Способ диагностики устойчивости к реализации вторичных иммунодефицитных состояний у детей с врожденным пороком сердца грудного и раннего возраста Российский патент 2024 года по МПК G01N33/49 A61B8/08 A61B5/205 

Изобретение относится к медицине, в частности к иммунологии, детской кардиологии и педиатрии и может быть использовано как в профильных стационарах, так и в амбулаторной практике.

Известен способ диагностики тимомегалии у детей (патент №2611393RU, заявка №2016111703, опубликован 21.02.2017г. в бюл. №6, класс МПК G01N33/50).

Известный способ диагностики тимомегалии у детей, заключается в определении количества копий Т-рецепторных эксцизионных колец (ТРЭК) в лимфоцитах периферической крови путем проведения полимеразной цепной реакции в режиме реального времени с использованием соответствующих праймеров и флюоресцентно-меченого олигонуклеотида с последующим расчетом числа копий Т-рецепторных эксцизионных колец по стандартной кривой, построенной по разведениям плазмиды, представленной SEQ ID NO: 1 с известной концентрацией ДНК ТРЭК, и при снижении уровня ТРЭК ниже 25,36 копий на 1 тыс. лимфоцитов у детей в возрасте до 2 лет, ниже 14,71 копий на 1 тыс. лимфоцитов - у детей дошкольного возраста 3-6 лет и ниже 4,82 копий на 1 тыс. лимфоцитов - у детей 7-10 лет диагностируют тимомегалию.

Недостатком известного способа является то, что авторы оценили биполярные трансформации вилочковой железы как вариант дисплазии с сочетанной функциональной несостоятельностью, которую оценили по уровню TREC. Способ позволяет с помощью оценки уровня TREC определить наличие тимомегалии (увеличения вилочковой железы выше повозрастных нормативов), но не позволяет выявить и диагностировать иммунодефицитные состояния у детей перенесших удаление вилочковой железы (тимэктомию) в ходе оперативного разрешения врожденных пороков сердца.

Технический результат заявленного изобретения заключается в возможности выявлять иммунодефицитные состояния у детей, перенесших полное или частичное удаление вилочковой железы в ходе оперативной коррекции врожденных пороков сердца, до развития клинической симптоматики.

Предлагается способ диагностики устойчивости к реализации вторичных иммунодефицитных состояний у детей с врожденным пороком сердца грудного и раннего возраста, на этапе подготовки к операции на сердце с сочетанной вынужденной тимэктомией или уже перенесших данную операцию, включающий (с целью оценки исходного иммунного статуса) сонографию тимуса с определением его объема и массы, или оставшейся от операции в прошлом части тимической паренхимы), определение Т- лимфоцитов с маркировкой TREC в крови методом «сухого пятна», оценку инфекционного катамнеза. Параллельно с сонографией тимуса проводят УЗИ диагностику областей верхнего средостения, лопаточно-трапециевидного треугольника, лопаточно-ключичного треугольника, грудинно-ключично-сосцевидной области с надключичными ямками шеи, области поднижнечелюстного треугольника, а также паренхимы щитовидной железы с целью выявления (отсутствия) эктопического очага (или очагов) вилочковой железы, оценивают послеоперационный иммунный статус с повторным определением Т- лимфоцитов с маркировкой TREС в крови методом «сухого пятна», оценку инфекционного катамнеза в послеоперационном периоде и повторяют оценку вышеперечисленных параметров по истечению 3 месяцев от момента операции, проводя сравнительную оценку иммунного статуса между группами детей у которых были обнаружены эктопические очаги во время ультразвуковой диагностики и у которых не было таковых.

В настоящее время иммунодефицитные состояния у детей перенесших тимэктомию выявляются только в случае появления выраженной клиники (увеличение частоты заболеваемости, продолжительности болезни, присоединении оппортунистических инфекций), поэтому так важно выявить группу риска пациентов по возникновению таких состояний раньше, обеспечив им как консервативную поддержку так и безопасное эпидемиологическое окружение. Данный способ позволяет выявить группу детей, имеющих высокую предрасположенность к развитию иммунодефицитных состояний (дети не имеющие эктопических очагов вилочковой железы) и верифицировать наличие такого состояния (по содержанию T-лимфоцитов с маркировкой TREC в крови).

Изобретение может быть использовано для выявления вторичных иммунодефицитных состояний (далее ИДС) у детей с врожденными пороками сердца (далее ВПС) грудного и раннего возраста, готовящихся или перенесших вынужденную субтотальную тимэктомию. Последняя, в 90% случаев является необходимой операцией у детей раннего возраста для осуществления оптимального доступа к сердцу во время коррекции врожденных пороков.

Влияние тимуса на формирование иммунной системы трудно переоценить, особенно в период раннего детства. Тимус – центральный орган адаптивного иммунитета, где происходят процессы созревания и пролиферации Т-лимфоцитов, формирование центральной толерантности [1,2,3]. Самая высокая продукция Т-лимфоцитов и перемещение их напериферию сохраняется до двух лет. Поэтому возрастная инволюция тимуса не приводит к катастрофическому снижению иммунитета. [4,5].

Существенным моментом является тот факт, что в раннем возрасте тимус является наиболее активным в процессе иммунного обеспечения ребенка и риск развития вторичных иммунодефицитных состояний при его удалении достаточно высок. Тем не менее, многочисленные данные об инфекционной и прочей заболеваемости тимэктомированных детей достаточно противоречивы. С большой вероятностью это можно объяснить тем, что во время эмбриогенеза зародышевые клетки вилочковой железы мигрируют по тимофарингеальному пути, оставляя, в некоторых случаях очаги эктопии по ходу их прохождения. Данные эктопические очаги чаще всего обнаруживаются в средостении (53,1%) чаще всего в перитимальной жировой клетчатке (24%) и по ходу левого диафрагмального нерва (28%), тканях шеи (49,5%) чаще всего вподнижнечелюстном треугольнике (39,6%), грудинно-ключично-сосцевидной области с надключичными ямками шеи (5%), в толще щитовидной железы (0,95%), [6-16].

Имеются исследования, где приводятся доказательства того, что функция таких очагов идентична ортотопическому тимусу и морфологически не только имеют одинаковое строение, но и проходят аналогичную акцидентальную и нормальную инволюцию с возрастом[17,18]. Возможно столь разноречивые послеоперационные и отдаленные исходы (от вполне благополучных [19-27] и до весьма критичных, где основную тяжесть составляли инфекционные заболевания и осложнения [28-35] связаны в основном с двумя причинами. Первая - когда тимус представлен солитарным органом и его удаление должно по определению негативно влиять на иммунную защиту; вторая – когда имеются несколько (или один) очагов эктопической тимической ткани, которые после удаления тимуса (как части этого континуума) инициируют вполне адекватное иммунное обеспечение [36].

Обнаружение очагов эктопии производят при помощи ультразвуковой диагностики, стандартным линейным датчиком с частотой 7,5-12,0 МГц в локализациях наиболее частого обнаружения, а именно: в области верхнего средостения, грудинно-ключично-сосцевидной области с надключичными ямками шеи, поднижнечелюстном треугольнике, а также в толще щитовидной железы. Ультразвуковая картина представлена включениями тимической ткани в виде гипоэхогенной зоны с регулярными линейными или точечными внутренними гиперэхогенными элементами. В целом, эктопический тимус и ортотопическая вилочковая железа идентичны при визуализации.

С целью выявления эктопических очагов тимической ткани данное исследование проводят: детям грудного и раннего возраста запланированным проведение оперативного вмешательства по поводу ВПС, сочетанной с вынужденной тимэктомией; и детям диспансерной группы, которым данная операция была проведена в прошлом. Как тем, так и другим, осуществляется предварительная оценка инфекционного катамнеза, но в первом случае - до операции, во втором – до и после операции. Параллельно исследуется кровь (нативная, или в виде «сухого пятна») на концентрацию лимфоцитов с маркировкой T-cell Receptor Excision Circle (далее TREC). Исследование инфекционного катамнеза и TREC проводим с целью более верифицированной оценки иммунного статуса как накануне операции, так и в послеоперационном периоде, а также, в зависимости от результатов сонографии. После проведения сонографии выделяем основную группу детей, имеющих очаги эктопированной тимической ткани и группу сравнения, где тимическая ткань была представлена только одним (солитарным) тимусом. В дальнейшем, проводим сравнительную оценку динамики иммунного статуса (в течение 3 месяцев) у детей выше обозначенных групп (инфекционный катамнез и TREC) в зависимости от результатов сонографии и тимэктомии.

Т-эксцизионные кольца TREC или T-cell receptor excision circles – (TREC) - структуры, формирующиеся во время созревания Т-лимфоцитов на этапе перестройки генов Т-клеточного рецептора (далее TCR). В процессе перестройки генов TCR происходит сближение пространственно разделенных генетических сегментов. Находящийся между ними генетический материал вырезается и замыкается в кольцо, которое не удаляется из клетки, а хранится в эписомах. В периферическом отделе иммунной системы TREC присутствуют главным образом в Т-клетках, недавно эмигрировавших из тимуса (НТЭ или RTE–Recent thymiс emigrants), которые не успели поделиться после выхода из вилочковой железы; то есть, на наивных тимических Т-лимфоцитах Снижение численности RTE происходит как при акцидентальной (случайной, с преходящим «опустошением» тимуса) инволюции тимуса в ответ на стресс, инфекцию, введение глюкокортикоидов, так и при воздействии ионизирующей радиации [2,37]. Дополнительным доказательством принадлежности данных клеток к ряду RTE является снижение их числа в ходе возрастной инволюции тимуса и после тимэктомии [2,28,39]. Содержание TREC рассматривают преимущественно как показатель Т -лимфопоэтической функции тимической ткани, а в большинстве случаев тимуса [40]. Исходя из этих представлений нами определение TREC взято за основу диагностики утраты функции удаленного (солитарного) тимуса и развития ИДС.

Способ может быть использован как в профильных стационарах, так и в амбулаторной практике.

В основе разработки данного способа диагностики устойчивости развития иммунодефицитных состояний (ИДС) при вынужденной тимэктомии у детей раннего возраста, лежит исследование, проводимое в 2022-2023 годах на базе ФГБОУ ВО КемГМУ Минздрава РФ г. Кемерово, ФГБНУ НИИ КПССЗ г. Кемерово, ГАУЗ КОКБ им. Беляева г. Кемерово, в результате которого проводилась верификация вторичного ИДС (или снижение иммунной реактивности) у 13 тимэктомированных во время операции по поводу ВПС детей, средний возраст которых, в совокупности (и в каждой из ниже перечисленных групп), составил 3года, 6мес ± 1год,1месяц (42±13мес), а средний возраст, при котором осуществлялась операция 2,5±1,5 месяца. Из них основную группу составили 4 детей, у которых, методом сонографии диагностированы эктопические тимические очаги. Группу сравнения составили оставшиеся 9 человек, у которых не обнаружено очагов тимической ткани. Эктопические очаги у детей основной группы регистрировались в грудинно-ключично-сосцевидном треугольнике – 2 случая, перитимальном жире – 1, в толще щитовидной железы – 1 случай.

При сравнительной оценке лабораторного иммунного профиля у детей вышеуказанных групп не выявлено существенных различий в лейкоцитарной формуле периферической крови, но среднее количество копий TREС в 10⁵ клеток (образцов сухой капли крови) у детей группы сравнения было существенно ниже таковых основной группы (82,3 против 340,5). В клиническом плане дети группы сравнения в отличие от основной группы демонстрировали в среднем 3-4 кратное увеличение инфекционных событий в обозреваемом катамнезе. В основном речь идет об инфекциях респираторного тракта, чаще вирусного происхождения, но у 2-х детей осложнившиеся бактериальной пневмонией. Инфекционная заболеваемость детей основной группы не отличалась от таковой детской популяции Кузбасса аналогичного возраста. Уровень инфекционной заболеваемости у тимэктомированных детей без наличия эктопических очагов был статистически значимо выше чем у таковых пациентов с обнаруженной эктопией тимуса (χ ² = 5,4 при p <0,05). Оценку результатов исследования проводили с помощью стандартных статистических методов, используя пакет прикладных программ MS Excel 2019, Statistica for Windows v. 10.0 и SPSSv. 27.0 for Windows.

Клинический случай 1.

Ребенок 4 года, 2 мес, прооперирован по поводу врожденного порока сердца (Тетрада Фалло) в возрасте 5 месяцев с тотальной тимэктомией. Спустя год после оперативного вмешательства было отмечено увеличение частоты респираторных заболеваний (до 9 ОРВИ в год) на 4 году жизни ребенок дважды перенес тяжелые пневмонии; в дальнейшем динамика инфекционной заболеваемости у пациента остается на прежнем уровне, дважды перенес COVID-19 с явлениями бронхиальной обструкции. В возрасте 4 лет была проведена оценка уровня TREC в крови данного пациента методом «сухого пятна», результат был ниже референсного значения для данного возраста (82,3 копии/10⁵ клеток при референсе более 100 копий/10⁵ клеток). Гемодинамические показатели пациента соответствовали СН 1 (ФК 1 по NYHA). При ультразвуковой диагностике очагов эктопической ткани вилочковой железы обнаружено не было. В настоящий момент ребенок рассматривается как пациент с вторичным иммунодефицитом, обусловленным тимэктомией в раннем возрасте.

Клинический случай 2.

Ребенок 3 года 8 мес., прооперирован по поводу врожденного порока сердца (полная форма атриовентрикулярной коммуникации) в возрасте 4 месяцев так же с тотальной тимэктомией. После операции до настоящего момента частота инфекционной заболеваемости сохраняется на нормальном уровне (2-4 ОРВИ в год). При исследовании уровня TREC методом «сухого пятна» результаты были выше референсных значений (323 копий/10⁵ клеток, при референсе более 100 копий/10⁵ клеток). Гемодинамические показатели пациента соответствовали СН 1 (ФК 1 по NYHA). При ультразвуковой диагностике выявлены очаги эктопии ткани вилочковой железы в щитовидную билатерально (в правой доле 6*4*5 мм, в левой доле 5*2*4 мм) овальной формы. Функция щитовидной железы при этом сохранна.

Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии, кардиологии и педиатрии, и может быть использовано для диагностики вторичных иммунодефицитных состояний у детей с врожденным пороком сердца грудного, раннего и дошкольного возраста, перенесших полное или частичное удаление вилочковой железы в ходе оперативной коррекции врожденных пороков сердца. Проводят сонографию тимуса с определением оставшейся от операции в прошлом части тимической паренхимы; УЗИ диагностику областей верхнего средостения, лопаточно-трапециевидного треугольника, лопаточно-ключичного треугольника, грудинно-ключично-сосцевидной области с надключичными ямками шеи, области поднижнечелюстного треугольника, а также паренхимы щитовидной железы; определение Т-лимфоцитов с маркировкой T-cell Receptor Excision Circle (TREC) в крови и определение частоты заболеваний ОРВИ в период после операции на сердце с тимэктомией у ребенка. При уровне Т-лимфоцитов с маркировкой TREC в крови ниже референсного значения, определенных после тимэктомии методом «сухого пятна», при отсутствии очагов эктопической ткани вилочковой железы в областях верхнего средостения, лопаточно-трапециевидного треугольника, лопаточно-ключичного треугольника, грудинно-ключично-сосцевидной области с надключичными ямками шеи, области поднижнечелюстного треугольника, паренхимы щитовидной железы по данным УЗИ и при увеличении частоты заболеваний ОРВИ в период после операции на сердце с тимэктомией диагностируют вторичное иммунодефицитное состояние у ребенка. Способ обеспечивает возможность выявлять иммунодефицитные состояния у детей, перенесших полное или частичное удаление вилочковой железы в ходе оперативной коррекции врожденных пороков сердца, до развития клинической симптоматики за счет сонографии тимуса, УЗИ диагностики вышеперечисленных областей; определения Т-лимфоцитов с маркировкой TREC в крови и определения частоты заболеваний ОРВИ в период после операции у ребенка. 2 пр.

Способ диагностики вторичных иммунодефицитных состояний у детей с врожденным пороком сердца грудного, раннего и дошкольного возраста, перенесших полное или частичное удаление вилочковой железы в ходе оперативной коррекции врожденных пороков сердца, включающий сонографию тимуса с определением оставшейся от операции в прошлом части тимической паренхимы; УЗИ диагностику областей верхнего средостения, лопаточно-трапециевидного треугольника, лопаточно-ключичного треугольника, грудинно-ключично-сосцевидной области с надключичными ямками шеи, области поднижнечелюстного треугольника, а также паренхимы щитовидной железы; определение Т-лимфоцитов с маркировкой T-cell Receptor Excision Circle (TREC) в крови и определение частоты заболеваний ОРВИ в период после операции на сердце с тимэктомией у ребенка, характеризующийся тем, что при уровне Т-лимфоцитов с маркировкой TREC в крови ниже референсного значения, определенных после тимэктомии методом «сухого пятна», при отсутствии очагов эктопической ткани вилочковой железы в областях верхнего средостения, лопаточно-трапециевидного треугольника, лопаточно-ключичного треугольника, грудинно-ключично-сосцевидной области с надключичными ямками шеи, области поднижнечелюстного треугольника, паренхимы щитовидной железы по данным УЗИ и при увеличении частоты заболеваний ОРВИ в период после операции на сердце с тимэктомией диагностируют вторичное иммунодефицитное состояние у ребенка.