СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГИППУРОВОЙ И БЕНЗОЙНОЙ КИСЛОТ Российский патент 1997 года по МПК G01N30/02 

Настоящее изобретения относится к области анализа сложных химических веществ, например, мумие, хроматографическим методом на содержание карбоновых кислот, в частности, гиппуровой (ГК) и бензойной (БК) кислот. Точное знание содержания этих кислот в моче человека необходимо, например, для оценки защитной функции печени, которая обезвреживает ядовитые вещества. Скорость образования и выделение ГК у человека служит одним из показателей состояния печени. Согласно принятой в медицинской практике методике исследования функции печени (проба Квика-Пытеля), в организм человека вводят бензойную кислоту (БК) слабое ядовитое соединение, а затем в течение нескольких часов определяют в отдельных порциях мочи содержание ГК. Введенная в организм БК полностью выделяется с мочой как в свободном состоянии, так и в соединении с глицином в виде ГК. По количеству выделенной ГК судят о способности организма обезвреживать БК. При заболеваниях печени объем и скорость выделения ГК уменьшается. В норме в суточной моче человека содержится около 700 мг этой кислоты, которая образуется по реакции конденсации из БК и глицина, а также в результате разрушения некоторых ароматических соединений, входящих в состав растительных продуктов.

Диагностическое назначение методов обнаружения ГК накладывает жесткие требования к количественному определению ГК, и делает необходимым разработку достоверного и надежного способа одновременного определения ГК и БК. Последнее особенно важно для оценки качества мумие известного природного вещества, используемого в традиционной и народной медицине.

Известен способ, описанный в работе [1] заключающийся в том, что содержание гиппуровой кислоты в моче определяли методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖК). Использовали колонку, заполненную сорбентом с образующей фазой (Partisil OДS-2, диаметр частиц 10 мкм), подвижная фаза представляет смесь 1% раствора уксусной кислоты и ацетонитрила, взятых в соотношении 4: 1, оптимальное значение рН 3,1. 100 мкл предварительно выдержанной на холоде и профильтрованной на стеклянном фильтре мочи суточного сбора смешивают с 900 мкл 1N уксусной кислоты и отбирали 20 мкл для хроматографического анализа. Количественное содержание ГК оценивали графически по калибровочной зависимости (0,1-105 г/л, т.е. 0,56-8,4 мм). Время выхода ГК составляло 250 с. Длина волны детектора 250 нм, скорость подачи элюента 1,35 мл/мин.

Недостатком данного метода является необходимость длительного выдерживания образца при пониженной температуре, невозможность одновременного определения содержания БК, сопутствующей гиппуровой. Реализуемое в цитируемой работе низкое значение рН элюента находится ниже значений рК обеих анализируемых кислот, предопределяет равные времена выхода кислот и делает невозможным их совместное определение.

Наиболее близким техническим решением является способ хроматографического анализа мочи здорового мужчины, где одновременно определяются ГК и БК [2] Способ заключается в том, что содержание гиппуровой и бензойной кислот определяют методом высокоэффективной жидкостной хроматографии.

Аликвотную часть мочи после 24 часов выдерживания в холодильнике, смешивали с 1N раствором уксусной кислоты и отбирали пробу для хроматографирования. Пробу вводят в хроматографическую колонку. Элюирование проводят раствором, состоящий из 1% раствора уксусной кислоты и ацетонитрила (4:1) на хроматографической колонке с обращенной фазой (сорбентом) размером 250х4,6 мм. В качестве сорбента используют "Портсил ОДС-2" диаметром 10 мкм. Детектирование элюируемых компонентов осуществляют на длине волны 254 нм.

Недостатками прототипа являются:
большая длительность процесса, составляющая более 120 мин;
в связи с тем, что одновременно с ГК и БК в анализируемой пробе присутствуют и определяются в этих же условиях большое число других соединений, есть вероятность ошибочного принятия за анализируемые кислоты других соединений, что говорят о недостаточной достоверности метода;
к таким вещам, как мумие, в котором содержание ГК и БК колеблется от 0,2 до 15% данный метод не применим, т.к. позволяет определить вышеупомянутые кислоты при их содержании до 0,15%
Это особенно важно при исследовании мумие, где могут одновременно присутствовать ГК и БК в незначительных количествах, а кислотный гидролиз невозможен из-за наличия в пробе соединений пептидной природы, могущих вносить непредсказуемые погрешности в результаты анализа. ГК попадает в мумие с мочой животных, употребивших исходное вещество, а наличие БК связано с растениями. Поэтому количественное содержание ГК и БК в мумие отражает возможную загрязненность исходного природного вещества и, тем самым, характеризует его функциональную пригодность.

Существо изобретения состоит в том, что в известном способе количественного определения гиппуровой и бензойной кислот, заключающимся в приготовлении пробы, введении ее в хроматографическую колонку, заполненную сорбентом, элюирования и детектирования элюируемых компонентов, приготовление пробы приводят посредством гельфильтрации, а элюирование проводят раствором 0,01-0,03% фосфорной кислоты в метаноле или этаноле при соотношении компонентов 50^oC50^oC80^oC20 по объему со скоростью пропускания 20-50.10^-6 л/мин.

Задачами настоящего изобретения являются:
сокращение продолжительности анализа;
получение достоверных сведений о присутствии и количествах гиппуровой и бензойной кислот;
возможность определения этих кислот в сложных природных веществах, например, в мумие.

Сущность изобретения поясняется примерами.

Пример 1. 50 мкл 10% раствора мумие подвергают гельфильтрации на колонке с сефадексом у-10, в течение 10 мин. Затем 25 мл низкомолекулярной фракции наносят на хроматографическую колонку с обращенной фазой С-18 и элюируют смесью 0,01% фосфорной кислоты с метанолом в соотношении 50^oC50 по объему со скоростью 20.10^-6 л/мин. Детектируют на длине волны 230 нм.

Результаты анализа представлены в таблице.

Пример 2. Способ аналогичен примеру 1. Элюируют смесью 0,02% фосфорной кислоты с метанолом в соотношении 40: 60 по объему со скоростью 30.10^-6 л/мин.

Пример 3. Способ аналогичен примеру 1. Элюируют смесью 0,03% фосфорной кислоты с метанолом в соотношении 80^oC20 по объему со скоростью 50.10^-6 л/мин.

Пример 4. Способ аналогичен примеру 1. Элюируют смесью 0,01% фосфорной кислоты с этанолом в соотношении 50^oC50 по объему со скоростью 20.10^-6 л/мин.

Пример 5. Способ аналогичен примеру 1. Элюируют смесью 0,02% фосфорной кислоты с этанолом в соотношении 40^oC60 по объему со скоростью 30.10^-6 л/мин.

Пример 6. Способ аналогичен примеру 1. Элюируют смесью 0,03% фосфорной кислоты с этанолом в соотношении 80^oC20 по объему со скоростью 50.10^-6 л/мин.

Результаты анализа представлены в таблице.

Использование предложенного способа позволяет в 6-8 раз сократить продолжительность анализа, снизив при этом процент ошибки более чем в 2 раза. Предложенный способ позволяет определить количество бензойной и гиппуровой кислот в сложных природных веществах, например, в мумие, для чего способ прототип вообще не может быть использован.

Использование: при анализе соединений, содержащих одновременно гиппуровую и бензойные кислоты. Сущность изобретения: методом гельфильтрации готовят пробу анализируемого вещества, вводят ее в хроматографическую колонку, заполненную сорбентом, и элюируют раствором 0,01-0,0300% фосфорной кислоты в метаноле или этаноле, взятых в соотношении от 50-50 до 80-20 по объему со скоростью пропускания 20-50.10 л/мин, после чего детектируют. 1 табл.

Способ количественного определения гиппуровой и бензойной кислот, включающий приготовление пробы, введение ее в хроматографическую колонку, заполненную сорбентом, элюирование и детектирование элюируемых компонентов, отличающийся тем, что приготовление пробы проводят посредством гельфильтрации, а элюирование проводят раствором 0,01 0,03%-ной фосфорной кислоты в метаноле или этаноле при соотношении компонентов от 50 50 до 80 20 по объему со скоростью пропускания 20 50•10^-6 л/мин.