ШТАММ ASPERGILLUS FUMIGATUS FRESENIUS 4238 - ПРОДУЦЕНТ ФУМАГИЛЛИНА Российский патент 1997 года по МПК C12P1/06 C12P1/06 C12R1/68 

Предлагаемое изобретение относится к биотехнологической промышленности, а именно к производству антибиотиков, и может быть использовано при производстве антибиотика фумагиллина, являющегося продуктом биосинтеза культуры Aspergillus fumigatus Fresenius и применяемого для профилактики и лечения нозематоза пчел и амебиаза плотоядных.

Известен ряд штаммов Aspergillus fumigatus Fresenius продуцентов фумагиллина. В частности, известен штамм Н-3 (NRRL-2319) [1] с уровнем синтеза фумагиллина 170 мкг/мл среды и штамм (NRRL-2436) [2] с уровнем синтеза фумагиллина 157 420 мкг/мл. Недостатком этих штаммов является низкий уровень накопления целевого продукта и одновременное с синтезом фумагиллина образование культурой целого ряда побочных соединений глиотоксина, хинонов и других продуктов.

Наиболее продуктивным из известных штаммов продуцентов фумагиллина является штамм Aspergillus fumigatus Fres 4/3 [3] позволяющий достигать накопления фумагиллина в культуральной жидкости на уровне 256 512 мкг/мл и не синтезирующий одно из побочных соединений токсичный антибиотик глиотоксин.

Характеристика известных штаммов продуцентов фумагиллина представлена в таблице
Из этих штаммов в качестве прототипа рассматривается штамм 4/3 как наиболее продуктивный по фумагиллину и не образующий токсичного антибиотика глиотоксина. Однако этот штамм в жидких питательных средах кроме фумагиллина синтезирует большие количества хинонов. Хиноны характеризуются близкой к фумагиллину растворимостью в воде и полярных растворителях и поэтому при переработке культуральной жидкости могут затруднять последующее получение фумагиллина. Кроме того, штамм 4/3 недостаточно продуктивен для рентабельного использования в промышленном производстве фумагиллина.

Сущность изобретения заключается в получении штамма Aspergillus fumigatus Fresenius, отличающегося от штамма-прототипа следующими признаками: во-первых, повышенной продуктивностью по фумагиллину, и во-вторых, неспособностью к синтезу хинонов.

Предлагаемый штамм Aspergillus fumigatus Fresenius 4238 получен путем воздействия мутагенами на конидии штамма 4/3 с последующим поэтапным отбором вариантов, наиболее продуктивных по фумагиллину и характеризующихся сниженным синтезом или отсутствием хинонов. Продуктивность культуры оценивалась по накоплению фумагиллина в культуральной жидкости спектрофотометрическим методом. Наличие хинонов в культуральной жидкости определялось методом тонкослойной хроматографии.

Штамм Aspergillus fumigatus Fresenius 4238 характеризуется более высокой по сравнению со штаммом-прототипом продуктивностью по фумагиллину до 1250 мкг/мл и отсутствием синтеза хинонов.

Штамм Aspergillus fumigatus Fresenius 4238 хранится в Коллекции культур микроорганизмов Государственного научного центра по антибиотикам под регистрационным номером 345А и характеризуется следующими признаками.

Культурально-морфологическая характеристика.

На агаризованной среде Чапека культура растет в виде плоской колонии сначала белого, затем темно-оливково-серого цвета с поверхностью от бархатистой до порошистой. Цвет субстрата серо-зеленый. Созревание конидий происходит на 6 9 сутки после посева. Конидиеносцы отходят от погруженных гиф или образуются как очень коротенькие веточки на воздушных гифах. Длина конидиеносцев 300 450 мкм, диаметр 5 8 мкм, конидиеносцы гладкие от бесцветных до нежно-зеленых, постепенно расширяющиеся к верхушке. Головки конидиеносцев обильные, имеют форму колонки длиной 100 400 мкм, от тускло-зеленых до оливково-серых.

Везикулы бутылочной формы, 18 25 мкм в диаметре.

Конидии шаровидные, шероховатые, диаметром 2,5 3,5 мкм.

Стеригмы одноярусные, формируются только в центре апикальной части, занимая не более 2/3 ее, скрученные, располагаются по оси, параллельной оси конидиеносца, длиной 5,5 7,5 мкм, диаметром 2,5 3,0 мкм.

Физиолого-биохимическая характеристика.

Культура утилизирует глюкозу, мальтозу, ксилозу, сахарозу, лактозу, маннит, глицерин, гидролизует крахмал. В качестве азотного питания использует аммиак, азот аминокислот, нитраты, утилизирует азот мочевины. Обладает протеолитической активностью.

Растет в диапазоне рН от 3,0 до 9,0. Оптимальный рН для биосинтеза фумагиллина 6,5 7,0.

Оптимальная температура биосинтеза 27±1^oС.

Для роста требует кислород воздуха.

Продуцирует фумагиллин. Хиноны не продуцирует. Глиотоксин не образует.

Маркерная характеристика.

При тонкослойной хроматографии спиртового экстракта культуральной жидкости штамма в системе толуол, бутилацетат, этиловый спирт (1:1:0,1) после проявления хроматограммы парами иода хиноны не обнаруживаются.

Биотехнологическая характеристика.

В качестве целевого продукта штамм продуцирует фумагиллин. При культивировании на питательной среде состава (%): крахмал 2,0; кукурузный экстракт 2,0; кальций углекислый 0,2, в условиях непрерывного перемешивания и аэрации, соответствующей сульфитному показателю 0,7 0,8 ммоль O₂/л.мин, накопление фумагиллина через 120 часов ферментации составляет 780 мкг/мл. При культивировании на питательной среде состава (%): меласса 4,0; соевая мука 2,0; кукурузный экстракт 0,5; натрий азотнокислый 0,5, в условиях непрерывного перемешивания и аэрации, соответствующей сульфитному показателю 0,8 ммоль O₂/л.мин, накопление фумагиллина через 120 часов ферментации составляет 1250 мкг/мл.

При более длительном культивировании, сопровождающемся повышением рН до 8,5 9,9, наблюдается снижение содержания фумагиллина в среде.

Хранение штамма.

Хранить штамм рекомендуется в виде лиофильно высушенной культуры в стеклянных запаянных ампулах или в пробирках на скошенном агаре Чапека с периодическими пересевами.

Промышленная применимость штамма Aspergillus fumigatus Fres 4238 при биосинтезе антибиотика фумагиллина иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Культуру штамма 4238 хранят в лиофизилированном состоянии в запаянных ампулах при температуре 2 4^oС. Защитной средой для лиофилизации служит сыворотка бычьей крови. С целью оживления культуры в ампулу заливают 1 мл стерильной воды, производят посев полученной суспензии на скошенный в пробирках агар Чапека и термостатируют их в течение 7 -10 суток при температуре 25±1^oС.

Для приготовления посевного материала культуру, выращенную на агаре Чапека, переносят в колбы с посевной средой следующего состава (%): крахмал - 2,0; кукурузный экстракт 2,0; вода водопроводная остальное; рН 6,3 6,4. Колбы со стерильной посевной средой засевают суспензией конидий штамма 4238, смытых с агара Чапека стерильной водопроводной водой, и выращивают на качалке с 220 240 об/мин при температуре (27±1)^oС в течение 48 часов.

Полученный посевной материал в количестве 4,0% используют для засева ферментационной среды следующего состава (%): крахмал 2,0; кукурузный экстракт 2,0; кальций углекислый 0,2; вода водопроводная остальное; рН 6,2 6,4. Культивирование осуществляют при температуре (27±1)^oС, постоянном перемешивании и аэрации среды, достаточной для достижения сульфитного показателя на уровне 0,8 ммоль O₂/л.мин. Длительность культивирования 120 часов. Содержание фумагиллина в культуральной жидкости, определенное спектрофотометрическим способом, составляет 780 мкг/мл.

Результаты тонкослойной хроматографии спиртового экстракта культуральной жидкости в системе толуол, бутилацетат, этиловый спирт в соотношении 1:1:0,1 после проявления хроматограммы парами иода показывают отсутствие хинонов в культуральной жидкости.

Пример 2. Культивирование штамма прототипа Aspergillus fumigatus 4/3 на посевной и ферментационной средах осуществляют согласно изложенному в примере 1. Содержание фумагиллина в культуральной жидкости по окончании ферментации составляет 340 мкг/мл.

Результаты тонкослойной хроматографии спиртового экстракта культуральной жидкости, выполненной аналогично изложенному в примере 1, показывают наличие в культуральной жидкости заметных количеств хинонов.

Пример 3. Хранение культуры штамма 4238, подготовка посевной среды, а также условия и способ выращивания посевного материала с целью засева ферментационной среды аналогичны изложенным в примере 1.

Полученный посевной материал в количестве 4,0% используют для засева ферментационной среды следующего состава (%): меласса 4,0; соевая мука - 2,0; кукурузный экстракт 0,5; натрий азотнокислый 0,5; вода водопроводная остальное; рН 6,2 6,4. Ферментацию осуществляют при температуре (27±1)^oС, постоянном перемешивании и аэрации, достаточной для достижения сульфитного показателя на уровне 0,8 ммоль O₂/л.мин. Длительность ферментации 120 час. Содержание фумагиллина в культуральной жидкости, определенное спектрофотометрическим методом, составляет 1250 мкг/мл.

Результаты тонкослойной хроматографии спиртового экстракта культуральной жидкости в системе толуол, бутилацетат, этиловый спирт в соотношении 1:1:0,1 после проявления хроматограммы парами иода показывают отсутствие хинонов в культуральной жидкости.

Пример 4. Культивирование штамма прототипа 4/3 на посевной и ферментационной средах осуществляют согласно изложенному в примере 3.

Содержание фумагиллина в культуральной жидкости по окончании ферментации составляет 490 мкг/мл.

Результаты тонкослойной хроматографии спиртового экстракта культуральной жидкости, выполненной аналогично изложенному в примерах 1 и 3, показывают наличие в культуральной жидкости больших количеств хинонов.

Приведенные данные подтверждают следующие преимущества штамма 4238 перед штаммом прототипом 4/3: повышенную в 2,3 2,5 раза продуктивность по фумагиллину и отсутствие хинонов в культуральной жидкости, отвечая критерию "изобретательский уровень" а также подтверждают, что предложение "промышленно осуществимо".

В патентной и научно-технической литературе не известны технические решения поставленной задачи аналогично заявляемому, т.е. предложение соответствует критерию "новизна".

Штамм Aspergillus fumigatus Fresenius 4238 - продуцент фумагиллина. Область применения: биотехнологическая промышленность.Сущность: штамм-продуцент антибиотика фумагиллина, применяемого для профилактики и лечения нозематоза пчел и амебиаза плотоядных. Штамм хранится в Коллекции культур микроорганизмов Государственного научного центра по антибиотикам под номером ГНЦА 345 А. 1 табл.

1 Штамм Aspergillus fumigatus Fresenius 4238. ГНЦА 345 А - продуцент фумагиллина.