ШТАММ STREPTOMYCES PLURICOLORESCENS-ПОДУЦЕНТ ПОЛИПЕПТИДНОГО АНТИБИОТИКА ПАЛЬМИРОМИЦИНА Российский патент 1994 года по МПК C12P1/06 

Изобретение относится к биотехнологии и касается нового штамма актиномицетов Streptomyces pluricolorescens, выделенного из морских доменных осадков, продуцента нового полипептидного антибиотика пальмиромицина, обладающего ингибирующей активностью по отношению к грамположительным бактериям.

Штамм актиномицетов Streptomyces pluricolorescens выделен в результате поиска штаммов-продуцентов физиологически активных соединений среди свободно живущих и симбионтных микроорганизмов, обитающих в Мировом океане.

Ранее из штаммов актиномицетов этого вида не выделялись антибиотики пептидной природы [1]. В литературе вообще не отмечены микроорганизмы, продуцирующие антибиотики со свойствами пальмиромицина.

Целью изобретения является новый штамм, продуцирующий полипептидный антибиотик, обладающий ингибирующей активностью по отношению к грамположительным бактериям.

Штамм выделен из пробы морского грунта, взятого на глубине 2 м у о. Пальмира, (архипелаг Лайн, США). Способ выделения состоит в следующем. Пробу грунта растирают в небольшом количестве воды, образующуюся суспензию высевают на поверхность агаризованной среды и инкубируют при 30^о С 7 сут.

Штамм депонирован на Всесоюзной коллекции микроорганизмов Института биохимии и физиологии микроорганизмов АН СССР под номером ВКМ Ас-1354Д. Хранится в Тихоокеанском институте биоорганической химии ДВО РАН под номером КММ АсI.

Описание штамма.

Хемотаксономические признаки. В составе клеточной стенки присутствуют LL-диаминопимелиновая кислота в глицин и отсутствуют дифференцирующие сахара - 1 тип клеточной стенки [2].

Культуральные признаки. Хорошо развитый воздушный мицелий палевых оттенков, субстратный мицелий и растворимый пигмент имеют красно-бурые и коричневые тона на различных диагностических средах, описанных в определителе актиномицетов.

Минеральный агар: воздушный мицелий (ВМ) палевый, иногда с розоватым оттенком, субстратный мицелий (СМ) красновато-бурый, коричневый, растворимый пигмент (РП) красновато-бурый, коричневый.

Овсяный агар и глюкозоаспарагиновый агар: ВМ палевый, желтовато-серый, СМ коричневый, РП коричневый.

Органический агар: ВМ серовато-желтый, СМ красно-бурый, коричневый, РП розовато-буроватый.

Агар Чапека: ВМ белый, желтовато-кремовый, СМ темно-желтый, РП отсутствует.

Меланоидный пигмент на органической среде с солями железа не образуется.

Морфологические характеристики. Длинные цепочки спор на воздушном мицелии, спороносцы прямые или волнистые, поверхность спор гладкая. Воздушные и субстратные гифы не фрагментируются.

Физиолого-биохимические признаки. Грамположительный. Некислотноустойчив. Облигатный аэроб. Оксидазо- и каталазоположителен. Имеет окислительный тип метаболизма. Способен расти на синтетических средах, содержащих глюкозу и соли аммония в качестве источников углерода и азота. Утилизирует также галактозу, сахарозу, трегалозу, фруктозу, декстрин в качестве источника углерода, образуя кислоту из них.

Использует аспарагин, соли аммония и нитраты в качестве единственного источника азота. Мезофил. Температурный оптимум роста 30^оС.

Условия хранения. Культуру хранят в лиофилизированном состоянии в ампулах под вакуумом (протектор - обезжиренное молоко) или в пробирках на косяках с овсяным агаром (состав: овсяная мука 20 г, агар 15 г, вода водопроводная 1 л, рН 7,0-7,2) при температуре 4^оС.

От типового штамма Streptomyces pluricolorescens ВКМ штамм ВКМ Ас-1354Д отличается отсутствием меланоидного пигмента.

Не вирулентен. Не токсичен для теплокровных животных.

Штамм продуцирует полипептидный антибиотик пальмиромицин при выращивании в течение 5 сут на жидкой среде следующего состава, г/л: пептон 5, дрожжевой экстракт 2,5; глюкоза 0,1; К₂НРО₄ 01,; МgSO₄ ˙7Н₂О 0,1; 500 мл морской и 500 мл водопроводной воды. Антибиотик накапливается в культуральной среде. Его извлекают с помощью, главным образом, гель- фильтрационной и ионно-обменной хроматографии. Выход пальмиромицина обычно около и 6-10 мг на 1 л.

УФ-спектр антибиотика имеет характерный для белков вид (λ_мах = 280 нм). Это соединение не обладает цитостатическим действием по отношению к опухолевым клеткам карциносаркомы Эрлиха и не показывает протеолитической активности. Оно ингибирует рост грамположительных бактерий в концентрации менее 1 мкг/мл. Пальмиромицин стабилен в диапазоне рН от 3,5 до 8,0. Не теряет активности при хранении в 1%-ном растворе NaCl при 45^оС в течение по крайней мере шести месяцев.

При электрофоретическом исследовании пальмиромицина на пластинах полиакриламидного геля 4/30 (Pharmacia) в буфере: Tris 0,09 М, борная кислота 0,08 М, ЕДТА 0,1; рН 8,4, была обнаружена только одна полоса (проявитель кумасси бриллиантовый голубой), соответствующая массе приблизительно 85 КДа. В качестве стандартных белков были использованы бычий альбумин (67 КДа), лактатдегидрогеназа (140 КДа), каталаза (232 КДа) (Serva). Эти данные хорошо коррелируют с поведением пальмиромицина при гель-хроматографии на колонке с сефакрилом S-200, откалиброванной стандартными белками.

Электрофорез в градиентном полиакриламидном геле (9/25) в SDS буфере (рН= 6,8) раствора пальмиромицина, предварительно прокипяченного в присутствии 2-меркаптоэтанола, приводит к обнаружению одной полосы, соответствующей массе около 18 КДа. Логично предположить, что антибиотик состоит, вероятно, из пяти одинаковых субъединиц.

Ниже приведен пример получения антибиотика пальмиромицина с использованием штамма Streptomyces pluricolorecsens ВКМ Ас-1354Д (КММ АсI).

П р и м е р. Культуру выращивают на среде вышеприведенного состава, ее стерилизуют 15 мин при 121^оС и давлении 1,2 атм. (рН после стерилизации 7,2-7,4). Культивирование микроорганизма осуществляют в колбах Эрленмейера объемом 250 мл, со 100 мл среды в течение 120 ч при 30^оС на качалке (120 об/мин).

2 л культуральной среды после отделения мицелия профильтровывают через мембрану ХМ-50 (Аmicon) в ячейке для ультрафильтрации "Аmicon-8050" при 5^оС до объема 100-120 мл. Концентрирование активных веществ происходит над мембраной. К полученному концентрату прибавляют сульфат аммония из расчета на 150 мл раствора 100 г соли. Выпавший осадок центрифугируют при 2000 об/мин 5 мин и растворяют его в 3 мл буфера (0,02 М фосфат натрия; 0,9%-ный хлористый натрий рН=7,2). Раствор вновь центрифугируют и супернатант хроматографируют на колонке с сефакрилом S-200 в вышеприведенном буфере. Элюируемые фракции тестируют на антимикробную активность по отношению к В.subtilis и S. аureus. Из активного элюата пальмиромицин вновь высаждают сульфатом аммония. Осадок хроматографируют на колонке с ТЕАЕ-23 сервацелом в 0,02 М фосфате натрия с рН=7,2. Фракции, содержащие по данным электрофореза индивиду- альный антибиотик, объединяют, диализуют и лиофилизируют. Получают 15 мг пальмиромицина.

Антимикробную активность соединения определяют методом лунок в агаре. Концентрацию антибиотика рассчитывают с помощью метода определения белка по Лоури. Данные представлены в таблице.

Использование: биотехнология. Сущность изобретения: штамм Steptomyces pluricolorescens - продуцент полипептидного антибиотика пальмиромицина, ингибирующего рост грамположительных бактерий. Штамм выделен из морского грунта. Пробу грунта растирают в воде, суспензию высевают на агаризованную среду и инкубируют 7 сут. при 30°С. Штамм депонирован под номером ВКМ Ас-1354 Д. Штамм выращивают в течение 5 сут. на жидкой среде следующего состава, г/л: пептон 5; дрожжевой экстракт 2,5; глюкоза 0,1; K₂HPO₄ 0,1; MgSO₄·7H₂O 0,1; 500 мл морской и 500 мл водопроводной воды. Антибиотик извлекают из культуральной жидкости посредством хроматографии. Выход пальмиромицина 6 - 10 мг/л. 1 табл.

Штамм Streptomyces pluricolorescens ВКМ Ас-1354 Д - продуцент полипептидного антибиотика пальмиромицина.