ШТАММ И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИБИОТИКА МИТОМИЦИНА С ПУТЕМ БИОСИНТЕЗА Российский патент 2011 года по МПК C12N1/20 C12P1/06 C12R1/465 

Описание патента на изобретение RU2420568C2

Настоящее изобретение относится к штамму - продуценту антибиотика митомицина С и способу получения митомицина С путем биосинтеза на основе использования этого штамма.

Предшествующий уровень техники

Митомицин С относится к группе антибиотиков, образуемых актиномицетами, с антибактериальной и противоопухолевой активностью. Группа антибиотиков митомицинов впервые была описана 50 лет назад (Hata T., Sano Y., Sugawara R., Matsumae A., Kanamori H., Shima Т., Hoshi T. Mitomycin, a new antibiotic from Streptomyces. Int. J. Antibiotics, 1956, т.9, с.141). Практически сразу было установлено, что митомицины обладают не только антибактериальным, но и противоопухолевым действием (Kanamori Н., Shima Т., Morita Ch., Hata Т. Studies on antitumor activity of mitomycin. J. Antibiot., 1957, V.10, p.120). К митомицинам относится ряд природных антибиотиков, в структуре которых имеются следующие химические группы: азиридиновая, карбаматная, хиноновая и пиррольное ядро (Wakaki S., Maruto Н., Tomioka К., Shimizu G., Kato E., Kamada H., Kudo S., Fujimoto Y. Isolation of new fractions of antitumor mitomycins. Antibiot. Chemother., 1958, т.8, c.228; Webb J.S., Cosulich D.B., Mowat J.H., Patrick H.B., Broschard R.W., Meyer W.E., Williams R.P., Wolf C.F., Fulmor W., Pidacks Ch., Lancaster J.E. The structure of mitomycins А, В and С and porfiromycin. Part I. J. Am. Chem. Soc. 1962, т.84, с.3185; Webb J.S., Cosulich D.B., Mowat J.H., Patrick H.B., Broschard R.W., Meyer W.E., Williams R.P., Wolf C.F., Fillmor W., Pidacks Ch., Lancaster J.E. The structure of mitomycins A, B, and С and porfiromycin. Part II. J. Am. Chem. Soc. 1962, т.84, с.3187; Stevens C.L., Taylor K.G., Munk M.E., Marshall W.S., Noll K., Shah G.D., Shah L.G., Uzu K. Chemistry and structure of mitomycin C. J. Med. Chem. 1965, n.8, с.1).

Наиболее применимым в медицине для лечения различных форм онкологических заболеваний является митомицин С (Beretta G. Mitomycin С, clinical and experimental chemotherapy. Review, XVПI изд., 2004 г., изд-во Edizioni Minevra Medica, Turin, 2004). Известно, что митомицин С получают биосинтетическими способами с использованием штаммов-представителей двух родов стрептомицетов: Streptomyces и Streptoverticillium. Недостатками известных способов получения митомицина С является образование штаммами-продуцентами комплекса близкородственных антибиотиков, в связи с чем выделение и очистка митомицина С затруднена. В данной заявке описан способ получения митомицина С, заключающийся в использовании однокомпонентного продуцента митомицина С штамма Streptomyces caespitosus 3810/ОЕ, депонированного в Коллекции микроорганизмов Государственного учреждения Научно-исследовательский Институт по изысканию новых антибиотиков им. Г.Ф.Гаузе Российской Академии медицинских наук (ГУ НИИНА РАМН) под номером ИНА 01082, и разработанные для него питательные среды.

Описание настоящего изобретения

Штамм 3810/ОЕ является оригинальным штаммом, полученным из исходного штамма («дичка»), выделенного из почвы и отнесенного к виду Streptomyces caespitosus. Исходный штамм был подвергнут обработке химическими мутагенами с последующей ступенчатой селекцией.

Для поддержания культуры применялась модифицированная агаризованная среда №2 Гаузе следующего состава (%): глюкоза - 1, пептон - 0,5, триптон - 0,3, хлорид натрия - 0,5, агар - 2; рН 7,2-7,4 (не требует корректировки). Колонии в споровых рассевах, соответствующие основному активному варианту, составляют не менее 95% и на 8-10 сутки роста при 28°С имеют следующие признаки: субстратный мицелий зеленовато-коричневый, воздушный спорообразующий мицелий развит умеренно или хорошо, серого цвета, в среду выделяется темно-коричневый пигмент. Культуру пересевают не более трех раз, после чего производят рассев споровой суспензии и отбирают колонии с описанными выше морфологическими признаками. Для обеспечения высокого уровня биосинтеза митомицина С были разработаны посевная и ферментационная среды следующих составов.

Посевная среда (%): глюкоза - 0,6-1,4, крахмал - 0,6-1,4, соевая мука - 2-5, кукурузный экстракт - 0,6-1,0, КН2РO4 - 0,01-0,03, мел - 0,05-0,12, (NH4)2SO4 - 0,06-0,14; вода водопроводная. рН до стерилизации следует довести до величины 6,8-7,2.

Ферментационная среда (%): крахмал - 0,6-1,4, сахароза - 1-3, соевая мука - 2-4, кукурузный экстракт - 0,6-1,0, СоСl2·6Н2O - 0,007-0,012, КН2РO4 - 0,02, мел - 0,05-0,12, (NH4)2SO4 - 0,06-0,14, FeSO4·7H2O - 0,01-0,02, MgSO4·7H2O - 0,01-0,03, NaCl - 0,2-0,6; вода водопроводная. рН до стерилизации следует довести до величины 6,8-7,2.

Уровень биосинтеза составляет не менее 85 мкг/мл (85-100) при соблюдении описанных ниже условий проведения биосинтеза на разработанных для данного штамма-продуцента посевной и ферментационной питательных средах.

Проведение ферментации

Засев колб с посевной средой производят кусочком агаровой среды с поверхностным ростом культуры площадью примерно 2 см2. Посевной материал выращивают 2 суток при 28°С. В ферментационные колбы вносят посевной материал в количестве 5 об.%. Рост 5 суток при 28-31°С. Качалка подвесная 220 об/мин.

Выделение митомицина С

После завершения ферментации мицелий фильтруют и отбрасывают, а к фильтрату культуральной жидкости добавляют двойной объем осаждающей смеси (смесь ацетонитрила и метанола или этанола в соотношении 1:1), выдерживают при 0°С в течение 1 ч до образования осадка, затем центрифугируют при 3000 об/мин 20 мин и осадок выбрасывают.

Определение уровня биосинтеза митомицина С методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ)

Аналитическую ВЭЖХ проводят на хроматографе Shimadzu LC10 vp с использованием колонок Диасфер110-С18 (4,0·250 мм, зернение 5 мкм) АО БиоХимМак, Россия. Объем петли инжектора - 20 мкл. Обработанную надосадочную жидкость, полученную выше, вводят в петлю хроматографа. Детектирование проводят при длине волны 356 нм. Элюирующая система содержит 0,01 М раствор Н3РО4 рН 2,6 и ацетонитрил. При градиентном элюировании, при скорости потока 1,0 мл/мин и комнатной температуре, концентрация ацетонитрила изменяется следующим образом:

Время (мин) 0 5 15 18 20 30 Ацетонитрил (%) 10 15 20 70 10 10

Время выхода митомицина С в этих условиях составляет 10,9 мин.

Расчет содержания митомицина С.

Из лекарственной формы митомицина С (фирмы Kyowa) готовили стандартный раствор в метаноле с концентрацией 1 мг/мл (с учетом, что помимо 2 мг действующего вещества во флаконе присутствует наполнитель). В культуральную жидкость, не содержащую митомицин С, вносят стандартный раствор антибиотика (конечная концентрация - Сст), экстрагируют как указано выше, хроматографируют и определяют площадь под кривой стандартного образца культуральной жидкости(AUCст). Возврат при экстракции составляет 87±2,3%. Содержание митомицина С в культуральной жидкости рассчитывают по формуле:

Амг/мл=AUCпр·Кпересч; Кпересч=(AUCпр×Сст):AUCст,

где Амг/л - концентрация митомицина С в культуральной жидкости;

AUCст - площадь под кривой при хроматографировании стандартного образца культуральной жидкости;

AUCпр - площадь под кривой при хроматографировании анализируемого образца;

Сст - концентрация митомицина С в стандартном образце культуральной жидкости (в мг/л);

Кпересч - коэффициент для пересчета концентраций митомицина С в мг/л.

При хроматографических условиях, описанных выше, и Сст=100 мг/л величина Кпересч=0,0508.

Точность измерения - Амг/л±2,5 мг/л.

Уровень продуктивности штамма митомицина С №3810/ОЕ составляет от 85 до 100 мкг/мл.

Далее настоящее изобретение поясняется примером, который служит его иллюстрацией и не ограничивает области охвата, изложенной в формуле изобретения.

Пример

Месячную агаровую культуру штамма 3810/ОЕ высевают в количестве 2 см2 с растущим мицелием в колбу Эрленмейера объемом 750 мл, содержащую 100 мл посевной среды следующего состава (%): глюкоза - 1, крахмал -1, соевая мука - 4, кукурузный экстракт - 0,9, КН2РО4 - 0,02, мел - 0,9, (NH4)2SO4 - 0,1; вода водопроводная. рН до стерилизации доводят до величины 7,0. Колбу выдерживают 48 ч на качалке с 200 об/мин при 28°С. Полученный посевной материал передают в количестве 5 мл в колбу Эрленмейера объемом 750 мл, содержащую 100 мл ферментационной среды следующего состава (%): крахмал - 1, сахароза - 2, соевая мука - 3, кукурузный экстракт - 0,9, СоСl2·6Н2O - 0,01, КН2РO4 - 0,02, мел - 0,9, (NH4)2SO4 - 0,1, FeSO4·7H2O - 0,015, MgSO4·7H2O - 0,02, NaCl - 0,4; вода водопроводная. рН до стерилизации доводят до величины 7,0. Колбу выдерживают на качалке с 200 об/мин при 3°С в течение 114 ч. После завершения ферментации мицелий фильтруют и отбрасывают, а к фильтрату культуральной жидкости добавляют 200 мл осаждающей смеси ацетонитрила и метанола в соотношении 1:1, выдерживают на холоде (при 0°С) в течение 1 ч и центрифугируют при 3000 об/мин 20 мин для удаления образовавшегося осадка. 20 мкл полученной надосадочной жидкости вводят в петлю хроматографа Shimadzu LC10 vp (колонка Диасфер110-С18, 4,0·250 мм, зернение 5 мкм). Определение проводят при длине волны 356 нм. Уровень продуктивности составляет 92 мкг митомицина С в 1 мл культуральной жидкости.

Похожие патенты RU2420568C2

название год авторы номер документа
СПОСОБ БИОСИНТЕЗА ЦЕФАЛОСПОРИНА С С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ НОВОГО ШТАММА ACREMONIUM CHRYSOGENUM ВКМ F-4081D 2009
  • Бартошевич Юрий Эдуардович
  • Новак Марина Иоганновна
  • Домрачева Алла Георгиевна
  • Скрябин Константин Георгиевич
RU2426793C2
ШТАММ MICROMONOSPORA PURPUREA VAR.VIOLACEA - ПРОДУЦЕНТ АНТИБИОТИКА ГЕНТАМИЦИНА И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГЕНТАМИЦИНА 1991
  • Бартошевич Ю.Э.
  • Владимиров А.В.
  • Абрасимовский П.И.
  • Виханский Ю.Д.
  • Исаева Н.Л.
  • Артамонова З.П.
RU2033426C1
ШТАММ Saccharopolyspora erythraea C-77-ПРОДУЦЕНТ АНТИБИОТИКА ЭРИТРОМИЦИНА 2004
  • Сергеева Алла Владимировна
  • Шушеначева Елена Васильевна
  • Мичурина Татьяна Анатольевна
  • Павлутина Василиса Игоревна
  • Петрищева Ольга Аркадьевна
  • Бирюков Валентин Васильевич
  • Щеблыкин Игорь Николаевич
RU2281332C2
ШТАММ STREPTOMYCES FRADIAE - ПРОДУЦЕНТ ТИЛОЗИНА 1992
  • Жданов В.Г.
  • Юстратова Л.С.
  • Ярославцева Н.Г.
RU2018536C1
ШТАММ STREPTOMYCES HYGROSCOPICUS 7 - ПРОДУЦЕНТ ПРОТЕОЛИТИЧЕСКОГО ФЕРМЕНТА ГИГРОЛИТИНА 1998
  • Полатовская О.Г.
  • Пронина М.И.
  • Малков М.А.
  • Фадеева И.П.
RU2152432C1
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТА ДЛЯ БОРЬБЫ С БОЛЕЗНЯМИ РАСТЕНИЙ 1998
  • Мосин В.А.
  • Дриняев В.А.
  • Кругляк Е.Б.
  • Котова Г.Л.
  • Суставова С.И.
  • Сафонов В.С.
RU2144292C1
ШТАММ БАКТЕРИЙ BREVIBACTERIUM SP. - ПРОДУЦЕНТ L-ЛИЗИНА 1993
  • Зайцева З.М.
  • Гусятинер М.М.
  • Ясиновский В.Г.
  • Толмачев О.Э.
  • Дебабов В.Г.
RU2034921C1
Штамм актиномицета SтRертомYсеS LaVeNDULae SUвSр.аRUртINI для получения аруптина 1989
  • Кузнецов Владимир Дмитриевич
  • Удалова Татьяна Павловна
SU1631083A1
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КЛАВУЛАНОВОЙ КИСЛОТЫ 1997
  • Краньц Саса
  • Ракман Артур
RU2188868C2
ШТАММ STREPTOMYCES FRADIAE - ПРОДУЦЕНТ ТИЛОЗИНА 1993
  • Дриняев Виктор Антонович[Ru]
  • Березкина Надежда Евгеньевна[Ru]
  • Кругляк Елена Борисовна[Ru]
  • Зиновьев Олег Анатольевич[Ru]
  • Мосин Владимир Александрович[Ru]
  • Штейман Борис Романович[Ua]
  • Высоцкий Валентин Петрович[Ua]
  • Юркив Василий Андреевич[Ru]
  • Лисовенко Василий Трофимович[Ua]
RU2057180C1

Реферат патента 2011 года ШТАММ И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИБИОТИКА МИТОМИЦИНА С ПУТЕМ БИОСИНТЕЗА

Штамм Streptomyces caespitosus 3810/OE - продуцент митомицина С получен из исходного штамма, выделенного из почвы, путем обработки химическими мутагенами с последующей ступенчатой селекцией и депонирован в Коллекции культур микроорганизмов ГУ НИИ по изысканию новых антибиотиков им. Г.Ф.Гаузе РАМН под номером ИНА 01082. Для продуцирования митомицина С штамм выращивают на посевной среде следующего состава (%): глюкоза - 0,6-1,4, крахмал - 0,6-1,4, соевая мука - 2-5, кукурузный экстракт - 0,6-1,0, KH2PO4 - 0,01-0,03, мел - 0,05-0,12, (NH4)2SO4 - 0,06-0,14, вода водопроводная, рН до стерилизации 6,8-7,2 и затем передают на ферментационную среду следующего состава (%): крахмал - 0,6-1,4, сахароза - 1-3, соевая мука - 2-4, кукурузный экстракт - 0,6-1,0, CoCl2·6Н2О - 0,007-0,012, KH2PO4 - 0,02, мел - 0,05-0,12, (NH4)2SO4 - 0,06-0,14, FeSO4·7H2O - 0,01-0,02, MgSO4·7H2O - 0,01-0,03, NaCl - 0,2-0,6, вода водопроводная, рН до стерилизации 6,8-7,2. Штамм выращивают в условиях аэрирования в течение 100-120 ч, затем мицелий удаляют центрифугированием или фильтрацией, а надосадочную жидкость, содержащую целевой продукт, экстрагируют смесью ацетонитрила и метилового или этилового спирта. Уровень продуктивности митомицина С штаммом составляет от 85 до 100 мкг/мл. 2 н.п. ф-лы, 1 табл.

Формула изобретения RU 2 420 568 C2

1. Штамм - продуцент митомицина С Streptomyces caespitosus 3810/OE, депонированный в Коллекции культур микроорганизмов Государственного учреждения Научно-исследовательский институт по изысканию новых антибиотиков им. Г.Ф.Гаузе Российской академии медицинских наук (ГУ НИИНА РАМН) под номером ИНА 01082.

2. Способ получения митомицина С, в котором используется штамм - продуцент митомицина С по п.1, который выращивают 40-52 ч в условиях аэрирования на посевной среде следующего состава, %: глюкоза 0,6-1,4, крахмал 0,6-1,4, соевая мука 2-5, кукурузный экстракт 0,6-1,0, KH2PO4 0,01-0,03, мел 0,05-0,12, (NH4)2SO4 0,06-0,14, вода водопроводная, рН до стерилизации 6,8-7,2, и передают в ферментационную среду следующего состава, %: крахмал 0,6-1,4, сахароза 1-3, соевая мука 2-4, кукурузный экстракт 0,6-1,0, CoCl2·6H2O 0,007-0,012, KH2PO4 0,02, мел 0,05-0,12, (NH4)2SO4 0,06-0,14, FeSO4·7H2O 0,01-0,02, MgSO4·7H2O 0,01-0,03, NaCl 0,2-0,6, вода водопроводная, рН до стерилизации 6,8-7,2, на которой выращивают в условиях аэрирования в течение 100-120 ч, после чего мицелий удаляют центрифугированием или фильтрацией, а надосадочную жидкость экстрагируют смесью ацетонитрила и метилового или этилового спирта.

Документы, цитированные в отчете о поиске Патент 2011 года RU2420568C2

US 2003124689 A1, 03.07.2003
US 6495348 B1, 17.12.2002
JP 4187092 A, 03.07.1992
Способ получения митомициновых производных 1984
  • Вильям А.Ремерс
SU1272993A3
Способ получения антибиологического комплекса,обладающего противоопухолевой активностью 1980
  • Хидео Косияма
  • Фумихиде Сакаи
  • Хироаки Окума
SU999981A3

RU 2 420 568 C2

Авторы

Ефременкова Ольга Владимировна

Козлов Дмитрий Геннадьевич

Гладких Елена Георгиевна

Макарова Марина Олеговна

Васильева Бязеля Фейзулловна

Сумарукова Ирина Георгиевна

Байшев Иосиф Тагирович

Толстых Ирина Владимировна

Тимофеева Алла Викторовна

Резникова Марина Ильинична

Малютина Наталья Михайловна

Глухова Алла Алексеевна

Катруха Генрих Степанович

Даты

2011-06-10Публикация

2009-05-20Подача