СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ ИММУНОДЕФИЦИТНОГО СОСТОЯНИЯ Российский патент 1997 года по МПК G01N33/53 G01N33/68 

Изобретение относится к клинической иммунодиагностике, а именно к способам выявления иммунодефицитного состояния (ИДС) по уровню тимических факторов, циркулирующих в организме млекопитающих.

Известен способ выявления ИДС по уровню циркулирующих факторов в плазме или сыворотке крови млекопитающих, в том числе человека. При этом используется периферическая кровь в качестве биологического материала для проведения исследования. Метод основан на способности присутствующих в крови тимических факторов индуцировать на незрелых Т-лимфоцитах рецепторы, которые ответственны за образование розеток с эритроцитами барана. Для обнаружения этих факторов плазму или сыворотку донора фильтруют через мембраны фирмы "Амикон" для удаления высокомолекулярных белков. Разные количества фильтрата (по принципу двойного разведения) добавляют к клеткам селезенки тимэктомированных мышей, которые вследствие удаления тимуса потеряли способность к реакции с азатиоприном. Максимальное разведение фильтрата сыворотки или плазмы, которое вызывает восстановление чувствительности к азатиоприну у 50% лимфоцитов, является характеристикой уровня циркулирующих тимическихфакторов в организме млекопитающих и обозначается как сывороточная тимическая активность (СТА). Величину СТА обычно выражают в log₂, где N разведение фильтрата.

Если при обследовании пациента выявленное разведение фильтрата сыворотки или плазмы крови, воcстанавливающее чувствительность незрелых Т-лимфоцитов к ингибирующему действию азатиоприна, оказывается ниже возрастной нормы, говорят об иммунодефицитном состоянии Т-клеточного типа.

Несмотря на свою исключительную информативность и значимость для постановки диагноза ИДС и определения необходимости и эффективности проведения иммунокорригирующей терапии, способ имеет существенный недостаток - необходимость взятия венозной крови, часто многократно. Это травматично, болезнено, особенно у детей, сопряжено с риском занесения инфекции.

Задачей изобретения является создание неинвазивного (бескровного и безболезненного) способа определения ИДС по уровню циркулирующих тимических факторов в организме млекопитающих.

Решение поставленной задачи осуществляется за счет того, что в качестве исходного материала для определения уровня циркулирующих тимических факторов используют мочу. Основанием для такого подхода послужили полученные нами данные о том, что в моче здорового человека присутствует материал, проявляющий свойственную для тимических факторов активность в ряде биологических тестов, в том числе и в тесте восстановления чувствительности фоновых розеткообразующих клеток селезенки тимэктомированных мышей к ингибирующему действию азатиоприна.

Ранее определение уровня тимической активности в моче не проводили.

Предлагаемый способ включает следующие этапы.

1. Забор мочи. При наличии в ней мути, мочу центрифугируют 2000 об/мин, 10 мин, 10^oС.

2. Хроматография образца осветленной мочи на колонке с сефадексом G-15. Колонка предварительно откалибрована по маркерам с известной молекулярной массой.

3. Отбор материала для определения биологической активности и проверка его на токсичность.

4. Постановка теста восстановления чувствительности фоновых розеткообразующих клеток селезенки тимэктомированных мышей к ингибирующему действию азатиоприна под влиянием разных разведений отобранных проб (метод Баха, 1975).

Пример. Определение иммунодефицитного состояния по предлагаемому способу.

1. Из баночки с мочой пациента А. отбирают 5 мл образца и центрифугируют 1200 об/мин 10 мин, 10^oС.

2. 3 мл осветленной мочи наносят на колонку с сефадексом G-15, которую откалибровали смесью веществ с известной молекулярной массой: голубой декстран (2 х 10⁶ Д), витамин В12 (1355 Д), динитрофенил-лейцин (300 Д). Интересующая нас область выходит в интервале 36 45 мл элюата.

3. Аликвоты из каждой фракции этой области смешивают с равным объемом среды 199. Материал, вышедший с 43 мл элюата, изменил цвет среды 199 (среда пожелтела) и был исключен из дальнейшего исследования.

4. Материал, соответствующий 36 42 мл элюата в разных разведениях (от 1: 4 и выше) проверяют на способность восстановления чувствительности фоновых розеткообразующих клеток селезенки тимэктомированных мышей к ингибирующему действию азатиоприна (1).

Наибольшее разведение образца, которое вызвало ингибирование количества розеток в присутствии азатиоприна на 50% по сравнению с контролем, не содержащим азатиоприна оказалось 1:16.

Уровень тимических гормонов в моче у пациента А. составил log₂ 16=4. Одновременно в этот же день у пациента А. была взята кровь для оценки уровня СТА по методу Баха. Найдено, что уровень СТА в крови пациента А. также составил log₂16=4. Учитывая, что пациенту А. 9 лет (возрастная норма уровня СТА для этого возраста ≥ 5, можно говорить об иммунодефицитном состоянии этого больного (тимическая недостаточность).

В таблице представлены данные по параллельному определению уровня циркулирующих тимических факторов в моче и крови обследованных пациентов (кровь и мочу у всех обследуемых брали в один и тот же день).

Использование: медицина, клиническая иммунодиагностика. Сущность изобретения: способ предусматривает выявление иммунодефицитного состояния по моче животного или человека. Для этого мочу центрифугируют, хроматографируют и полученный материал испытывают в тесте Баха (1975) по чувствительности лимфоцитов селезенки тимэктомированных мышей к действию азатиоприна. 1 табл.

Способ выявления иммунодефицитного состояния, включающий восстановление чувствительности фоновых розеткообразующих клеток селезенки тимэктомированных мышей к ингибирующему действию азатиоприна, путем воздействия на них пробой биологической жидкости обследуемого, полученной в результате фракционирования этой жидкости, отличающийся тем, что в качестве жидкости используют мочу, подвергнутую последовательно центрифугированию и хроматографии на колонке с сефадексом G-15, пробу отбирают в зоне между свободным объемом колонки и областью выхода витамина В-12 (мол.м.1355 D), которую определяют предварительной калибровкой колонки G-15 смесью маркеров с известной молекулярной массой.