ШТАММ БАКТЕРИИ DELCYA MARINA - ПРОДУЦЕНТ ЩЕЛОЧНОЙ ФОСФАТАЗЫ И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЩЕЛОЧНОЙ ФОСФАТАЗЫ Российский патент 1997 года по МПК C12N1/20 C12N9/16 C12N9/16 C12R1/01 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к производству ферментов, и может быть использовано для получения высокоактивной щелочной фосфатазы, применяемой в медицине, генной инженерии, молекулярной биологии.

Морские микроорганизмы являются перспективными источниками новых щелочных фосфатаз. В литературе имеются отдельные сведения о способности морских микроорганизмов продуцировать щелочные фосфатазы. Описаны несколько щелочных фосфатаз, выделенных из бактериальных штаммов морского происхождения. Показано, что эти ферменты отличаются от уже известных щелочных фосфатаз по некоторым физико-химическим свойствам. Так, из морской бактерии Pseudomonas sp. выделена внеклеточная щелочная фосфатаза, на активность которой влияют повышение давления, а также присутствие основных ионов, содержащихся в морской воде. Фермент имеет удельную активность 192 ед/мг белка [1] Из антарктической морской бактерии НК-47 выделена термолабильная щелочная фосфатаза, которую используют для отщепления концевых 5'-фосфатных групп в молекулах нуклеиновых кислот, а после окончания реакции легко инактивируют прогреванием при 60^oC. Удельная активность фермента 906 ед/мг белка [3]
В последние годы найдены штаммы симбионтных морских бактерий, преимущественно двустворчатых моллюсков (Crenomytilus grayanus), отличающиеся способностью синтезировать высокоактивные щелочные фосфатазы. Известен штамм морской бактерии, первоначально идентифицированный как Acinetobacter sp. позднее реклассифицированный как Alteromonas macleodii КММ 162 (ВКПМ В-3905, 40 МС), продуцирующий щелочную фосфатазу с высокой удельной активностью (6000 6700 ед/мг белка).

Щелочная фосфатаза штамма КММ 162 имеет молекулярную массу 90 кДа, проявляет максимальную активность при рН 9,5 9,8 в присутствии 1 мМ MgCl₂, ингибируется ЭДТА. Фермент термостабилен, но в присутствии 2-меркаптоэтанола или дитиотреитола полностью инактивируется при 55 - 60^oC, что позволяет использовать его при мечении нуклеиновых кислот и выводить из реакционной смеси тепловой обработкой [2] Несмотря на высокую удельную активность, данная щелочная фосфатаза не была использована в иммуноферментном анализе для получения конъюгатов, так как фермент неустойчив к химическим модификациям и теряет свою активность при соответствующих обработках и хранении.

Задача изобретения выявление нового штамма, продуцирующего щелочную фосфатазу с более высокой, по сравнению с аналогами, удельной активностью.

Поставленная задача решена тем, что из целомической жидкости дальневосточного двустворчатого моллюска Crenomytilus grayanus выделен штамм бактерии Deleya marina, отобранный по признаку высокой исходной удельной фосфатазной активности.

Штамму бактерии Deleya marina авторами присвоен номер КММ 296 (4 МС 37), он депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов под номером ВКМ В-2021 Д.

Штамм выделен методом прямого высева на агаризованную среду следующего состава (г/л): пептон 5 г, дрожжевой экстракт 2,5 г, глюкоза 1 г, MgSO₄ 0,5 г, K₂HPO₄ 0,2 г; морская вода 750 мл, дистиллированная вода 250 мл, рН 7,5.

Культуру хранят в пробирках под слоем минерального масла на полужидкой среде приведенного выше состава, при температуре 10^oC.

Характеристика штамма.

Культурально-морфологические признаки:
а) бактерии образуют круглые с ровными краями, выпуклые колонии до 5 мм в диаметре, поверхность колоний гладкая, консистенция слизистая. Пигмент не накапливается;
б) штамм КММ 296 (4 МС 37) представляет собой небольшие граммотрицательные палочки, подвижные с помощью жгутиков. У бактерии формируется 1 2 полярных жгутика и 1 2 латеральных. Хемоорганотрофы с окислительным типом метаболизма. Оксидазо-отрицательные, каталазо-положительные, без NaCl в среде не растут, пигмента не накапливают. Люминесценция и флюоресценция отсутствуют. Растут при 4^oC, при 41^oС рост отсутствует.

Физиолого-биохимические признаки.

Штамм КММ 296 (4 МС 37) желатин, крахмал, твин-80 не гидролизует. Аргининдегидролаза отсутствует, не денитрификатор. Индол и сероводород не образует. Лактозу, мелибиозу, мальтозу, сахарозу, глицерин не утилизирует. Молярный процент Г+Ц оснований в ДНК 65,5.

Штаммы рода Deleya не патогенны и не токсичны для теплокровных животных.

Штамм Deleya marina КММ 296 (4 МС 37) отличается от известного штамма-прототипа Alteromonas macleodii КММ 162 (40 МС) по культурально-морфологическим признакам: формирует беловатые непрозрачные колонии, у клеток образуется от 1 до 4 полярных жгутиков, включая латеральные; по физиолого-биохимическим признакам: оксидазо-отрицательный, практически не утилизирует углеводы, а также имеет высокий молярный процент Г+Ц оснований в ДНК.

Задачей изобретения является также разработка способа получения щелочной фосфатазы из штамма КММ 296, позволяющего получить фермент с более высокой, по сравнению с аналогами, удельной активностью и более высокой устойчивостью к химическим модификациям.

Поставленная задача решена тем, что предложен способ, позволяющий получить щелочную фосфатазу с удельной активностью 14000 15000 ед/мг белка, обладающую также высокой стабильностью, что делает возможным использование фермента в иммуноферментном анализе.

Предлагаемый способ получения щелочной фосфатазы предусматривает выращивание штамма-продуцента на питательной среде, отделение биомассы от культуральной жидкости, разрушение микробных клеток с последующим выделением целевого продукта водной экстракцией, а также хроматографическую очистку сырого ферментного препарата. В качестве продуцента используют штамм бактерии Deleya marina КММ 296 (4 МС 37; ВКМ В-2021 Д). Очистку фермента осуществляют сначала анионообменной хроматографией на ДЕАЕ-целлюлозе, затем гидрофобной хроматографией на бутил-тойоперле и гель-фильтрацией на сефадексе G-100.

Способ иллюстрируется следующими примерами.

ПРИМЕР 1. Свежепересеянную культуру смывают с косяка питательной средой в колбу емкостью 1000 мл, содержащей 500 мл питательной среды следующего состава (г/л): пептон 5,0; дрожжевой экстракт 2,5; глюкоза 1; K₂HPO₄ 0,2; MgSO₄ 0,05; 750 мл натуральной морской воды (допустима замена 25 г/л NaCl); 250 мл дистиллированной воды; рН среды 7,5 7,8 и выращивают 24 часа в термостате при 28^oC. Приготовленным таким образом посевным материалом инокулируют колбы емкостью 1000 мл (с 500 мл питательной среды). Выращивают в течение 24 28 часов на качалке (120 об/мин) при 24^oC.

Для получения фермента бактериальные клетки осаждают на проточной центрифуге при 5000 об/мин. Выход бактериальной биомассы 5 г с 500 мл культуральной жидкости. Продуктивность по белку 95 мг/л. Удельная активность щелочной фосфатазы в водном экстракте 45 ед/мг белка. Общая фосфатазная активность водного экстракта 4275 ед. с 1 л культуральной жидкости.

Сравнение полученных для штамма КММ 296 данных с характеристиками штамма КММ 162 показывает, что данный штамм в аналогичных условиях дает больший выход общей фосфатазной активности с 1 л питательной среды, а также щелочную фосфатазу с более высокой удельной активностью (табл.1).

ПРИМЕР 2.

Штамм выращивают как описано в примере 1.

К 200 г сырой биомассы, полученной из 20 л жидкой питательной среды, описанной в примере 1, добавляют 1000 мл 0,02 М трис-HCl буфера, рН 7,5, содержащего 0,01% NaN₃ (буфер А) и суспензию клеток дезинтегрируют порциями по 80 мл в течение 5х30 сек, охлаждая во льду. Затем центрифугируют при 3000 об/мин в течении 30 мин. Надосадочную жидкость собирают и полученный водный экстракт перемешивают с 700 мл уравновешенной буфером А ДЭАЭ-целлюлозой в холодной комнате в течение 1 часа. Затем ДЭАЭ-целлюлозу промывают на фильтре Шотта 0,2 М NaCl в буфере А. Фермент элюируют 0,4 М NaCl в буфере А. К элюату добавляют сухую соль сульфата аммония до конечной концентрации 1,5 М; после растворения соли раствор белка наносят на колонку (V 32 мл) с бутил-тойоперлом, уравновешенную 1,5 М сульфатом аммония на буфере А, и проводят элюцию градиентом сульфата аммония от 1,5 М до 0,5 М (по 250 мл каждого раствора), со скоростью 40 мл/ч, отбирая фракции по 6 мл. Фермент выходит при концентрации сульфата аммония 1,1 М 0,9 М. Активные фракции собирают, концентрируют ультрафильтрацией на мембране РМ-30 (Amersham) и наносят на колонку (V 140 мл) с сефадексом G-100, уравновешенную буфером: 0,01 М трис-HCl, 0,005 М MgCl₂, 0,05 М NaCl, 0,01% NaN₃, рН 8,0. Фермент элюируют этим же буфером со скоростью 12 мл/ч, отбирая фракции по 4 мл. Активные фракции собирают и концентрируют на мембране РМ-30. В табл.2 приводятся характеристики продукта в процессе очистки. Данный способ выделения обеспечивает высокую стабильность препарата щелочной фосфатазы.

Активность щелочной фосфатазы определяют по расщеплению п-НФФ. Стандартная инкубационная смесь в объеме 500 мкл содержит 15 мМ паранитрофенилфосфата (п-НФФ), 1 М диэтаноламина (ДЭА), рН 10,3 и фермент. После 30 мин инкубации при 37^oC реакцию останавливают добавлением 2 мл 0,5 М NaOH. Количество образовавшегося в процессе ферментативной реакции п-НФФ определяют спектрофотометрически при 400 нм. За единицу активности щелочной фосфатазы принимают количество фермента, катализирующего освобождение 1 мкМ п-НФФ (Е₄₀₀ нм 18600) в течение 1 мин инкубации. Удельную активность выражают в единицах активности фермента на 1 мг белка. Концентрацию белка в растворе определяют по методу Брэдфорд.

Исследование свойств щелочной фосфатазы, продуцируемой штаммом КММ 296 и выделяемой согласно изобретению, показало, что фермент имеет молекулярную массу 55 кДа, стабилен в области рН 6,0 11,0, проявляет максимальную активность в 1 М ДЭА буфере при рН 10,3 в присутствии катионов двухвалентных металлов. Данная щелочная фосфатаза термостабильна и не теряет первоначальной активности после 15 мин прогрева в интервале температур 20 50^oC. Аналогичная преинкубация при 60^oC приводит к потере 80% исходной активности. Фермент не требует присутствия катионов двухвалентных металлов для проявления своей максимальной активности, причем добавление 5 мМ ЭДТА в инкубационную смесь не приводит к заметному уменьшению активности щелочной фосфатазы. Фермент с одинаковой скоростью расщепляют п-НФФ 5'-АМФ, 5'-ЦМФ и 5'-дЦМФ. Щелочная фосфатаза штамма КММ 296 успешно использована на первой стадии ферментативного мечения ДНК фага лямбда, а также для получения ферментных конъюгатов.

Все вышеперечисленное свидетельствует в пользу широкого применения выделенного фермента в практике лабораторных исследований, а также в иммунодиагностике.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к производству ферментов, и может быть использовано для получения высокоактивной щелочной фосфатазы, применяемой в медицине, генной инженерии, молекулярной биологии.

Штамм бактерии Deleya marina ВКМ В-2021 Д выделен из целомической жидкости дальневосточного моллюска Crenomytilus grayanus. Штамм обладает высокой исходной удельной активностью щелочной фосфатазы (40 - 45 ед/мг белка). Способ получения щелочной фосфатазы предусматривает выращивание штамма-продуцента на питательной среде с получением бактериальной биомассы, отделение биомассы от культуральной жидкости с последующим выделением целевого продукта водной экстракцией микробных клеток и трехстадийную хроматографическую очистку сырого ферментного препарата методами анионообменной, гидрофобной хроматографии и гель-фильтрацией. Удельная активность очищенной щелочной фосфатазы 14000 - 15000 ед/мг белка. 2 с.п. ф-лы, 2 табл.

1 1. Штамм бактерии Deleya marina ВКМ В-2021 Д продуцент щелочной фосфатазы. 2 2. Способ получения щелочной фосфатазы, предусматривающий выращивание штамм-продуцента на питательной среде с получением биомассы, отделение биомассы от культуральной жидкости с последующим выделением целевого продукта водной экстракцией микробных клеток и хроматографическую очистку сырого ферментного препарата, отличающийся тем, что в качестве продуцента используют штамм бактерии Deleya marina ВКМ В-2021 Д, а очистку осуществляют сначала анионообменной хроматографией на ДЭАЭ-целлюлозе, затем гидрофобной хроматографией на бутил-тойоперле и гель-фильтрацией на сефадексе G-100.