ШТАММ ASPERGILLUS FUMIGATUS №6, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИГЕНА Российский патент 2003 года по МПК C12N1/14 A61K39/00 C12P1/06 C12N1/14 C12R1/68 

Изобретение относится к микробиологии, в частности к микологии, и может быть использовано для получения антигенов, применяемых при приготовлении диагностических и иммуногенных препаратов против аспергиллеза сельскохозяйственных животных и птицы.

Максимальное получение антигенов прямо пропорционально продуктивности штамма по ряду признаков, главным из которых является интенсивность спорообразования.

Указанный признак, а также низкая токсигенность и выраженные иммуногенные свойства определяют целесообразность использования штамма для производства дагностикумов и конструирования вакцинных препаратов.

Известен штамм Aspergillus flavus Link ВНИИА 335 А - продуцент микотоксина коевой кислоты (см. патент РФ 2046137 по кл. С 12 N 1/00, опуб. 20.10.95 г.).

Однако этот штамм обладает повышенной токсинообразующей способностью. Кроме того, он продуцирует микотоксин - коевую кислоту, не имеющую определяющего значения в антигенном наборе у Aspergillus fumigatus, и не может быть использован при конструировании биопрепаратов.

Известен также штамм Aspergillus fumigatus 4238 - продуцент фумагиллина (см. патент РФ 2077587, по кл. С 12 Р 1/06, опуб. 20.04.97 г.).

Однако антиген данного штамма может быть использован только для профилактики и лечения нозематоза пчел и амебиаза плотоядных.

Наиболее близким к заявляемому является штамм Aspergillus fumigatus 157/32 - продуцент белковых антигенов (см. патент РФ 2172342 по кл. С 12 N 1/14, опуб. 20.08.01 г.).

Однако данный штамм нельзя использовать для получения антигена - полисахарида. Кроме того, данный штамм обладает низкой спорообразующей активностью.

Изобретение направлено на решение задачи создания нового штамма - Aspergillus fumigatus 6, обладающего высокой спорообразующей активностью, отсутствием патогенности (низкой токсигенностью) и наличием иммуногенных свойств.

Штамм Aspergillus fumigatus 6 выделен в Саратовской научно-исследовательской ветеринарной станции (НИВС) из фекалий больного теленка 1,5-месячного возраста, депонирован во Всероссийском государственном научно-исследовательском институте контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов и кормов (ВГНКИ), хранится в Саратовской НИВС.

Штамм Aspergillus fumigatus 6 характеризуется следующими признаками.

Морфологические признаки
Аспергиллы представлены ветвящимися переплетающимися гифами 3-5 мкм ширины с поперечными перегородками. Органы плодоношения имеют фляжкообразные утолщения на концах гиф с цепочками спор по периферии. В окрашенных по Граму мазках аспергиллы представлены в виде грамположительных гиф и их фрагментов.

Культуральные признаки
На пластинчатом агаре Сабуро через 24-48 ч роста при 37^oС образуется беловатый пушистый налет. Через 72-96 ч вырастает массивная колония круглой формы с зеленовато-голубоватым оттенком в центре и белой каймой по периферии. В бульоне Сабуро на 3 сутки культивирования отмечается поверхностный рост культуры бархатистого вида темно-зеленого цвета.

Антигенные свойства
Штамм Aspergillus fumigatus 6 обладает свойствами липополисахарида и продуцирует комплекс токсинов: фумагиллин, фумигатин, глиотоксин и треморген в незначительных количествах.

Чувствительность к антибиотикам: зона задержки роста культуры штамма левориновыми дисками составляет 9 мм, нистатиновыми - 8 мм.

У штамма отсутствует ауксотрофность.

Вирулентные свойства
Внутрибрюшинное введение культуры штамма в концентрации до 1•10⁸ спор/мл в объеме 0,5 мл гибели белых мышей не вызывает. При внутривенном введении культуры в объеме 0,5 мл: LД₁₀₀ - 1•10⁸ спор/мл, LД₅₀ - 1•10⁷ спор/мл, LД₀ - 5•10⁶ спор/мл. Гибель на 2-5 сутки.

Штамм относится к III группе патогенности - условно патогенный.

Штамм Aspergillus fumigatus 6 поддерживается методом периодических пересевов на искусственных питательных средах по признаку споробразования и культурально-морфологическим свойствам. В работе со штаммом мутагены не использовались.

Пассажирования на животных не требуется.

Штамм хранят на агаре Сабуро в течение не более 15-30 сут, с последующим пересевом вначале на бульон Сабуро, а затем на агар Сабуро. Оптимальный способ хранения штамма - в ампулах в лиофилизированном состоянии при температуре 4^oС до 1 года.

Пример 1
Штамм Aspergillus fumigatus 6 выращивают при 37^oС на питательных средах: Сабуро, Чапека или разработанной Саратовской НИВС по патенту РФ 2093569, опуб. 20.10.97 г., содержащей, мас.%:
Глюкоза - 4-5
Гидролизат лактальбумина - 0,45-0,55
Сыворотка крови крупного рогатого скота - 9-11
Солевой раствор Хенкса - Остальное
Солевой раствор Хенкса содержит, г:
Хлористый натрий (NaCl) - 0,8
Хлористый калий (КСl) - 0,04
Сернокислый магний (MgSO₄•7Н₂О) - 0,01
Хлористый магний (MgCl•6H₂O) - 0,01
Двузамещенный фосфорнокислый натрий (Na₂HPO₄) - 0,006
Однозамещенный фосфорнокислый калий (КН₂РO₄) - 0,06
Хлористый кальций (СаСl₂) - 0,014
Феноловый красный - 0,002
Бидистиллированная вода - До 100
рН-7-7,2
При культивировании штамма на жидких питательных средах штамм выращивают в течение 12-15 сут, а при инкубировании на плотных питательных средах - в течение 6-12 сут.

Спорообразование штамма испытано методом подсчета клеток в камере Горяева с использованием фазоконтрастного устройства по формуле:
(a•4000•1000):b=x,
где а - число сосчитанных клеток;
b - число малых квадратов камеры.

Результаты спорообразования штамма Aspergillus fumigatus 6 представлены в таблицах 1 и 2.

Пример 2
Штамм Aspergillus fumigatus 6 культивируют на питательной среде, разработанной Саратовской НИВС по патенту РФ 2093569, состав которой описан в примере 1. Культивирование осуществляют в течение 12 сут при температуре 37^oС. Затем осуществляют фильтрацию через мембрану "Владипор" 3 для освобождения от мицелия культуры штамма. Вносят раствор формалина 0,4%-ной концентрации и добавляют масляный адъювант в соотношении 5 ч. антигена и 1 ч. адъюванта.

Полученным антигеном иммунизировали лабораторных животных. В последующем их подвергали заражению вирулентным штаммом Aspergillus fumigatus. В качестве контроля использовали неиммунизированных животных.

Результаты иммунизации представлены в таблице 3.

Таким образом, предлагаемый штамм Aspergillus fumigatus 6 обладает высокой спорообразующей способностью, а в антигенном отношении - иммуногенностью.

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к получению антигена. Для получения антигена используют штамм Asp.fumigatus 6, выделенный из фекалий больного теленка. При культивировании штамма 6 в питательной среде получают антиген - полисахарид. Получаемый антиген используют для получения препаратов против аспергиллеза сельскохозяйственных животных. Штамм Asp.fumigatus 6 обладает повышенной спорообразующей активностью, отсутствием патогенности и наличием иммуногенных свойств. 3 табл.

Штамм Aspergillus fumigatus 6, депонирован в коллекции ВГНКИ, используемый для получения антигена.