СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ АНАЭРОБНЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ К АНТИМИКРОБНЫМ ХИМИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИМ ПРЕПАРАТАМ Российский патент 1997 года по МПК C12Q1/04 C12Q1/02 

Изобретение относится к медицине, в частности к микробиологии, и касается определения чувствительности анаэробных бактерий к антимикробным химиотерапевтическим препаратам.

Известен способ определения чувствительности микроорганизмов к антимикробным химиотерапевтическим препаратам методом серийных разведений, состоящий в том, что готовят убывающие разведения препарата в питательной среде, засевают среды исследуемой культурой микроорганизмов, инкубируют в термостате при оптимальной для данных микроорганизмов температуре до появления видимого роста, и по наличию или отсутствию роста судят о чувствительности микроорганизма к препарату [1]
Однако, этот метод является очень громоздким, длительными и трудоемким. Он требует приготовления большой серии разведений препарата, а поскольку в клинической практике необходимо бывает определить чувствительность к 20 30, а иногда и более антимикробным химиотерапевтическим препаратам, то объем исследований многократно возрастает. Кроме того, для определения чувствительности данным способом обычно затрачивается 2 3 сут (до появления видимого роста культуры микроорганизмов), что значительно затягивает срок бактериологического исследования и абсолютно не удовлетворяет потребностям клинической практики. Этот метод может быть использован только в исключительных случаях при индивидуальном подборе антимикробной химиотерапии особо тяжелым больным, но не пригоден для массовых рутинных исследований.

Прототипом может служить способ определения чувствительности микроорганизмов к антимикробным химиотерапевтическим препаратам методом диффузии в агаре с применением стандартных бумажных дисков, состоящий в том, что плотную питательную среду засевают исследуемыми, микроорганизмами, наносят бумажные диски, пропитанные антимикробными химиотерапевтическими препаратами, инкубируют в термостате при оптимальной для данных микроорганизмов температуре до появления видимого роста, и по наличию зоны задержки роста вокруг дисков судят о чувствительности микроорганизма к препарату [2]
Этот способ при определении чувствительности анаэробных микроорганизмов обладает целым рядом недостатком, существенно ограничивающих его возможности. Во-первых, способ является качественным и не позволяет получить количественной или полуколичественной оценки чувствительности тестируемых штаммов анаэробов к антимикробным химиотерапевтическим препаратам. Во-вторых, на сегодняшний день в мировой практике еще не разработаны критерии для оценки чувствительности анаэробных бактерий к антимикробным химиотерапевтическим препаратам, как это сделано для аэробных бактерий, поэтому для оценки чувствительности бактериологии вынуждены ориентировочно пользоваться критериями, разработанными для аэробных бактерий, что ведет к значительным искажениям достоверности результатов исследования. В-третьих, при определении чувствительности в анаэробных условиях, диаметры зон задержки роста у ряда антимикробных химиотерапевтических препаратов могут изменяться за счет наличия CO₂ и других факторов в анаэробной атмосфере. В-четвертых, для определения чувствительности данным способом затрачивается обычно 2 3 суток (до появления видимого роста культуры микроорганизмов), что значительно затягивает срок бактериологического исследования и абсолютно не удовлетворяет потребностям клинической практики.

Цель изобретения повышение точности и ускорение определения чувствительности анаэробных бактерий к антимикробным химиотерапевтическим препаратам за счет использования инструментального учета результатов.

Способ осуществляют следующим образом. По общепринятой методике готовят взвесь тестируемых анаэробных микроорганизмов. Затем инокулят вносят в пробирки с жидкой питательной средой для культивирования анаэробов. Исследуемую пробу разделяют на опытную и контрольную части. Число опытных проб соответствует числу тестируемых антимикробных химиотерапевтических препаратов. Регистрируют исходный хроматографический профиль, после чего в каждую пробирку с опытной пробой помещают стандартные диски с химиотерапевтическими препаратами, причем количество дисков подбирается таким образом, чтобы в пробе создавались концентрации химиотерапевтического препарата, равная его концентрации в сыворотке крови при введении обычных терапевтических доз (табл. 1). Пробы инкубируют в термостате в анаэробных условиях в течение 12 часов, после чего определяют хроматографический профиль повторно и сравнивают между собой полученные хроматографические профили метаболитов. Схема хроматографического определения чувствительности анаэробных бактерий к антимикробным химиотерапевтическим препаратам показана на фиг. 1.

Изменение хроматографического профиля конечных продуктов метаболизма анаэробных бактерий под действием антимикробного химиотерапевтического препарата, по сравнению с контролем культурой, не подвергшейся такому воздействию, является отражением чувствительности этих микроорганизмов к испытываемому препарату и дает возможность более объективно судить о степени чувствительности анаэробных микроорганизмов по сравнению с таким известным критерием, как диаметр зоны задержки роста. Наши исследования установили, что характерными изменениями хроматографических профилей анаэробов под воздействием антимикробных химиотерапевтических препаратов являются, во-первых, выпадение большинства пиков метаболитов продуцируемых бактериальной клеткой; во-вторых, появление ряда пиков метаболитов, отсутствующих в норме в контроле; в-третьих, снижение высоты и площади пиков. Все наблюдаемые на хроматограмме изменения не являются равноценными. Наиболее часто отмечается снижение высоты и площади пиков, что свидетельствует о неглубоких обратимых изменениях метаболизма анаэробных бактерий под действием антимикробного химиотерапевтического препарата. Данный антимикробный химиотерапевтический препарат замедляет метаболические процессы в бактериальной клетке и накопление метаболитов в среде культивирования идет более медленно, чем у контрольной культуры, не подвергшейся такому воздействию. Чем больше уменьшается площадь и высота хроматографических пиков, тем выше чувствительность микроорганизма к тестируемому антимикробному химиотерапевтическому препарата (фиг. 2).

Наиболее значительные изменения хроматографических профилей анаэробных микроорганизмов получаются при воздействии на них таких высокоэффективных антианаэробных препаратов, как метронидазол и клиндамицин (фиг. 3). Метронидазол вызывает выпадение большей части хроматографических пиков метаболитов, что свидетельствует о грубых, необратимых повреждениях метаболизма бактерий. Хроматограммы штаммов, высокочувствительных к метронидазолу, напоминают изоэлектрическую линию.

Следует отметить, что подобных изменений хроматографического профиля культур анаэробов под воздействием клиндамицина не наблюдается. Для повреждающего действия клиндамицина характерны изменения метаболизма клетки в виде инверсии хроматограммы, то есть наряжу с уменьшением высоты и площади и полным выпадением ряда нормальных пиков, на хроматограмме регистрировались атипичные пики, отсутствующие в норме в контроле. Причина появления этих атипичных пиков остается неизвестной, однако, есть предположение, что такие пики являются метаболическим отражением распада внутренних структур бактериальной клетки под действием антибиотика. Подтверждением сказанного может служить тот факт, что на хроматограмме штаммов анаэробов, подвергшихся воздействию клиндамицина, на 4 мин 38 с появлялся пик урацила. Как известно, урацил это азотистое основание, входящее в состав РНК. Появление пика урацила, очевидно, обусловлено освобождением этого азотистого основания при распаде рибосомальной РНК под воздействием клиндамицина.

Различия в изменения хроматографических профилей культур анаэробов, подвергшихся воздействию метронидазола и клиндамицина, можно объяснить различным механизмом антибактериального действия этих препаратов. Как известно, метронидазол, восстанавливаясь в короткоживущий промежуточный продукт, ингибирует репликацию бактериальной ДНК у анеаэробов. Точкой приложения антимикробного действия клиндамицина в бактериальной клетке являются рибосомы, он необратимо ингибирует 50 S субъединицу рибосом. Вероятно, что повреждение химиотерапевтическим препаратом различных ультратонких структур бактериальной клетки ведет к неодинаковым изменениям метаболической активности, что и регистрируется на хроматограмме.

Для оценки степени чувствительности анаэробных микроорганизмов к антимикробным химиотерапевтическим препаратам мы использовали отношение суммарных площадей хроматографических пиков опытного и контрольного образцов, в обозначенное TPA_R и определяемое по формуле:

где S_n площади хроматографических пиков опытного образца;
площади хроматографических пиков контрольного образца;
TPA_R отношение суммарных площадей хроматографических пиков опытного и контрольного образцов, в
Высокая чувствительность (1 степень) определялась при показателе TPA_R менее 20 средняя чувствительность (2 степень) определялась при показателе TPA_R 21 40 низкая чувствительность (3 степень) 41 70 и практически отсутствие чувствительности (4 степень) 71 и выше.

Клиническая апробация метода проводилась на 50 больных с гнойно-воспалительными заболеваниями ЛОР-органов. Мы сравнили предложенный нами способ определения чувствительности с методом диффузии в агаре. Сравнение способов определения чувствительности анаэробных микроорганизмов к антимикробным химиотерапевтическим препаратам (хроматографическим методом и методом диффузии в агаре) приведено в табл. 3.

Процент совпадения данных хроматографического способа определения чувствительности и способа диффузии в агаре у больных с гнойно-воспалительными заболеваниями ЛОР-органов в случае высокой чувствительности (1 степени) составил 79,5 в случае средней чувствительности (2 степени) 73,9 в случаях низкой чувствительности (3 степени) 62,7 в случае отсутствия чувствительности (4 степени) 53,14
При определении чувствительности к азлоциллину процент совпадения данных испытуемых методов составил 25,8 при определении чувствительности к левомицетину 86,4 к эритромицину 74,6 к пенициллину 77,3 к клиндамицину 80,3 к метронидазолу 97,9
Конкретный пример выполнения способа.

По оптическому стандарту мутности готовят 1 млд. взвесь музейного штамма Bacteroides oralis. Затем вносят по 1 мл приготовленной взвеси в 2 пробирки с 5 мл жидкой питательной среды для анаэробов. Доводят рН пробы до 2,0 50-ным раствором серной кислоты. Проводят экстракцию этиловым эфиром 2 раза по 1 мл. Полученный эфирный экстракт в количестве 2 5 мкл вводят непосредственно в хроматограф. Регистрируют исходную хроматограмму. После этого в опытную пробу добавляют 1 стандартный диск, содержащий 80 мкг/мл метронидазола. Пробирки инкубируют 8 ч в анаэростате при 37^o C. После чего извлекают и экстрагируют накопившиеся метаболиты. Вводят экстракт в хроматограф и регистрируют хроматограмму. Сравнивают хроматограммы опытной и контрольной пробы. Проводят расчет по формуле:
,
что соответствует высокой степени чувствительности.

Пример 2. Аналогичным образом готовят суспензию музейного штамма и инокулируют в пробирки с жидкой питательной средой, экстрагируют и регистрируют исходную хроматограмму. Затем в опытную пробирку вносят 4 диска, содержащих по 2 мкг/мл клиндамицина. Пробирки инкубируют 12 ч в анаэростате при 37^o C. После чего извлекают, экстрагируют накопившиеся метаболиты, вводят экстракт в хроматограф и регистрируют хроматограмму. Сравнивают хроматограммы опытной и контрольной проб. Проводят расчет по формуле:

что соответствует средней степени чувствительности.

Корреляция данных хроматографического способа и способа диффузии в агаре по определению степени чувствительности 53,14 79,5 по определению чувствительности к отдельным антимикробным химиотерапевтическим препаратам 74,6 97,9

Использование: медицина, микробиология. Сущность изобретения: предложен способ определения чувствительности анаэробных микроорганизмов к антимикробным химиотерапевтическим препаратам. Способ состоит в том, что взвесь тестируемых анаэробных микроорганизмов вносят в пробирки с жидкой питательной средой для культивирования анаэробов. Исследуемую пробу разделяют на опытную и контрольную части. Затем регистрируют исходный хроматографический профиль, после чего в каждую пробирку с опытной пробой помещают стандартные диски с химиотерапевтическими препаратами. Пробы инкубируют в термостате в анаэробных условиях в течение 8 - 12 ч, после чего определяют хроматографический профиль повторно и сравнивают опытную и контрольную хроматограмму по набору и площади пиков, затем по их разнице судят о наличии чувствительности. Способ позволяет провести ускоренное определение чувствительности анаэробных бактерий к антимикробным химиотерапевтическим препаратам. 3 ил. 3 табл.

Способ определения чувствительности анаэробных микроорганизмов к антимикробным химиотерапевтическим препаратам, включающий инкубацию исследуемых микроорганизмов в присутствии пропитанных антимикробным химиотерапевтическим препаратом стандартных бумажных дисков в питательной среде с последующим учетом результатов, отличающийся тем, что определение проводят в жидкой питательной среде, перед инкубацией аликвоту пробы отбирают, экстрагируют этиловым эфиром и полученный экстракт хроматографируют на газовом хроматографе для получения контрольной хроматограммы, далее пробы инкубируют в течение 8 12 ч, затем подвергают экстракции и хроматографии в тех же условиях для получения опытной хроматограммы, а результаты оценивают по формуле

где S_п площадь пиков опытной хроматограммы;
площадь пиков контрольной хроматограммы;
ТРА_р отношение суммарных площадей пиков опытной и контрольной хроматограмм,
и оценивают микроорганизмы при ТРА_р < 20% как чувствительные, при ТРА_р 20 40% среднечувствительные, при ТРА_р 40 70% - умеренноустойчивые, а при ТРА_р > 70% устойчивые.