СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ НУКЛЕОПРОТЕИНОВОГО КОМПЛЕКСА Российский патент 1998 года по МПК A61K35/60 

Изобретение относится к получению биологически активных веществ, которые находят применение в медицине.

Известен способ выделения ДНК (Патент РФ 2026864, МКИ6 C 07 H 21/04), включающий обработку крови раствором хлорида триметилоктадециламмония в концентрации 0,5-1% в трис-HCl-буфере, солюбилизацию в 1-1,5 M растворе NaCl, и осаждении ДНК этанолом.

Известен способ производства натриевой соли ДНК из животного сырья (Патент РФ N 2005724, МКИ6 C 07 H 21/04). Способ включает измельчение и гомогенизацию в цитратно-солевом растворе, обработку гомогената детергентом и концентрированным раствором хлористого натрия, обработку реакционной массы ультразвуком с частотой 8-35 кГц и интенсивностью 0,2-2,0 Вт/см², смешиванием ее с кизельгуром, при соотношении сорбент: реакционная масса 1:5-25, фильтрование с последующим концентрированием барофильгирацией, осаждение продукта этиловым спиртом и сушку осадка соли ДНК при 20-60^oC.

Известен способ получения дезоксирибонуrлеиновой кислоты (Авт. свид. N 487897/51) М Кл. C 07 G 7/026. Опубл. 15.10.75.

Способ включает гомогенизацию замороженных молок в холодном цитратно-солевом растворе, центрифугирование при температуре минус 3^oC. Образовавшийся осадок ядерного материала в макроизмельчителе заливают цитратно-солевым раствором и гомогенизируют. В гомогенат при перемешивании добавляют цитратно-солевой раствор и 6% додецилсульфата натрия при 60^oC в течение 1,5 часа. По истечении времени добавляют цитратно-солевую смесь, содержащую 29% поваренной соли и 4,8% трехзамещенного цитрата натрия, продолжая перемешивать 1,5 часа при 60^oC. Затем массу охлаждают, помещают кизельгур, перемешивают 3 мин, чтобы вся охлажденная масса сорбировалась на кизельгур. Элюируют ДНК с кизельгура цитратно-солевой смесью, содержащей 14,5% поваренной соли и 2,4% трехзамещенного нитрата натрия. Отделяют элюат фильтрацией через слой бельтинга и фильтровальной бумаги. Элюат заливают 96% холодным этанолом, смесь перемешивают до сформирования нитевидного осадка ДНК. ДНК промывается дважды 50% этанолом, затем 7% этанолом.

Известен способ выделения натриевой соли ДНК из тканей животного происхождения (Патент РФ N 2017496, МКИ5 A 61 K 35/60).

Способ включает измельчение и гомогенизацию в цитратно-солевом растворе (ССЦ), трехкратную промывку ядерного материала ССЦ. Затем отмытый ядерный материал помещают в реактор с ССЦ, и 6% раствором додецилсульфата натрия в 45% этиловом спирте, нагревают до 60^oC, добавляют равный объем раствора 5 M хлористого натрия, перемешивают, охлаждают до 12-16^oC; обрабатывают реакционную массу ультразвуком, отделяют раствор ДНК от осадка балластных веществ фильтрацией реакционной массы через кизельгур на нутч-фильтре; концентрируют фильтрат на мембране с размером пор 0,45 мкм (потери ДНК при этом до 3%), отмывают концентрат диафильтрацией на этой же мембране, до отрицательной реакции на белок в пермеате.

Полученная натриевая соль ДНК имеет следующие характеристики:
- содержание белка не более 1,5%
- молекулярная масса 450 кДальтон
- молекулярный эффект 44%
- содержание РНК не более 2%
- содержание полисахаридов не более 2%.

В качестве прототипа выбран способ получения протаминов (1.144.700 МКИ4 A 61 K 37/08, 35/60), включающий очистку молок рыб от жира и соединительной ткани, гомогенизацию в растворе Рингера, фильтрование, центрифугирование, промывку осадка раствором Рингера и повторную гомогенизацию с последующим выделением целевого продукта. Повторную гомогенизацию проводят в натрий-ацетатном буфере pH 4,6, содержащем 1,4 M натрия хлорида, полученный гомогенизат обрабатывают ультразвуком в течение 2-3 мин и выделяют целевой продукт сорбцией на катионообменнике.

Задача, решаемая изобретением, - получение нуклеопротеинового комплекса с содержанием ДНК не менее 65%.

Сущность способа заключается в следующем: сырье - текучие молоки рыб, измельчают до фарша и обрабатывают 7-10% раствором хлорида натрия при температуре кипения в течение 2,5-3,5 часов при соотношении сырье:раствор соли равном 1: (4-5), после чего экстракт ДНК отделяют от плотной части, проводят его ультрафильтрацию с концентрацией до содержания сухих веществ 1,8 - 3,0 и концентрат сушат. Сухой продукт обрабатывают этанолом при 40-50^oC при соотношении 1:(4-6) и сушат на воздухе.

Полученный продукт характеризуется следующими показателями: Внешний вид - аморфный порошок
Цвет - от белого до светло-кремового
Запах - свойственный, специфический, без постороннего
Массовая доля влаги, не более - 11%
Массовая доля основного вещества, не менее - 65%.

Сущность способа поясняется примерами.

Пример 1.

290 г текучих молок лососевых обрабатывают 7% раствором NaCl в соотношении 1: 4 (сырье:раствор соли) в течение 2,5 часов при температуре 100^oC. Смесь фильтруют через марлю, после чего подают на проточную центрифугу. Очищенный экстракт подвергают ультрафильтрации с концентрированием до содержания сухих веществ, равным 1,8%. Концентрированный экстракт направляют в распылительную сушилку MAPC-1, при температуре распыляемого воздуха на входе 200^oC, на выходе 85^oC. Сухой продукт обрабатывают 96% этиловым спиртом при соотношении 1:3, при температуре 40^oC и сушат при комнатной температуре. Вес полученного препарата равен 17 г, что составляет 6% выхода ДНК, при содержании ДНК равном 69%.

Пример 2.

3 кг измельченного до фарша сырья обрабатывают 10% раствором NaCl в соотношении 1: 5 (сырье : 10% раствор NaCl). Экстрагирование проводят в течение 3,5 часов при температуре 105^oC. Затем смесь подвергают грубой фильтрации через марлю, после чего подают на проточную центрифугу. Полученный экстракт подвергают ультрафильтрации через плоские мембраны 100000 Дальтон. Концентрированный раствор нуклеопротеина содержит 3% сухих веществ, концентрирование проводят при комнатной температуре 25^oC.

Сушку концентрированного экстракта проводят на распылительной сушке марки MAPC-1 при температуре распыляемого воздуха на входе 210^oC, на выходе 92^oC.

Для удаления липидов сухой препарат промывают нагретым до 50^oC этиловым спиртом в соотношении 1:5, готовый препарат нуклеопротеина сушат на воздухе при комнатной температуре.

Вес препарата - 75 г
Выход ДНК - 3,05
Содержание ДНК - 68%
Пример 3.

Получение нуклеинового комплекса из 1000 г текучих молок проводят в условиях примера 1, но сушку концентрированного экстракта ДНК проводят сублимационным способом. Для этого экстракт наливают в кюветы слоем не более 10 мм, замораживают при температуре -30^oC и сублимируют в течение 36 часов, доводя конечную температуру сушки до +20^oC. Вес полученного препарата равен 59 г, что составляет 6% выхода ДНК, при содержании ДНК равной 69%.

Пример 4.

Получение нуклеинового комплекса из 2 кг измельченного до фарша сырья проводят в условиях примера 2, но сушку концентрированного экстракта ДНК проводят в вакууме при 10^-1 мм рт.ст. при температуре 80^oC. Вес полученного препарата равен 75 г, что составляет 4,0% выхода ДНК, при содержании ДНК равном 68%.

Пример 5.

Получение нуклеинового комплекса из 1000 г измельченного до фарша сырья проводят в условиях примера 2, но сушку концентрированного экстракта ДНК проводят в вакууме при 10^-2 мм рт.ст. При температуре 60^oC. Вес полученного препарата равен 37,5 г, что составляет 3,6% выхода ДНК при содержании ДНК равной 67%.

Способ включает измельчение рыбных молок до фарша, обработку его 7-10%-ным раствором хлорида натрия при соотношении сырье: раствор соли 1:(4-5) в течение 2,5-3,5 ч при температуре кипения, отделение экстракта ДНК от плотной части, ультрафильтрацию с концентрированием экстракта до содержания сухих веществ 1,8-3%, сушку препарата, обработку его этанолом при 40-50^oС, сушку на воздухе. Технический результат: выход ДНК 4,5-6,0%, содержание ДНК - не менее 65%. 3 з.п. ф-лы.

1. Способ получения нуклеопротеинового комплекса, включающий измельчение рыбных молок, обработку его раствором солей, отделение экстракта, выделение из него конечного продукта и сушку, отличающийся тем, что измельченные молоки обрабатывают 7 - 10%-ным раствором хлорида натрия при соотношении сырья: раствор соли, равном 1: (4-5), при температуре кипения в течение 2,5-3,5 ч, экстракт ДНК отделяют и направляют на ультрафильтрацию с концентрированием до содержания сухих веществ 1,8 - 3,0%, концентрированный экстракт сушат, после чего сухой продукт обрабатывают этанолом при температуре 40 - 50^oC в соотношении продукт : этанол, равном 1 : (3-6), и сушат на воздухе. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что сушка концентрированного экстракта ДНК проводят распылительным способом при температуре распыляемого воздуха на входе сушилки, равной 225±25^oC, а на выходе - 90±5^oC. 3. Способ по п.1, отличающийся тем, что сушку концентрированного экстракта ДНК проводят сублимационным способом при температуре -30...+20^oС. 4. Способ по п.1, отличающийся тем, что сушку концентрированного экстракта ДНК проводят в вакууме при 10^-1 - 10^-2 мм рт.ст. при температуре 60 - 80^oС.