0,1 % ДДС-Nа (см. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: Электрофорез и ультрацентрифугирование (практическое руководство, стр. 54 -65), Изд-во наука 1981 г.).

Пример осуществления изобретения

Для получения ДНК-содержащего препарата в частном конкретном случае брали молоки лососевых рыб (можно брать молоки рыб семейства осетровых). Сырье в количестве 10 кг тщательно мыли и очищали от пленок, жира и иных посторонних включений, после чего подготовленное сырье подвергали тщательному измельчению в ножевом гомогенизаторе с добавлением 1 л охлажденного до 4°С 0,9% раствора хлористого натрия на 0,01 М цитрате натрия рН 7,14 до однородного состояния (обычно в течение 15-30 минут).

В емкость (реактор) из нержавеющей стали с рубашкой, снабженный погружной механической мешалкой пропеллерного типа и с откидывающейся верхней крышкой, объемом 250 литров наливали 20 литров раствора 0,9% хлористого натрия в 0,01 М цитрате натрия рН 7,14 и включали мешалку. Порциями, при включенной мешалке, добавляли гомогенат молок и продолжали перемешивание до полной однородности смеси, примерно в течение 2 часов. Таким образом, на начальном этапе получения ДНК-содержащего препарата происходит разрушение клеток молок посредством механической гомогенизации, что приводит к разрушению клеточных мембран и выходу растворимых белков в цитратный буфер рН 7,14 (раствор 0,9% хлористого натрия в 0,01 М цитрате натрия рН 7,14), что ингибирует действие нуклеаз.

Затем сюда же вносили сухой хлористый натрий из расчета 56 г на литр смеси, до образования насыщенного раствора хлористого натрия и появления вязкости. Полученную массу продолжали перемешивать еще примерно 2 часа, затем эту массу разбавляли холодной питьевой водой в десять раз, для снижения концентрации хлористого натрия в десять раз, мешалку отключали и массу оставляли на несколько (примерно на 5-6) часов для формирования вязких сгустков, всплывающих наверх раствора в реакторе.

Образовавшиеся вязкие сгустки собирали мелким ситом, перерастворяли в 10 л 0,9% раствора хлористого натрия в 0,01 М цитратном буфере рН-7,14 и обрабатывали ультразвуком на установке, состоящей из ультразвукового генератора, в частном примере УЗГ 17-2,0/22 (http://www.petsonic.ru/uzo-12-02-03.shtml), и ванны из полированной нержавеющей стали диаметром, в частном примере, около 54 см и высотой около 6 см, ко дну которой прикреплен соединенный с генератором ультразвука магнитострикционный излучатель, соединенный также с мембраной из нержавеющей стали, закрепленной внутри ванны на высоте 2 см от дна и на расстоянии 1 см от стенок ванны. На высоте 3 см от дна ванны и не менее 1 см от мембраны излучателя размещен змеевик из нержавеющей стали, по которому пропускают холодную воду для охлаждения обрабатываемого раствора в процессе его ультразвуковой обработки.

Генератор УЗГ 17-2,0/22 обеспечивает ультразвук рабочей частотой 22 кГц, при номинальной мощности 1600 Вт.

В охлаждаемую холодной водопроводной водой ванну помещали 10л раствора вязких сгустков в 0,9% растворе хлористого натрия в 0,01 М цитратном буфере рН-7,14 и после уравновешивания температуры обрабатываемого материала и ванны включали ультразвуковой генератор. Обработку 10 л материала вели около 25-30 мин, затем отбирали пробу озвученного материала для анализа величины фрагментов ДНК, которая, в предпочтительном случае, не должна превышать 400 пар нуклеиновых оснований (п.н.о.).

Степень ультразвуковой обработки вязких сгустков проверяли с использованием электрофоретического разделения фрагментов ДНК в агарозном геле с окрашиванием бромистым этидием при наличии в контрольном кармане маркеров известной молекулярной массы. По окончанию электрофореза, под УФ источником света хорошо видно, где находится основное количество ДНК из взятого на пробу образца.

Параллельно величину фрагментов ДНК в препарате оценивали визуально по осаждению отобранного из ультразвуковой ванны образца этого продукта, добавляя к образцу 2,5 объема охлажденного до 4°С этилового спирта. Препарат ДНК после обработки ультразвуком, образует взвесь в виде мелких хлопьев.

Если в процессе добавления к образцу охлажденного этилового спирта наблюдалось выпадение крупных хлопьев, то продолжали ультразвуковую обработку раствора сгустков еще в течение 5 - 10 минут и повторяли контрольную проверку по осаждению ДНК в пробе с помощью охлажденного этилового спирта.

Для подтверждения правильного подбора режима обработки получаемого препарата ультразвуком, дополнительно проверяли длину молекул ДНК методом электрофореза в агарозном геле (https://evrogen.ru/kit-user-manuals/DNA_Ladder_NL002.pdf) с использованием маркера длин ДНК 100+ bp DNALadder - стандарт для определения длины двухцепочечных молекул ДНК в интервале 100 - 1000 п.н.о. (пар нуклеиновых оснований) при анализе с помощью электрофореза в агарозном геле.

В дальнейшем эти маркеры также были использованы для оценки массы фрагментов ДНК в образце полученного предлагаемым способом препарата, путем сравнения интенсивности полосы образца с полосой ДНК маркера того же размера. Оценка массы фрагментов ДНК из полученного предлагаемым способом препарата представлена в виде фотографии на Фиг. 1 (сравнение интенсивности полосы образца полученного предлагаемым способом препарата ДНК с полосой маркера того же размера).

Как видно из Фиг. 1, получаемый по заявляемому способу ДНК-содержащий препарат содержит смесь фрагментов ДНК длинной от 200 до 400 п.н.о. (пар нуклеиновых оснований).

Очевидно, что точное определение размеров фрагментов ДНК в получаемом препарате, например методом высокоэффективной жидкостной хроматографии образца препарата или путем электрофореза образца в агарозном геле, необходимо при первоначальном использовании генератора ультразвука, обеспечивающего определенные, характерные именно для него, режимы озвучивания. После чего достаточно контролировать время ультразвуковой обработки визуально по осаждению отобранного из ультразвуковой ванны образца этого продукта, добавляя к образцу 2,5 объема охлажденного до 4°С этилового спирта. Препарат ДНК после обработки ультразвуком, образует взвесь в виде мелких хлопьев.

К озвученному ДНК-содержащему препарату добавляли сорбент кизельгур, перемешивали, выдерживали в течение, по меньшей мере, 2-х часов и фильтровали под вакуумом на нутч-фильтре, который застелен слоем бельтинга и бязи, и на котором задерживались остатки нерастворимых фрагментов молок и сорбент.

К прозрачному, бесцветному фильтрату с препаратом ДНК приливали 2,5 объема холодного (4°С) этилового (можно изопропилового) спирта, перемешивали и помещали в холодильник на ночь для формирования плотного осадка. В дальнейшем было установлено, что этот прием удаляет из получаемого продукта короткие фрагменты ДНК, имеющие длину менее 200 пар нуклеиновых оснований.

Утром большую часть спиртового раствора с осадка декантировали и, перемешав осадок с остатком спиртового раствора, собирали на сите с мелкой нейлоновой сеткой (с величиной пор 900 мкм).

Полученный осадок препарата ДНК промывали 80% спиртом и высушивали в вакуумном сушильном шкафу при 40°С в течение, по меньшей мере, 38 часов. Осадок измельчали на шаровой мельнице, определяли содержание в нем ДНК по Дише с дифениламином и содержание протаминовых белков по цветной реакции на аргинин по Сакагучи, и хранили при комнатной температуре в хорошо закрытой стеклянной банке из темного стекла в хорошо проветриваемом помещении. ВЫХОД целевого продукта из 10 кг сырья составил около 500г (примерно 5% от веса молок).

Полученный препарат был подвергнут биохимическому исследованию.

Молекулярный вес ДНК в полученном предлагаемым способом препарате определяли методом ВЭЖХ (высокоэффективной жидкостной хроматографии) на колонке TSK 3000 (Остерман Л.А. Хроматография белков и нуклеиновых кислот. М,: Наука, 1985. 536 стр. Глава 4 Гель - фильтрация стр. 154), где колонку калибровали с использованием стандартного набора ДНК плазмид, а также методом электрофореза в агарозном геле, проводя окраску бромистым этидием (Остерман Л.А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: Электрофорез и ультрацентрифугирование (практическое руководство), М., Наука 1981. 288 стр., Глава 4 Электрофорез нуклеиновых кислот стр. 120). При освещении агарозного геля ультрафиолетовой лампой видны содержащие ДНК полосы. Полученная хроматограмма представлена на Фиг. 1

Как видно из Фиг. 1 и исследования полученного предлагаемым способом препарата методом ВЭЖХ (Фиг. 3) установлено, что получаемый по заявляемому способу препарат ДНК имеет диапазон длин фрагментов ДНК от 200 до 400 п.н.о. (пар нуклеиновых оснований), что соответствует молекулярной массе от 130 до 260 кДа. то есть намного ниже 500 кДа и, следовательно, не содержит в своем составе генов.

Выход ДНК рассчитывали по поглощению при 260 нм, используя коэффициент пересчета 1 о.е. (оптическая единица) = 40 мкг. Содержание ДНК в целевом продукте определяли спектрофотометрически, анализируя соотношение поглощения растворов на длинах волн 260 и 280 нм (Маниатис Т. Молекулярное клонирование. - М.: "Мир", 1984. - 480 с.). Было установлено, что целевой продукт содержит ДНК в количестве 80,0 - 85,0 мас.%.

Гиперхромный эффект ДНК определяли, сравнивая оптическую плотность при 260 нм раствора препарата ДНК, полученного предлагаемым способом из молок лосося, до и после гидролиза 5% хлорной кислотой при 100°С в течение 20 мин (Лазуркин Ю.С. Физические методы исследования белков и нуклеиновых кислот - М.: Наука, 1967. - 342 с.). Обработку результатов анализа проводили путем получения среднего арифметического результата из пяти параллельных определений. Прирост оптической плотности составил 36,2%, что соответствует приросту (35-37%) для стандартного образца лососевой ДНК, и свидетельствует о том, что исходный раствор полученного предлагаемым способом препарата ДНК действительно представляет собой двухцепочечный (двунитевой) полимер ДНК. (Стандартный образец высокоочищенной полимерной ДНК получали методом фенольной экстракции и депротеонизации по Кирби-Георгиеву (см. Филиппович Ю.Б. и др. Практикум по общей биохимии М., Просвещение», 1975, стр. 159.)

Пример определения подлинности наличия ДНК в полученном предлагаемым способом препарате

0,375 г полученного из молок лосося предлагаемым способом ДНК-содержащего препарата (состав: 80,0 мас.% ДНК в виде смеси двухцепочечных фрагментов длинной 200-400 п.н.о., 10,0 мас.% белка в виде смеси протаминов с молекулярной массой от 6 до 8 кД, вода в количестве 3,0 мас.% и хлористый натрий - остальное) помещали в колбу вместимостью 30 мл и растворяли в 25 мл 0,1% раствора натрия хлорида, получая раствор №1. 0,1 мл раствора № 1 переносили в пробирку А вместимостью 10 мл с притертой пробкой, прибавляли 2 мл воды и 2 мл реактива Дише. Пробирку А помещали в кипящую водяную баню на 10 мин, при этом появлялась синяя окраска.

0,3 мл раствора № 1 помещали в мерную колбу вместимостью 200 мл, доводили объем раствора 0,1 % раствором натрия хлорида до метки и перемешивали. Снимали УФ-спектр полученного раствора в интервале длин волн от 220 до 300 нм относительно 0,1 % раствора натрия хлорида. Полученный спектр (Фиг. 2) имеет максимум поглощения при (260 ± 2) нм и минимум при (230 ± 2) нм.

Препарат дает характерную реакцию Б на натрий (ГФ ХI, вып. 1, с. 159), поскольку при осуществлении предлагаемого способа используется большое количество хлористого натрия и ДНК является кислотой она связывает катионы. Наличие желтой качественной реакции на катион натрия также подтверждает наличие некоторого количества хлористого натрия в получаемом ДНК-содержащем препарате.

УФ-спектр (Фиг. 2) подтверждает наличие ДНК в полученном предлагаемым способом препарате.

Примечание: Для приготовления реактива Дише 1 г дифениламина растворяли в100 мл кислоты уксусной ледяной и добавляли 2,75 мл кислоты серной концентрированной, реактив использовали до истечения срока годности раствора - 3 месяца. Для приготовления раствора натрия хлорида 0,1 г натрия хлорида помещали в мерную колбу вместимостью 100 мл и растворяли в воде, затем доводили объем раствора водой до метки и перемешивали, реактив использовали до истечения срока годности раствора - 6 месяцев.

Пример определения гиперхромного эффекта

0,03г полученного из молок горбуши предлагаемым способом ДНК-содержащего препарата (состав: 80,0 мас.% ДНК в виде смеси двухцепочечных фрагментов длинной 200-400 п.н.о., 10,0 мас.% белка в виде смеси протаминов с молекулярной массой от 6 до 8 кД, вода в количестве 3,0 мас.% и хлористый натрий - остальное) (точная навеска) помещали в мерную колбу вместимостью 100 мл, растворяли в 50 мл 0,1 % раствора натрия хлорида и доводили объем раствора 0,1 % раствором натрия хлорида до метки, получая раствор А. 1 мл раствора А помещали в пробирку с притертой пробкой вместимостью 20 мл, прибавляли 4 мл 0,1 % раствора натрия хлорида и 5 мл 1,0 М раствора кислоты хлорной, получая раствор Б. В качестве контроля в другую такую же пробирку вносили 5 мл 0,1 % раствора натрия хлорида и 5 мл 1,0 М раствора кислоты хлорной. Обе пробирки помещали в кипящую водяную баню и нагревали в течение 20 мин, затем пробирки охлаждали и измеряли оптическую плотность раствора Б при длине волны 260 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм против контроля. Одновременно в другую пробирку с притертой пробкой к 1 мл раствора А прибавляли 9,0 мл 0,1 % раствора натрия хлорида и перемешивали, получая раствор С. Измеряли оптическую плотность раствора С при длине волны 260 нм. В качестве контрольного раствора использовали 0,1 % раствор натрия хлорида.

Гиперхромный эффект в процентах (Г) рассчитывали по формуле:

Г= [(D'_Б - D_C)/ D_C] × 100%

где: D_C - оптическая плотность раствора С, в данном конкретном примере получена равной 0,600;

D'_Б - оптическая плотность раствора Б, в данном конкретном примере получена равной 0,810.

Гиперхромный эффект ДНК-содержащего препарата из молок горбуши составил 35%.

Примечание: Для приготовления 1,0 М раствора кислоты хлорной 117 мл кислоты хлорной помещали в колбу вместимостью 1 л, доводили объем раствора водой до метки и перемешивали, реактив использовали до истечения срока годности раствора - 1 год.

Таким образом, доказано сохранение в препарате, полученном предлагаемым способом, нативной структуры ДНК в виде двухцепочечной (двунитевой) полимерной ДНК с сохранением природной упаковки дезоксирибонуклеопротеина (ХАРАКТЕРИСТИКА ВТОРИЧНОЙ СТРУКТУРЫ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ ПО ГИПЕРХРОМНОМУ ЭФФЕКТУ, Большой практикум «Биохимия». Лабораторные работы: учебное пособие, сост. М.Г. Кусакина, В.И. Суворов, Л.А. Чудинова; Перм. гос. нац. исслед. Университет, Пермь, 2012, 148 с.)

Содержание белка в полученном предлагаемым способом ДНК-содержащем препарате (препарат ДНП) определяли по методу (реакции) Сакагучи (Методическое пособие к малому практикуму по биохимии. Учебно-методическое пособие для студентов биологического факультета, обучающихся по направлениям подготовки 06.03.01 «Биология» и 44.03.01 «Педагогическое образование - Биология» САРАТОВ 2017, стр. 9, Реакция Сакагучи на аргинин), используя в качестве стандарта раствор аминокислоты аргинина. Количественное определение аргинин содержащих пептидов по реакции Сакагучи: Цветные реакции на отдельные аминокислоты используют для обнаружения пептидов, содержащих соответствующие аминокислотные остатки. Для идентификации гуанидиновой группы аргинина применяется реакция Сакагучи - при взаимодействии с а-нафтолом и гипохлоритом натрия гуанидины в щелочной среде дают красное окрашивание. (Аминокислоты, пептиды и белки Т. Дэвени. Я. Гергей Перевод на русский язык, «Мир», 1976 стр. 193. Справочник химика 21, химия и химическая технология). Измерение ведут при длине волны 550 нм.

Измерение количества протаминов (протамина) в полученном предлагаемым способом ДНК-содержащем препарате (препарате ДНП) было проведено по реакции Сакагучи с навеской ДНП и определения количества аргинина в растворе по калибровочной кривой, построенной для чистого препарата аргинина. Расчет количества протаминов проводили исходя из данных, что аргинин составляет 80% протамина. Таким образом, результаты количественного определения протаминов в полученном препарате ДНП показывают, что содержание протаминов составляет около 10,0% по весу.

Электрофоретический анализ по определению молекулярного веса показывает, что вес молекул протаминов в препарате ДНП составляет от 6000 до 8000 Д. Это подтверждается приведенным на Фиг. 6 графиком зависимости lg молекулярного веса низкомолекулярных белков - ось Х, от расстояния (в см) миграции полосы белка в геле с додецилсульфатом натрия (ДДС-Na) - ось У, полученным известным методом электрофореза разделения белков по размеру с использованием додецилсульфата натрия (ДДС-Nа) (см. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: Электрофорез и ультрацентрифугирование (практическое руководство), стр.56-60, Изд-во наука 1981 г), где 1- химотрипсин, мол.вес 25000 дальтон (Д); 2 - цитохром С, мол.вес 15000Д; 3 - РНКаза А, мол.вес 13700Д; 4 - широкая полоса, протамины, мол.вес 6000 - 8000 Д; 5 - инсулин Ч, мол.вес 5700Д; 6 - С - пептид, мол.вес 3000Д.

В свою очередь наличие протаминов в полученном предлагаемым способом препарате ДНК подтверждает, что в процессе выделения препарата протамины не были потеряны на стадиях выделения и отмывки, и полученный предлагаемым способом препарат действительно содержит ДНК и белки - протамины и является комплексом двухцепочечной (двунитевой) ДНК и протаминов, т.е. дезоксирибонуклеопротеином (ДНП).

Оценку влияния фермента дезоксирибонуклеазы на доставку полученного препарата в тонкий кишечник пациента проводили путем выявления различия в устойчивости молекул двухцепочечной (двунитевой) ДНК, когда она свободна или связана в дезоксирибонуклеопротеиновый комплекс с белками протаминами, с помощью панкреатической дезоксирибонуклеазы 1 (ДНКаза I), которая «встречает» препарат на выходе из желудка.

В качестве источника ДНКазы I взят препарат фирмы ДиаМ, выделенный из панкреатического сока, в виде раствора активностью 1 ед/мкл, не содержащий РНКаз (https://www.dia-m.ru/catalog/reactive/genomika/vydelenie-i-ochistka-nukleinovykh-kislot/dnkaza-i-rastvor-ne-soderzhit-rnkaz-1-ed-mkl-13235280/).

Выполнение проверки

Для исследования брали полученный предлагаемым способом из молок лосося препарат, содержащий 85,0 мас.% ДНК в виде смеси двухцепочечных фрагментов длинной 200-400 п.н.о., 10,0 мас.% белка в виде смеси протаминов с молекулярной массой от 6 до 8 кД, воду в количестве 3,0 мас.% и хлористый натрий - остальное (препарат ДНП).

В пробирку 1, содержащую 1 мл 1% раствора препарата ДНП в 0,06 М К-фосфатном буфере рН 7,0, добавляли 0,8 мл 0,01 М раствора MgCl₂, и 50 мкл раствора ДНКазы I;

Готовили пробирку 2, содержащую 1 мл 1% раствора чистой инъекционной ДНК из молок лососевых (содержание ДНК не менее 95% и примесь белков менее 1%) в 0,06 М К-фосфатном буфере рН 7,0, к которому так же, как и в пробирку 1, добавляли 0,8 мл 0,01 М раствора MgCl₂, и 50 мкл раствора ДНКазы I.

В пробирку 3 вместо раствора ДНК вносили 1 мл дистиллированной воды и добавляли те же компоненты, что и в пробирку 1 и 2.

Объем смесей во всех 3-х пробирках доводили до объема 4 мл дистиллированной водой, тщательно перемешивали и инкубировали в термостате 4 часа при 37°С для обеспечения работы ДНКазы I по расщеплению ДНК.

Затем из каждой пробирки отбирали по 1 мл пробы и к этой пробе добавляли по 1 мл 1М раствора хлорной кислоты, как осадитель для инактивации ДНКазы 1.

Получили три пробы № 1, 2, 3, помещенные в соответствующие пробирки.

Кроме этого, из каждой пробирки, прогретой в термостате при 37°С, отбирали еще по 1 мл пробы, к каждой из которых добавляли по 2,5 объема холодного 96% этанола. Таким образом, получили еще три помещенные в пробирки пробы № 4, 5, 6 с осадителем 96% этанолом. Все шесть пробирок центрифугировали на микроцентрифуге и визуально анализировали на наличие осадка и проверяли в надосадочной жидкости на спектрофотометре поглощение нуклеиновых кислот при длине волны 260 нм. Полученные результаты сведены в Таблицу 1.

Таблица 1

Номер Пробирки (пробы) Образование осадка поглощение при 260 нм 1 ++-- - - - - 2 - - - - ++++ 3 - - - - - - - - 4 ++++ - - - - 5 +- - - ++-- 6 - - - - - - - -

Примечание:

Образование осадка: ++++ обильный осадок; ++- - незначительный осадок;

- - - отсутствие осадка.

Поглощение при 260 нм: - - - - отсутствует, ++++- поглощение больше 2 х оптических Ед. против контроля пробирки с водой.

Из представленных в Таблице 1 результатов видно, что максимальный осадок был обнаружен в пробах 4 и 1, что говорит о том, что препарат ДНК в комплексе с протаминами остался неразрушенным и выпал в осадок под действием хлорной кислоты (проба 1), и в большей степени под действием этанола (проба 4). В пробе 2 с хлорной кислотой осадка нет, и очень мало осадка в пробе 5. Это говорит о том, что чистая ДНК разрушилась, а слабый осадок в пробе 5, говорит о том, что этанол осаждает более мелкие олигонуклеотиды, чем хлорная кислота. В контрольной пробе 3 и 6 (вода) осадка нет при обработке любым осадителем.

Оценка поглощения ДНК спектрофотометрическим методом на спектрофотометре при 260 нм в супернатанте проб после осаждения осадков на микроцентрифуге показала, что поглощение максимально в пробе 2 с осадителем хлорной кислотой и менее интенсивно в пробе 5 с осадителем этанолом. Это хорошо согласуется с данными по наличию осадка, что этанол более полно осаждает даже мелкие фрагменты ДНК.

Отсутствие поглощения в супернатанте проб 1 и 4 свидетельствует о том, что хлорная кислота и этанол полностью осаждают полученный предлагаемым способом препарат ДНК и растворимых низкомолекулярных фрагментов в супернатанте не наблюдается.

Таким образом, этот эксперимент доказывает, что препарат, полученный предлагаемым способом, практически не расщепляется ДНКазой I, в то время как чистая ДНК расщепляется на, в основном, небольшого молекулярного веса фрагменты, остающиеся в растворе и интенсивно поглощающие при 260 нм.

В ниже представленном эксперименте на мышах показано, что при кормлении животных полученным предлагаемым способом ДНК-содержащим препаратом (препаратом ДНП) фрагменты ДНК попадают в кровь животных уже через 2 часа после кормления.

Определение содержания фрагментов ДНК в крови мышей после скармливания им полученного предлагаемым способом ДНК-содержащего препарата

Способность фрагментов ДНК попадать в кровь после скармливания им ДНК-содержащего препарата, полученного предлагаемым способом, изучали в эксперименте на 20-ти неинбрендных мышах массой 38-40 г, полученных из питомника РАМН «Столбовая» выполняя все правила, предусмотренные приказом Минздрава N755 от 12.08.1977.

Для исследования был взят препарат, полученный предлагаемым способом из молок лосося и содержащий 85,0 мас.% смеси двухцепочечных фрагментов ДНК длинной 200-400 п.н.о., с гиперхромным эффектом 36,5%, смесь белков молекулярной массой от 6 до 8,0 кД в количестве 10,0 мас.%, воду в количестве 3,0 мас.% и хлористый натрий - остальное. Этот препарат (ДНП, препарат ДНП) разводили дистиллированной водой из расчета, чтобы в 1 мл раствора содержалось 1,0, 10,0 и 100,0 мг препарата ДНП, и пипеткой вводили животным по 100 мкл приготовленного раствора ДНП с концентрацией, указанной в ТАБЛИЦЕ 2. Одна контрольная группа получала только соответствующее количество дистиллированной воды. В качестве положительного контроля использовали препарат Деринат с концентрацией чистой инъекционной ДНК 15 мг/мл.

После дачи животным препарата ДНП забор крови проводили через 0, 1, 2, 3, 4, 10 и 24 часа и затем определяли количество ДНК в сыворотке крови.

Кровь у мышей получали из хвостовых сосудов вакуумным способом. Для чего кончик хвоста смазывали ксилолом и отрезали. На рану наносили каплю 5%-го раствора цитрата натрия, после чего хвост вставляли в одно из отверстий баллончика, стенки которого парафинированы. Сквозь второе отверстие вакуумным насосом отсасывали воздух и при давлении 2,6-5,3 кПз в пробирку насасывали кровь. Это позволяло получать 0,2-0,5 мл крови, сохраняя жизнь животного.

Выделение ДНК из крови проводили методом фенол-хлороформной экстракции (ФХЭ), основанный на использовании органических соединений (Каюмов А.Р. Практикум по молекулярной генетике. Учебно-методическое пособие / А.Р. Каюмов, О.А.Гимадутдинов - Казань: Казань, КФУ, 2016. - 36 с., Стр. 10, Выделение ДНК из крови).

Для этого в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл, содержащую 0,5 мл буферного раствора, вносили 150 мкл сыворотки пробы крови. Добавляли 15 мкл раствора, содержащего 10 мг/мл протеиназы К (до конечной концентрации 0,3 мг/мл) и перемешивали. Затем проводили инкубирование при температуре 56°С не менее 1 ч. После очистки раствора ДНК от белковых примесей в пробирку с продуктами лизиса добавляли равный объем смеси фенол-хлороформ-изоамиловый спирт (25:24:1). Закрывали пробирку крышкой и тщательно перемешивали, затем проводили центрифугирование в течение 3-5 мин при 10000-15000 об/мин до разделения двух фаз. Переносили водную фазу (верхнюю) в новую микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл, стараясь не захватить нижнюю фазу. Процедуру очистки раствора ДНК повторяли несколько раз, после чего в пробирку, содержащую водную фазу, добавляли равный объем водонасыщенного n-бутанола. Перемешав и процентрифугировав, переносили водную фазу (нижнюю) в новую микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл, в которую добавляли равный объем водонасыщенного диэтилового эфира. Вновь проводили центрифугирование и осторожно удаляли верхнюю фазу, содержащую диэтиловый эфир. Для удаления следов эфира водную фазу в течение 5 мин инкубировали при температуре 70°С. К раствору ДНК добавляли 5М раствор NaCl и 96% этанола, тщательно перемешивав, оставили при температуре -20°С на ночь. После центрифугирования, при 10000-15000 об/мин, удаляли супернатант и к осадку добавляли 1 мл 80% этанола, снова центрифугировали в том же режиме и вновь удаляли супернатант. Осадок растворяли в 50 мкл ТЕ-буфера. Выделенную ДНК хранили в морозильник при температуре - 20°С. Концентрацию внеклеточной ДНК (внкДНК) определяли на флуориметре EnspireTM 2300 (Perkin Elmer) по флуоресценции PicoGreen (Invitrogen, США) при длинах волн возбуждения 480 нм и эмиссии 520 нм.

Таблица 2. Содержание внеклеточной ДНК (внкДНК) в крови мышей после скармливания им полученного предлагаемым способом препарата ДНК (ДНП)

№ П/П Вводимый препарат Время отбора проб и определение внк ДНК на спектрофлюриметре в нг/мл 1 Контроль дист. Н₂О 0 1 час 2часа 3часа 4 часа 10 часов 24 часа 27
25
24
28 26
27
26
30 27
26
30
29 27
25
24
28 26
2
24
27 24
25
23
24 26
27
24
23 2 ДНП - 1 мг/мл 24
28
29
27 29
31
28
32 41
43
41
44 48
40
41
42 40
39
43
41 28
27
30
29 30
29
32
34 3 ДНП - 10 мг/мл 23
25
29
28 60
65
58
63 30
95
97
91 420
410
440
430 415
405
417
411 151
148
162
144 33
35
30
29 4 ДНП - 100 мг/мл 23
30
29
24 150
167
160
150 310
305
315
311 4250
4100
3890
4200 2990
3120
3315
3115 250
232
215
248 32
34
29
31 5 Деринат - 15 мг/мл 26
28
25
24 28
29
24
27 30
29
28
29 31
29
30
32 42
40
39
43 27
28
26
25 26
24
27
28

Как видно из Таблицы 2, концентрация внеклеточной ДНК в сыворотке животных в норме составила 26 ± 7 нг/мл соответственно. В экспериментах in vivo было показано, что при введении мышам полученного предлагаемым способом ДНК-содержащего препарата из молок лосося наблюдается рост концентрации внеклеточной (внк) ДНК. Концентрация внкДНК в крови достигает максимума через 2-3 часа после кормления, а через 24 ч падает до содержания внкДНК в контрольной группе. В экспериментах in vivo, при введении per os исследуемого препарата наблюдается значительное увеличение концентрации внкДНК, которая увеличивается пропорционально количеству вводимого препарата. Таким образом, этот эксперимент доказывает, что при пероральном применении полученного предлагаемым способом ДНК-содержащего препарата в кровь поступает именно ДНК (фрагменты ДНК), а не отдельные нуклеотиды и нуклеиновые основания. См. Таблица 2. содержание внкДНК в крови мышей, получавших препарат ДНП, в пробах 3 и особенно заметно в пробах 4. И практически нет увеличения внкДНК в пробах 5 (контроль Деринат).

Исследование спонтанной и индуцированной митогенами пролиферации спленоцитов мышей (спленоцит - моноцит, образующийся в ретикулярной ткани селезенки)

Исследовали иммунотропные, митогенные, и аллергенные свойства полученного предлагаемым способом ДНК-содержащего препарата (препарата ДНП) с помощью реакции бласттрансформации лимфоцитов (РБТЛ).

Использование этого подхода с применением Т- и В-клеточных митогенов позволяет также оценить преимущественное влияние исследуемого препарата ДНП на Т- или В- клеточные популяции лимфоцитов. (Хаитов Р.М., Атауллаханов Р.И., Иванова А.С. и др. Методические указания по оценке иммунотоксического действия фармакологических веществ. - М., 2000 г.)

Для исследования был взят препарат, полученный предлагаемым способом из молок лосося и содержащий 80,0 мас.% ДНК в виде смеси фрагментов длинной 200-400 п.н.о. (пар нуклеиновых оснований) с гиперхромным эффектом 36,2%, 12,0 мас.% смеси протаминов молекулярной массой от 6 до 8 кД, воду в количестве 3,5 мас.% и хлористый натрий - остальное. Этот препарат (далее ДНП) разводили дистиллированной водой из расчета, чтобы в 1 мл раствора содержалось 1,0, 10,0 и 100,0 мг ДНП.

Иммуномодулирующее действие препарата ДНП изучали в экспериментах на 160 не инбредных мышах массой 14 - 18 г, полученных из питомника РАМН «Столбовая», выполняя все правила, предусмотренные приказом Министерства Здравоохранения № 755 от 12.08.1977.

Постановка реакции. Животных опытных и контрольной групп забивали с помощью цервикальной дислокации, извлекали селезенки и готовили клеточную суспензию при помощи стеклянного гомогенизатора.

Полученные спленоциты отмывали средой 199 с 5% сыворотки крупного рогатого скота и по 200 мкл клеточной взвеси (с концентрацией 2×10⁶ /мл) в среде RPMI-1640 (Flow, Англия), дополненной 10% эмбриональной телячьей сыворотки (Gibco, США), 0,01 М буфера HEPES (Gibco, США), 200 мМ L-глутамина (Sigma, США),10 μМ 2-меркаптоэтанола (Merck,ФРГ), 100 мг/мл стрептомицина и 100 ед/мл пенициллина вносили в лунки 96-луночных планшетов.

В 48 лунок вносили митоген - фитогемагглютинин в концентрациях 10 мкл (10 мкг/мл). В другие 48 лунок для оценки спонтанной пролиферации лимфоцитов митоген не добавляли. В верхнюю строку контрольных лунок добавляли физиологический раствор (ФР). Во вторую строку лунок вносили по 50 мкл раствора препарата ДНП с концентрацией 1 мг/мл. В третью строку лунок вносили по 50 мкл раствора препарата ДНП с концентрацией 10 мг/мл. В четвертую строку лунок вносили по 50 мкл раствора препарата ДНП с концентрацией 100 мг/мл. Затем селезеночные клетки инкубировали в течение 96 часов в атмосфере 5% СО₂, при температуре 37,5° С. За 24 часа до окончания культивирования во все лунки добавляли по 1 мкКи раствора ³Н-тимидина в объеме 10 мкл. Интенсивность включения ³Н-тимидина (число импульсов/мин) определяли в клетках, собранных с помощью Cell Harvester (Flow), на сцинтилляционном счетчике (Marck-III).

Уровень РБТЛ спленоцитов под влиянием митогена и вносимого в среду культивирования препарата ДНП оценивали по отношению к интенсивности РБТЛ спленоцитов в среде, не содержащей митоген, но содержащей препарат ДНП в различных концентрациях. Для оценки влияния препаратов на РБТЛ сравнивали величину включения ³Н-тимидина клетками селезенки мышей, получивших препараты ДНП, с таковой спленоцитов мышей в контроле, получивших физиологический раствор (ФР). Результаты выражают в значениях импульсов в минуту.

Подсчитывали среднее количество импульсов радиоактивной метки лимфоцитов в опытных и контрольных пробирках с последующим определением индекса стимуляции по формуле:

Индекс стимуляции = Среднее количество импульсов/минуту/в Опыте деленное на Среднее количество импульсов/минуту/в Контроле.

Определения индекса стимуляции лимфоцитов позволяет оценить влияние дозы препарата ДНП на уровень РБТЛ лимфоцитов. Индекс стимуляции действия препарата ДНП был незначительным при ДНП 1 мг/мл и составил 1,2, при ДНП 10 мг/кг и 100 мг/кг - 1,8 и 1,9 индекс стимуляции существенно выше. Полученные экспериментальные данные представлены в Таблице 3.

Таким образом, при изучении влияния препарата ДНП на реакцию бласттрансформации лимфоцитов было установлено, что ДНП дозозависимо, в основном - 10 и 100 мг/мл, умеренно стимулирует как спонтанную, так и митогениндуцированную РБТЛ. Вероятно, усиление пролиферации спленоцитов, вызванное внесением препарата ДНП в культуру клеток, сопровождается и повышением пролиферативного ответа клеток на Т клеточный митоген.

Определение содержания фрагментов ДНК в крови кроликов после скармливания им полученного предлагаемым способом ДНК-содержащего препарата (препарат ДНП)

Для исследования был взят препарат, полученный предлагаемым способом из молок лосося и содержащий 85 мас.% ДНК в виде смеси фрагментов длинной 200-400 п.н.о. (пар нуклеиновых оснований) с гиперхромным эффектом 36,0%, 10 мас.% смеси белков - протаминов, имеющих молекулярную массу от 6 до 8кД, воду в количестве 3,5 мас.% и хлористый натрий - остальное (препарат ДНП).

Материалом исследований стали образцы крови кроликов, взятых в 90 дневном возрасте. Для эксперимента были сформированы 3 группы кроликов по 3 головы в каждой, со средней живой массой 4,5-4,6 кг. Первая (контрольная) группа кроликов получала основной рацион (ОР). Состав ОР: зерно кукурузы, пшеницы, ячменя, жмых подсолнечный, сено люцерновое и макроэлементы; второй (опытной) группе скармливали основной рацион (ОР) с той разницей, что в корм вводили добавку препарата ДНП из расчета 500 мг/ кг корма. Третьей (контрольной) группе в корм вводили Деринат - инъекционный препарат ДНК в таком же количестве, что и препарат ДНП. В сутки кролик кормится 30-35 раз и съедает за один раз около 3 г корма, суммарно 900 - 1050 г. То есть в сутки животное съедало до 500 мг препарата ДНП. С учетом обмена веществ у кроликов, забор крови осуществляли через двое суток, когда установился определенный гомеостаз внеклеточной ДНК в крови кроликов, получавших корм различного состава.

Перед началом эксперимента и через двое суток после кормления животных отбирали по 2 мл крови из ушной вены каждой группы животных (по 3 животных на группу) в пробирку и получали сыворотку крови. После осаждения форменных элементов крови, из верхнего слоя отбирали по 1 мл сыворотки и проводили выделение внеклеточной (внк) ДНК методом фенол-хлороформной экстракции (ФХЭ) также, как это описано выше при исследовании крови мышей.

Концентрацию внеклеточной (внк) ДНК определяли на флуориметре EnspireTM 2300 (Perkin Elmer) по флуоресценции PicoGreen (Invitrogen, США) при длинах волн возбуждения 480 нм и эмиссии 520 нм. Полученные данные представлены в Таблице 4.

Таблица 4. Определение спектрофлюориметрическим методом содержания внеклеточной ДНК в крови кроликов после скармливания препарата ДНП

№ П/П Вводимый препарат Время отбора проб и определение внк ДНК на спектрофлюориметре в нг/мл 1 Контроль дист. Н₂О 0 Через двое суток 26
24
26 21
22
23 2 ДНП - 500 мг/на кг корма 24
38
39 429
431
428 3 Деринат -500 мг ДНК/ на кг корма 23
25
29 60
65
58

Как видно из Таблицы 4, концентрация внеклеточной ДНК в сыворотке животных в норме составила 24-39 нг/мл, а через двое суток после начала кормления кроликов препаратом ДНП концентрация внеклеточной ДНК в сыворотке животных увеличивается больше чем в 10 раз и достигает 430 нг/мл. В пробе 3, в крови кроликов получавших инъекционный препарат чистой ДНК (Деринат) на 2 сутки содержание внкДНК увеличивается очень незначительно.

Эксперимент in vivo показал, что при пероральном введении кроликам полученного предлагаемым способом ДНК-содержащего препарата из молок лосося (ДНП) наблюдается, в сравнении с контролем и кормлением с добавкой такого же количества ДНК в виде инъекционного препарата Деринат, значительный прирост в крови уровня внкДНК в пробе 2 и незначительный в пробе 3. Незначительный прирост в пробе 3 может быть связан со стимуляцией обменных процессов в организме нуклеотидами и нуклеозидами из Дерината.

Таким образом, этот эксперимент, как и подобный эксперимент на мышах, доказывает, что при пероральном применении полученного предлагаемым способом ДНК-содержащего препарата в кровь поступают именно фрагменты двухцепочечной ДНК, а не отдельные нуклеотиды и нуклеиновые основания, образующиеся при распаде ДНК в ЖКТ, что подтверждается при сравнении данных по внк ДНК проб 2 и 3 Таблицы 4.

Полученную как описано выше внеклеточную ДНК в сыворотке крови кроликов контрольной группы, группы получавшей Деринат и группы, получавшей препарат ДНП, подвергали электрофорезу в агарозном геле с визуализацией добавкой бромистого этидия в горизонтальном направлении, так как при этом 1) гель с низкой концентрацией агарозы лучше держится, 2) получается меньшее перекашивание (коллапс) в процессе электрофореза и 3) меньше искажаются полосы ДНК.

Этот метод является известным и обычным при работах с ДНК, как описано в работах McDonell M. W., Simon M. N., Studier F. W., 1977. Analysis of restriction fragments of T7 DNA and determination of molecular weights by electrophoresis in neutral and alkaline gels, J. Mol. Biol., 110, 119; Peacock A. C., Dingman C. W., 1968. Molecular weight estimation and separation of ribonucleic acid by electrophoresis in agarose-acrylamide composite gels, Biochemistry, 7, 668.

Расплавленный агарозный гель выливали на стеклянную пластинку, выровненную горизонтально по уровню. Затем на краю расплава геля устанавливали гребенку с зубцами, которые после застывания агарозы, остаются погруженными в агарозный гель, и, когда гребенку осторожно вынимали из застывшего геля, то на месте зубцов оставались углубления - «карманы», куда микропипеткой вносили нужный объем пробы исследуемого материала.

По окончанию электрофореза гель отрезали ровно по границе ниже «карманов» и дальше фотографировали в УФ свете.

На Фиг. 5 представлена фотография электрофореза внеклеточной ДНК из крови кроликов, получавших с кормом полученный предлагаемым способом ДНК-содержащий препарат (препарат ДНП), и контрольных, где на первой 1 полосе - маркеры молекулярной массы ДНК, где полосы сверху вниз соответствуют массе: 3000 п.н.о., 2000 п.н.о., 1200 п.н.о., 800 п.н.о., 500 п.н.о., 200 п.н.о.; Полоса 2 - представляет собой образец обработки крови контрольного кролика, получавшего физраствор; Полоса 3 - представляет собой взятый в 5-ти кратном размере по отношению к полосе2 образец обработки крови контрольного кролика, получавшего физраствор; Полоса 4 - представляет собой образец обработки крови кролика, получавшего препарат Деринат; Полоса 5 - представляет собой взятый в 5-ти кратном размере по отношению к полосе 4 образец обработки крови контрольного кролика, получавшего препарат Деринат; Полоса 6 - представляет собой образец обработки крови кролика, получавшего препарат ДНП.

Как видно из представленной фотографии (Фиг. 5), на полосах 2, 3 и 4, 5 свечения ДНК зафиксировано не было, несмотря на 5ти кратное увеличение объема исследуемого образца, нанесенного на полосы 3 и 5, в то же время на полосе 6 хорошо видна четкая полоса ДНК ниже 500 п.н.о. и выше 200 п.н.о., причем «шлейф» ДНК не наблюдается. Так как на пробах из «карманов» 4 и 5 полос вообще не видно это подтверждает, что в желудочно-кишечном тракте кролика ДНК из препарата Деринат практически расщепляется до низкомолекулярных олигонуклеотидов или нуклеозидов. В тоже время, ДНК из препарата ДНП проникает в кровь и накапливается в крови, что и отражает свечение фрагментов ДНК длиной не более 400 п.н.о. и не менее 200 п.н.о. на полосе 6 (Фиг. 5), связанных водородной связью в комплементарные пары АТ и ГЦ, образуя с помощью, так называемых, слабых связей, двухцепочечные фрагменты ДНК.

Иммунологические и химические показатели крови кроликов при добавлении полученного предлагаемым способом ДНК-содержащего препарата из молок лососевых рыб (препарата ДНП) к корму

Для исследования был взят тот же препарат ДНП, что и для исследования содержания внеклеточной ДНК в сыворотке крови кроликов. Материалом исследований стали образцы крови кроликов, взятых в 90 дневном возрасте. Для эксперимента были сформированы 3 группы кроликов по 3 головы в каждой, со средней живой массой 4,5-4,6 кг. Первая (контрольная) группа кроликов получала основной рацион (ОР). Состав ОР: зерно кукурузы, пшеницы, ячменя, жмых подсолнечный, сено люцерновое и макроэлементы; второй (контрольной) группе скармливали основной рацион (ОР) с той разницей, что в корм вводили препарат Деринат, инъекционный препарат ДНК из расчета 500 мг/кг корма; третьей группе в корм вводили добавку препарата ДНП из расчета 500 мг/кг корма. Эксперименты по оценке иммунологических и химических показателей крови кроликов при применении добавки, полученного предлагаемым способом ДНК-содержащего препарата из молок лососевых рыб (препарата ДНП) к корму, проводили в виварии института, имевшего иммунохимическую лабораторию и специалистов для проведения такой работы.

В сутки кролик кормится 30-35 раз и съедает за один раз около 3 г корма, суммарно 900 - 1050 г. То есть в сутки животное съедало до 500 мг ДНП. Брали образцы крови на третьи сутки содержания групп на таком кормлении. Кровь для исследования отбирали в серологические и гематологические пробирки, путем прокола краевой ушной вены кроликов инъекционной иглой. В лабораторию кровь доставляли в день ее взятия. Количество образцов - по 3 из каждой группы. При исследовании крови изучали активность иммунитета. Клинико-физиологическое состояние кроликов определяли путем ежедневного их осмотра. Внимание обращали на их поведение, поедаемость корма, состояние шерстного покрова. Живую массу определяли путем индивидуального взвешивания. Получаемый в опытах цифровой материал обрабатывали по методикам, описанным в литературе (Лакин Г.Ф. Биометрия. Учеб. пособие для биол. спец. вузов - 4-е ИЗД., перераб. и доп - М.: Высш. шк.- 1990.- 352 с.), с применением персонального компьютера и пакета прикладных программ (Microsoft Excel). Разницу в значениях считали достоверной при: * - р > 0,05; ** р < 0,01 и *** р < 0,001. Основные результаты эксперимента представлены в Таблице 5.

Таблица 5. Результаты иммунологических показателей в контроле (группа 1) и при добавке в корм инъекционного препарата Деринат, содержащего фрагменты высокочистой двунитевой ДНК (группа 2) и при добавке в корм полученного предлагаемым способом препарата ДНП, содержащего ДНК в виде комплекса с протаминами (группа 3)

Показатель крови Контрольная группа 1 Группа 2 (Деринат) Группа 3(препарат ДНП) Лейкоциты (WBC), 10⁹/л 5,17±0,857 7,47±0,733* 7,8±0,723 Гематокрит (HCT), % 23,17±2,371 24,47±1,848 33,2±0,418*** СОЭ, мм/ час 2,33±0,333 1,33±0,333 1,67±0,333 ФА (30 мин), % 41,33±0,667 44,3±0,882** 47±2,517* ФЧ (30 мин), ед 0,65±0,024 0,65±0,018 0,8±0,018*** ЗФ, ед 1,1±0,059 1,27±0,033* 1,36±0,024* КМ, ед 2,0±0,033 2,7±0,344* 2,78±0,331* Т, % 58,778±1,176 60,333±1,764 62±1* В, % 27,267±0,504 28,667±1,333 30,8±1,665 Т, 10⁹/л 1,033±0,176 1,31±0,456 1,567±0,145* В, 10⁹/л 0,733±0,12 0,757±0,171 0,81±0,08 Т-л % / В-л % 2,156±0,043 1,976±0,159 2,176±0,143

ФА - фагоцитарная активность лейкоцитов, ФЧ - фагоцитарное число, ЗФ - завершенность фагоцитоза, КМ - коэффициент мобилизации, Т-лимфоциты, В-лимфоциты. (. Иммунология. Под ред. Воронина Е.С. М.: Колос-Пресс, 2002.- 408 с.- С. 34.) Т и В приведены в процентах или из расчета числа. (10 в 9 степени)в камере Горяева.

В крови взрослых кроликов варьирование лейкоцитов считается нормальным в пределах 5,5-10 тыс. в 1 мм³ (Берхоф П.К. Мелкие домашние животные. Болезни и лечение / Пер. с нем. И. Кравец. Изд. 2, испр. и доп. - М.: ООО "АКВАРИУМ ПРИНТ". - 2004.- С.60; Георгиевский В.И. Практическое руководство по физиологии сельскохозяйственных животных. Учеб. пособие для с.-х. вузов.- М., "Высш. школа", - 1976. - С. 184-185).

Как видно из Таблицы 5, средние показатели лейкоцитов в крови 2-й и 3-й подопытных групп находились в пределах физиологической нормы и были выше, чем в контрольной 1-й группе на 43,2% и 52,3% (р > 0,05). Фагоцитарная активность лейкоцитов - это способность фагоцитов захватывать, умерщвлять и переваривать патогенные и условно патогенные микроорганизмы. Фагоцитарная активность нейтрофилов обычно повышается в начале развития воспалительного процесса. Снижение фагоцитарной активности клеток крови способствует развитию хронического воспалительного процесса и возникновению агрессии против собственных тканей организма (появлению аутоиммунных процессов).

Фагоцитарная активность у кроликов второй опытной группы была в норме и выше контроля 1 группы на 7,3 % и в третьей группе выше контроля 13,8% (р > 0,05).

Наиболее информативным для оценки фагоцитарной активности следует считать индекс поглощения, то есть фагоцитарное число, коэффициент фагоцитарного числа, которые отражают завершенность фагоцитоза (ЗФ) и индекс бактерицидности - способности фагоцита переваривать захваченный микроб (Нагоев Б.С. Справочник по иммунологии. - Нальчик: Эльбрус, 2002 - 192 с. - С.53).

Завершенность фагоцитоза отмечена у животных 2-ой и 3-ей групп, но более высокие показатели наблюдаются в группе 3. Исследования показали высокие, на 35% и 39% (р > 0,05), показатели коэффициента мобилизации лейкоцитов во 2-ой и 3-ей группе. Это свидетельствует об увеличении активности микробицидной системы фагоцитов у животных этих групп.

Для характеристики клеточного и гуморального иммунитета проводили количественное определение Т- и В-лимфоцитов. Показатели клеточного звена иммунитета 3-й опытной группы кроликов были выше, чем в контрольной группе. Абсолютное количество Т-лимфоцитов было выше на 27 и 52% (р > 0,05) во 2-й и 3-й группах. Абсолютное количество В-лимфоцитов показало повышение на 3% и 5% (р > 0,05) соответственно во 2-й и 3-й группе относительно контроля - 1-й группы. При этом процентное содержание Т- и В-лимфоцитов в обеих группах по сравнению с фоновыми показателями достоверно не изменилось.

Таким образом, исходя из общего анализа исследований иммунологического состава крови, отмечено преимущество опытной группы 3. Применение добавки ДНП к корму оказывает стимулирующее действие на организм кроликов, которое проявляется активацией защитных систем крови и повышением иммунных свойств животных. Это соответствует известному факту, что фрагментированная двунитевая (двухцепочечная) ДНК поддерживает иммунный ответ, активируя макрофаги и Т-лимфоциты. Установлено, что эти эффекты связаны с активацией клеток через рецепторный аппарат (Nat Rev Immunol. 2004 Apr; 4(4):249-58).

Вышеприведенные эксперименты однозначно доказывают, что полученный предлагаемым способом ДНК-содержащий препарат преодолевает желудок за счет его белковой составляющей, а ДНК активно поглощается слизистой кишечника, что фиксируется по увеличению внеклеточной ДНК в крови мышей и кроликов, пропорционально количеству введенного им через рот (лат. per os,) препарата.

Следовательно, получаемый предлагаемым способом ДНК-содержащий препарат пригоден как для перорального использования без дополнительной обработки, как в качестве источника ДНК с высокой биодоступностью для организма для изготовления фармацевтических препаратов и в биологически активных добавках к пище, так и в качестве реагента для различных областей биохимии, биотехнологии и фармацевтики, содержащего фрагменты ДНК определенной длины достаточно высокой степени чистоты.

Заявляемый способ получения ДНК-содержащего препарата для перорального применения является успешным решением задачи доставки через кишечник и кровь такого ценного препарата как фрагменты полимерной ДНК туда, где он максимально нужен.

Неочевидность изобретения состоит в том, что чрезвычайно простым путем удалось получить препарат, не уступающий по своим свойствам инъекционным препаратам ДНК, а также ДНК, иммобилизованной на полиэтиленоксиде.

Пероральные препараты фрагментов полимерной ДНК в виде капсул или таблеток будут особенно удобными для применения персоналом, занятым на обслуживании и при ликвидации аварий на атомных реакторах на АЭС или реакторах на ледоколах или атомных подводных лодках, поскольку реализация универсальных эффектов воздействия на организм фрагментов нуклеиновых кислот позволяет добиваться положительных результатов коррекции здоровья при широком спектре патологических состояний, острых и хронических заболеваний (Караськов A.M., Вайнберг Ю.П., Волков A.M., Казанская Г.М. // Военно-мед. журн. - 1995, №2. - С.64-65).

Изобретение относится к области биотехнологии и может найти применение в медицине, пищевой и фармацевтической промышленности. Способ получения ДНК-содержащего препарата для перорального применения заключается в выделении целевого продукта из природного источника – семенных желёз (молок) рыб семейства лососевых или семейства осетровых, посредством гомогенизации сырья в цитратно-солевом растворе с последующим разбавлением гомогената этим же раствором до получения однородной смеси. В полученную смесь при постоянном перемешивании вводят сухой хлористый натрий до образования насыщенного раствора хлористого натрия с повышенной вязкостью. Затем раствор разбавляют водой, по меньшей мере, в 10 раз, перемешивание прекращают и выдерживают до появления вязких сгустков, всплывающих наверх раствора, где эти сгустки собирают, перерастворяют в цитратно-солевом растворе, и обрабатывают ультразвуком для получения фрагментов ДНК длиной не более 500 пар нуклеиновых оснований. Очистку и выделение целевого продукта проводят при добавлении, по меньшей мере, 2,5 объёмов охлажденного до 4°С этилового или изопропилового спирта. В заключительной стадии продукт высушивают, измельчают и хранят в темном помещении при температуре не выше 20°С. Описанный способ позволяет получить ДНК-содержащий препарат, который обладает высокой биодоступностью, эффективностью, а также пригоден в качестве источника ДНК в биологически активных добавках. 2 н. и 11 з.п. ф-лы, 5 табл., 1 пр., 6 ил.

1. Способ получения ДНК-содержащего препарата для перорального применения из семенных желёз (молок) рыб, заключающийся в том, что проводят гомогенизацию сырья в цитратно-солевом растворе с последующим разбавлением гомогената этим же раствором до получения однородной смеси, в которую вводят при постоянном перемешивании сухой хлористый натрий до образования насыщенного раствора хлористого натрия и повышения вязкости раствора, который продолжают перемешивать ещё, по меньшей мере, в течение часа, затем раствор разбавляют водой, по меньшей мере, в 10 раз, перемешивание прекращают и выдерживают до появления вязких сгустков, всплывающих наверх раствора, где эти сгустки собирают, перерастворяют в цитратно-солевом растворе, обрабатывают ультразвуком до получения фрагментов ДНК длиной не более 500 пар нуклеиновых оснований, очищают и выделяют добавлением, по меньшей мере, 2,5 объёмов охлажденного до 4°С этилового или изопропилового спирта, высушивают, измельчают и хранят в темном помещении при температуре не выше 20°С.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве цитратно-солевого раствора берут 0,9% раствор хлористого натрия, приготовленный на 0,01 М растворе лимоннокислого натрия рН 7,14.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что очистку и выделение целевого продукта проводят, добавляя к обработанному ультразвуком его цитратно-солевому раствору сорбент, перемешивают, выдерживают в течение, по меньшей мере, 2-х часов, фильтруют, затем к прозрачному, бесцветному фильтрату с ДНК содержащим препаратом приливают, по меньшей мере, 2,5 объема холодного этилового или изопропилового спирта, перемешивают и помещают в холодильник при температуре не выше 4°С для формирования плотного осадка, который собирают на сите, промывают 80% спиртом и высушивают в вакуумном сушильном шкафу при температуре не выше 40°С.

4. Способ по п.3, отличающийся тем, что в качестве сорбента используют мелкопористый силикагель, например, кизельгур или кромасил.

5. Способ по п.3, отличающийся тем, что фильтрацию смеси обработанного ультразвуком цитратно-солевого раствора ДНК-содержащего препарата с сорбентом проводят под вакуумом на нутч-фильтре, застеленном слоем бельтинга и бязи, на котором задерживаются остатки нерастворимых фрагментов исходного сырья и сорбент.

6. Способ по п.1, отличающийся тем, что обработку ультразвуком ведут до получения фрагментов ДНК, предпочтительно, длиной не более 400 пар нуклеиновых оснований.

7. Способ по п.1, отличающийся тем, что в частности для обработки ультразвуком используют ванну с мембраной, соединенной с магнитострикционным излучателем, подключенным к ультразвуковому генератору, например, УЗГ17-2,0/22, обеспечивающему ультразвук рабочей частотой 22 кГц.

8. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве сырья берут, преимущественно, молоки рыб семейства лососевых или семейства осетровых.

9. Иммуномодулирующий ДНК-содержащий препарат для перорального применения, полученный согласно способу по любому из пп.1-8.

10. Препарат по п.9, отличающийся тем, что содержит, по меньшей мере, 80,0 мас.% ДНК в виде смеси двухцепочечных фрагментов длинной не более 500 пар нуклеиновых оснований и, по меньшей мере, 10,0 мас.% смеси белков молекулярной массой от 6 до 8 кД.

11. Препарат по п.10, отличающийся тем, что содержит ДНК в виде смеси двухцепочечных фрагментов длиной от 200 до 400 пар нуклеиновых оснований.

12. Препарат по п.10, отличающийся тем, что содержит ДНК с гиперхромным эффектом от 35 до 37%.

13. Препарат по п.10, отличающийся тем, что в качестве белка содержит преимущественно протамины.