ШТАММ И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИБИОТИКА МИТОМИЦИНА С ПУТЕМ БИОСИНТЕЗА Российский патент 2011 года по МПК C12N1/20 C12P1/06 C12R1/465 

Настоящее изобретение относится к штамму - продуценту антибиотика митомицина С и способу получения митомицина С путем биосинтеза на основе использования этого штамма.

Предшествующий уровень техники

Митомицин С относится к группе антибиотиков, образуемых актиномицетами, с антибактериальной и противоопухолевой активностью. Группа антибиотиков митомицинов впервые была описана 50 лет назад (Hata T., Sano Y., Sugawara R., Matsumae A., Kanamori H., Shima Т., Hoshi T. Mitomycin, a new antibiotic from Streptomyces. Int. J. Antibiotics, 1956, т.9, с.141). Практически сразу было установлено, что митомицины обладают не только антибактериальным, но и противоопухолевым действием (Kanamori Н., Shima Т., Morita Ch., Hata Т. Studies on antitumor activity of mitomycin. J. Antibiot., 1957, V.10, p.120). К митомицинам относится ряд природных антибиотиков, в структуре которых имеются следующие химические группы: азиридиновая, карбаматная, хиноновая и пиррольное ядро (Wakaki S., Maruto Н., Tomioka К., Shimizu G., Kato E., Kamada H., Kudo S., Fujimoto Y. Isolation of new fractions of antitumor mitomycins. Antibiot. Chemother., 1958, т.8, c.228; Webb J.S., Cosulich D.B., Mowat J.H., Patrick H.B., Broschard R.W., Meyer W.E., Williams R.P., Wolf C.F., Fulmor W., Pidacks Ch., Lancaster J.E. The structure of mitomycins А, В and С and porfiromycin. Part I. J. Am. Chem. Soc. 1962, т.84, с.3185; Webb J.S., Cosulich D.B., Mowat J.H., Patrick H.B., Broschard R.W., Meyer W.E., Williams R.P., Wolf C.F., Fillmor W., Pidacks Ch., Lancaster J.E. The structure of mitomycins A, B, and С and porfiromycin. Part II. J. Am. Chem. Soc. 1962, т.84, с.3187; Stevens C.L., Taylor K.G., Munk M.E., Marshall W.S., Noll K., Shah G.D., Shah L.G., Uzu K. Chemistry and structure of mitomycin C. J. Med. Chem. 1965, n.8, с.1).

Наиболее применимым в медицине для лечения различных форм онкологических заболеваний является митомицин С (Beretta G. Mitomycin С, clinical and experimental chemotherapy. Review, XVПI изд., 2004 г., изд-во Edizioni Minevra Medica, Turin, 2004). Известно, что митомицин С получают биосинтетическими способами с использованием штаммов-представителей двух родов стрептомицетов: Streptomyces и Streptoverticillium. Недостатками известных способов получения митомицина С является образование штаммами-продуцентами комплекса близкородственных антибиотиков, в связи с чем выделение и очистка митомицина С затруднена. В данной заявке описан способ получения митомицина С, заключающийся в использовании однокомпонентного продуцента митомицина С штамма Streptomyces caespitosus 3810/ОЕ, депонированного в Коллекции микроорганизмов Государственного учреждения Научно-исследовательский Институт по изысканию новых антибиотиков им. Г.Ф.Гаузе Российской Академии медицинских наук (ГУ НИИНА РАМН) под номером ИНА 01082, и разработанные для него питательные среды.

Описание настоящего изобретения

Штамм 3810/ОЕ является оригинальным штаммом, полученным из исходного штамма («дичка»), выделенного из почвы и отнесенного к виду Streptomyces caespitosus. Исходный штамм был подвергнут обработке химическими мутагенами с последующей ступенчатой селекцией.

Для поддержания культуры применялась модифицированная агаризованная среда №2 Гаузе следующего состава (%): глюкоза - 1, пептон - 0,5, триптон - 0,3, хлорид натрия - 0,5, агар - 2; рН 7,2-7,4 (не требует корректировки). Колонии в споровых рассевах, соответствующие основному активному варианту, составляют не менее 95% и на 8-10 сутки роста при 28°С имеют следующие признаки: субстратный мицелий зеленовато-коричневый, воздушный спорообразующий мицелий развит умеренно или хорошо, серого цвета, в среду выделяется темно-коричневый пигмент. Культуру пересевают не более трех раз, после чего производят рассев споровой суспензии и отбирают колонии с описанными выше морфологическими признаками. Для обеспечения высокого уровня биосинтеза митомицина С были разработаны посевная и ферментационная среды следующих составов.

Посевная среда (%): глюкоза - 0,6-1,4, крахмал - 0,6-1,4, соевая мука - 2-5, кукурузный экстракт - 0,6-1,0, КН₂РO₄ - 0,01-0,03, мел - 0,05-0,12, (NH₄)₂SO₄ - 0,06-0,14; вода водопроводная. рН до стерилизации следует довести до величины 6,8-7,2.

Ферментационная среда (%): крахмал - 0,6-1,4, сахароза - 1-3, соевая мука - 2-4, кукурузный экстракт - 0,6-1,0, СоСl₂·6Н₂O - 0,007-0,012, КН₂РO₄ - 0,02, мел - 0,05-0,12, (NH₄)₂SO₄ - 0,06-0,14, FeSO₄·7H₂O - 0,01-0,02, MgSO₄·7H₂O - 0,01-0,03, NaCl - 0,2-0,6; вода водопроводная. рН до стерилизации следует довести до величины 6,8-7,2.

Уровень биосинтеза составляет не менее 85 мкг/мл (85-100) при соблюдении описанных ниже условий проведения биосинтеза на разработанных для данного штамма-продуцента посевной и ферментационной питательных средах.

Проведение ферментации

Засев колб с посевной средой производят кусочком агаровой среды с поверхностным ростом культуры площадью примерно 2 см². Посевной материал выращивают 2 суток при 28°С. В ферментационные колбы вносят посевной материал в количестве 5 об.%. Рост 5 суток при 28-31°С. Качалка подвесная 220 об/мин.

Выделение митомицина С

После завершения ферментации мицелий фильтруют и отбрасывают, а к фильтрату культуральной жидкости добавляют двойной объем осаждающей смеси (смесь ацетонитрила и метанола или этанола в соотношении 1:1), выдерживают при 0°С в течение 1 ч до образования осадка, затем центрифугируют при 3000 об/мин 20 мин и осадок выбрасывают.

Определение уровня биосинтеза митомицина С методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ)

Аналитическую ВЭЖХ проводят на хроматографе Shimadzu LC10 vp с использованием колонок Диасфер110-С18 (4,0·250 мм, зернение 5 мкм) АО БиоХимМак, Россия. Объем петли инжектора - 20 мкл. Обработанную надосадочную жидкость, полученную выше, вводят в петлю хроматографа. Детектирование проводят при длине волны 356 нм. Элюирующая система содержит 0,01 М раствор Н₃РО₄ рН 2,6 и ацетонитрил. При градиентном элюировании, при скорости потока 1,0 мл/мин и комнатной температуре, концентрация ацетонитрила изменяется следующим образом:

Время (мин) 0 5 15 18 20 30 Ацетонитрил (%) 10 15 20 70 10 10

Время выхода митомицина С в этих условиях составляет 10,9 мин.

Расчет содержания митомицина С.

Из лекарственной формы митомицина С (фирмы Kyowa) готовили стандартный раствор в метаноле с концентрацией 1 мг/мл (с учетом, что помимо 2 мг действующего вещества во флаконе присутствует наполнитель). В культуральную жидкость, не содержащую митомицин С, вносят стандартный раствор антибиотика (конечная концентрация - С_ст), экстрагируют как указано выше, хроматографируют и определяют площадь под кривой стандартного образца культуральной жидкости(AUC_ст). Возврат при экстракции составляет 87±2,3%. Содержание митомицина С в культуральной жидкости рассчитывают по формуле:

А_мг/мл=AUC_пр·К_пересч; К_пересч=(AUC_пр×С_ст):AUC_ст,

где А_мг/л - концентрация митомицина С в культуральной жидкости;

AUC_ст - площадь под кривой при хроматографировании стандартного образца культуральной жидкости;

AUC_пр - площадь под кривой при хроматографировании анализируемого образца;

С_ст - концентрация митомицина С в стандартном образце культуральной жидкости (в мг/л);

К_пересч - коэффициент для пересчета концентраций митомицина С в мг/л.

При хроматографических условиях, описанных выше, и С_ст=100 мг/л величина К_пересч=0,0508.

Точность измерения - А_мг/л±2,5 мг/л.

Уровень продуктивности штамма митомицина С №3810/ОЕ составляет от 85 до 100 мкг/мл.

Далее настоящее изобретение поясняется примером, который служит его иллюстрацией и не ограничивает области охвата, изложенной в формуле изобретения.

Пример

Месячную агаровую культуру штамма 3810/ОЕ высевают в количестве 2 см² с растущим мицелием в колбу Эрленмейера объемом 750 мл, содержащую 100 мл посевной среды следующего состава (%): глюкоза - 1, крахмал -1, соевая мука - 4, кукурузный экстракт - 0,9, КН₂РО₄ - 0,02, мел - 0,9, (NH₄)₂SO₄ - 0,1; вода водопроводная. рН до стерилизации доводят до величины 7,0. Колбу выдерживают 48 ч на качалке с 200 об/мин при 28°С. Полученный посевной материал передают в количестве 5 мл в колбу Эрленмейера объемом 750 мл, содержащую 100 мл ферментационной среды следующего состава (%): крахмал - 1, сахароза - 2, соевая мука - 3, кукурузный экстракт - 0,9, СоСl₂·6Н₂O - 0,01, КН₂РO₄ - 0,02, мел - 0,9, (NH₄)₂SO₄ - 0,1, FeSO₄·7H₂O - 0,015, MgSO₄·7H₂O - 0,02, NaCl - 0,4; вода водопроводная. рН до стерилизации доводят до величины 7,0. Колбу выдерживают на качалке с 200 об/мин при 3°С в течение 114 ч. После завершения ферментации мицелий фильтруют и отбрасывают, а к фильтрату культуральной жидкости добавляют 200 мл осаждающей смеси ацетонитрила и метанола в соотношении 1:1, выдерживают на холоде (при 0°С) в течение 1 ч и центрифугируют при 3000 об/мин 20 мин для удаления образовавшегося осадка. 20 мкл полученной надосадочной жидкости вводят в петлю хроматографа Shimadzu LC10 vp (колонка Диасфер110-С18, 4,0·250 мм, зернение 5 мкм). Определение проводят при длине волны 356 нм. Уровень продуктивности составляет 92 мкг митомицина С в 1 мл культуральной жидкости.

Штамм Streptomyces caespitosus 3810/OE - продуцент митомицина С получен из исходного штамма, выделенного из почвы, путем обработки химическими мутагенами с последующей ступенчатой селекцией и депонирован в Коллекции культур микроорганизмов ГУ НИИ по изысканию новых антибиотиков им. Г.Ф.Гаузе РАМН под номером ИНА 01082. Для продуцирования митомицина С штамм выращивают на посевной среде следующего состава (%): глюкоза - 0,6-1,4, крахмал - 0,6-1,4, соевая мука - 2-5, кукурузный экстракт - 0,6-1,0, KH₂PO₄ - 0,01-0,03, мел - 0,05-0,12, (NH₄)₂SO₄ - 0,06-0,14, вода водопроводная, рН до стерилизации 6,8-7,2 и затем передают на ферментационную среду следующего состава (%): крахмал - 0,6-1,4, сахароза - 1-3, соевая мука - 2-4, кукурузный экстракт - 0,6-1,0, CoCl₂·6Н₂О - 0,007-0,012, KH₂PO₄ - 0,02, мел - 0,05-0,12, (NH₄)₂SO₄ - 0,06-0,14, FeSO₄·7H₂O - 0,01-0,02, MgSO₄·7H₂O - 0,01-0,03, NaCl - 0,2-0,6, вода водопроводная, рН до стерилизации 6,8-7,2. Штамм выращивают в условиях аэрирования в течение 100-120 ч, затем мицелий удаляют центрифугированием или фильтрацией, а надосадочную жидкость, содержащую целевой продукт, экстрагируют смесью ацетонитрила и метилового или этилового спирта. Уровень продуктивности митомицина С штаммом составляет от 85 до 100 мкг/мл. 2 н.п. ф-лы, 1 табл.

1. Штамм - продуцент митомицина С Streptomyces caespitosus 3810/OE, депонированный в Коллекции культур микроорганизмов Государственного учреждения Научно-исследовательский институт по изысканию новых антибиотиков им. Г.Ф.Гаузе Российской академии медицинских наук (ГУ НИИНА РАМН) под номером ИНА 01082.

2. Способ получения митомицина С, в котором используется штамм - продуцент митомицина С по п.1, который выращивают 40-52 ч в условиях аэрирования на посевной среде следующего состава, %: глюкоза 0,6-1,4, крахмал 0,6-1,4, соевая мука 2-5, кукурузный экстракт 0,6-1,0, KH₂PO₄ 0,01-0,03, мел 0,05-0,12, (NH₄)₂SO₄ 0,06-0,14, вода водопроводная, рН до стерилизации 6,8-7,2, и передают в ферментационную среду следующего состава, %: крахмал 0,6-1,4, сахароза 1-3, соевая мука 2-4, кукурузный экстракт 0,6-1,0, CoCl₂·6H₂O 0,007-0,012, KH₂PO₄ 0,02, мел 0,05-0,12, (NH₄)₂SO₄ 0,06-0,14, FeSO₄·7H₂O 0,01-0,02, MgSO₄·7H₂O 0,01-0,03, NaCl 0,2-0,6, вода водопроводная, рН до стерилизации 6,8-7,2, на которой выращивают в условиях аэрирования в течение 100-120 ч, после чего мицелий удаляют центрифугированием или фильтрацией, а надосадочную жидкость экстрагируют смесью ацетонитрила и метилового или этилового спирта.