СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММУНОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНОГО ВЕЩЕСТВА ИЗ МОЧИ МЛЕКОПИТАЮЩИХ, В ТОМ ЧИСЛЕ И ЧЕЛОВЕКА, ОБЛАДАЮЩЕГО БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТЬЮ СЫВОРОТОЧНОГО ТИМИЧЕСКОГО ФАКТОРА Российский патент 1999 года по МПК A61K35/22 

Изобретение относится к области медицины и ветеринарии, а именно к иммунологии и может быть использовано для получения иммунотропного вещества из мочи для профилактики и/или иммунокоррекции тимусзависимых иммунодефицитных состояний у человека и животных. Более того, это изобретение может помочь и в решении научных задач.

Известно, что в периферической крови млекопитающих (в том числе и людей) содержится секретируемый тимусом полипептидный фактор, получивший название сывороточного тимического фактора (СТФ). Этот фактор играет важную роль в поддержании иммунного статуса организма, в контроле реакций распознавания своего и чужого (чужеродных опухолевых клеток в том числе), в способности организма адекватно противостоять неблагоприятным внешним воздействиям. До настоящего времени не выяснен вопрос взаимосвязи между СТФ и другими пептидами тимуса, хотя показано, что СТФ отщепляется от предшественника или носителя. Неизвестна и судьба самого СТФ в организме.

С другой стороны нами было показано, что в моче здорового человека присутствует материал, проявляющий свойственную для СТФ активность в тесте Баха (этот тест используется для определения уровня тимических факторов, циркулирующих в крови млекопитающих) (1). По результатам исследования нами получен патент, позволяющий выявлять иммунодефицитное состояние человека, обусловленное недостатком тимических факторов в организме, не по крови, а по моче (2). Однако, сравнительное изучение иммунобиологических и физико-химических свойств СТФ и иммунологически активного материала мочи невозможно, поскольку до настоящего времени не разработан способ получения из мочи материала, обладающего иммунологической активностью, сходной с таковой СТФ. Это связано прежде всего со спецификой фракционирования смеси большого количества низкомолекулярных веществ, каковой является моча.

Целью изобретения является создание способа получения из мочи материала, обладающего иммунологической активностью, сходной с таковой сывороточного тимического фактора.

Заявка не имеет прототипа ни по способу получения иммунопропного материала, ни по сырью, которое для этой цели используется.

Предлагаемый способ включает в себя этапы:
1. Забор мочи, ее центрифугирование для удаления взвеси частиц.

2. Определение наличия в осветленной моче материала, проявляющего свойственную для СТФ активность в тесте Баха.

3. Хроматография образца осветленной мочи на геле Toyopearl HW-40 в колонке с геометрическими размерами 2,5 х 30 см. Отбор материала и его лиофилизация.

4. Хроматография лиофилизированного материала на геле Toyopearl HW-40 в колонке с геометрическими размерами 1 х 100 см, отбор материала и его лиофилизация.

5. Обессоливание материала на колонке с сефадексом G-15 и его лиофилизация
По этой схеме иммунологически активный материал был выделен из мочи 7 пациентов.

Ниже приводим пример получения иммунологически активного материала из мочи по предлагаемому способу.

Пример.

1. Из баночки с мочой пациента А отбирают 10 мл образца и центрифугируют 1200 об/мин 10 мин., 10^oC.

2. 3 мл осветленной мочи хроматографируют на колонке с сефадексом G-15 и проверяют материал, выходящий в зоне между свободным объемом колонки и областью выхода витамина В-12 (м.м. 1355 Д) на способность восстанавливать чувствительность фоновых розеткообразующих клеток селезенки тимэктомированных мышей к ингибирующему действию азатиоприна. При наличии материала, обладающего активностью СТФ, исходную мочу используют для дальнейшей работы.

3. 4 мл осветленной мочи наносят на колонку с Toyoperl HW 40 гелем с геометрическими параметрами 2,5 х 30 см, уравновешенную 0,2 М NaCl. Колонку предварительно откалибровали смесью веществ с известной молекулярной массой: голубой декстран (2•10⁶ Д), ингибитор трипсина (6500 Д), витамин В 12 (1355 Д). Элюцию проводят 0,2 М раствором NaCl, скорость элюции - 24 мл/час, объем собираемых фракций - 4 мл. Интересующий нас материал выходит в интервале 80 - 100 мл элюата. Этот материал собирают и лиофилизируют. Полученный профиль элюции представлен на фиг. 1. Стрелками отмечены области выхода маркерных веществ; заштрихована область сбора материала.

4. Лиофилизированный материал, полученный в п.3 примера, растворяют в 2 мл дистиллированной воды и наносят на колонку с Toyopearl HW-40 с геометрическими параметрами (1х100 см), уравновешенную 0,2 М раствором NaCl. Колонка предварительно откалибрована смесью веществ с известной молекулярной массой: голубой декстран (2•10⁶ Д), ингибитор трипсина (6500 Д), витамин В 12 (1355 Д). Элюцию проводят 0,2 м раствором NaCl, скорость элюции: мл/час, объем собираемых фракций - 1 мл. Интересующий нас материал выходит в интервале 35-40 мл элюата. Его собирают и лиофилизируют. Полученный профиль элюции представлен на фиг.2. Стрелками отмечены области выхода маркерных веществ; заштрихована область сбора материала.

5. Лиофилизированный материал, полученный в п.4 примера, растворяют в 2 мл дистиллированной воды и обессоливают на колонке с сефадексом G-15 с геометрическими параметрами 2,5 х 10 мл. Колонка предварительно откалибрована маркерами известной молекулярной массы голубой декстран (2•10⁶ Д), витамин В 12 (1355 Д), динитрофениллейцин (ДНФ) 300 Д. Элюцию проводят дистиллированной водой со скоростью 60 мл/час. Материал, соответствующий интервалу 30 - 40 мл элюата (фиг.3) представляет собой искомый продукт, который собирают и лиофилизируют. Полученный профиль элюции представлен на рис.3, заштрихована область сбора материала.

После лиофилизации материал представляет собой пушистый белый порошок, молекулярная масса 1000-6000 дальтон (по хроматографии на сефадексе G-15 в присутствии маркеров)
В диапазоне доз 20 - 40 мкг на 6 • 10⁶ клеток селезенки тимэктомированных мышей этот материал вызывает 50% восстановление чувствительности последних к ингибирующему действию азатиоприна, т.е. проявляет иммунологическую активность, характерную для СТФ и других тимических факторов.

Более того, в дозе 1 мкг/мышь (по сухому весу) этот материал в методе Ерне вызывает стимуляцию антителообразующих клеток в 2,5 раза по сравнению с контролем.

Литература
1. Dardenne М., Bach J-F. The sheep-cell rosette assay for the evaluation of thymic hormones. In Biological activity of thymic hormones. Ed. by Van Bekkum. Rotterdam 1975, p.235 - 245.

2. Патент "Способ выявления иммунодефицитного состояния" N 2077057, зарегистрированный в Государственном реестре изобретений 10 апреля 1997 года с приоритетом от 18 апреля 1994. С.Н.Москвина, В.Я.Арион, Е.О Дорошенкоъ

Способ включает двухэтапную хроматографию мочи на геле Toyperl HW 40, помещенном в колонке с различными геометрическими параметрами, с последующим обессоливанием конечного продукта на колонке с сефадексом G-15. Технический результат: разработан способ получения из мочи млекопитающих, в том числе и человека, материала, обладающего иммунологическими свойствами, сходными с таковыми тимических факторов. 3 ил.

Способ получения иммунологически активного вещества из мочи млекопитающих, в том числе и человека, обладающего биологической активностью сывороточного тимического фактора, заключающийся в том, что мочу, содержащую этот материал, последовательно хроматографируют на колонке 2,5 х 30 см с Toyoperl HW-40 гелем, уравновешенным 0,2 М NaCl, материал в области 80-100 мл элюата лиофилизируют, хроматографируют на колонке 1 х 100 см с Toyoperl гелем, уравновешенным 0,2 М NaCl, материал в области 35-40 мл элюта лиофилизируют и обессоливают на сефадексе G-15, отбирая конечный продукт в области мол.м 6000-1000 Дальтон.