СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ С5-КОМПОНЕНТА КОМПЛЕМЕНТА ЧЕЛОВЕКА Российский патент 1997 года по МПК A61K35/14 

Изобретение относится к медицине, в частности к биохимии и иммунохимии, и может быть использовано в диагностике заболеваний, связанных с активацией системы комплемента: болезней иммунных комплексов, инфекционных заболеваний, респираторного дистресс-синдрома взрослых, наследственных дефицитов регуляторных белков системы комплемента.

Широко распространены способы выделения C5 компонента комплемента, в которых обычно используются хроматографические процедуры. Способ, описанный Ake Lundwall and Gosta Eggertsen (1985), схематично может быть представлен в виде 4-х последовательных хроматографий: ионообменная хроматография свежей плазмы, обработанной PMST, на QAE-сефадексе, затем на SP-сефадексе, на DEAE-сефацеле и SM-сефарозе, и, как заключительная стадия, иммуноадсорбция C3 компонента комплемента.

Прототипом получения очищенного C5 компонента комплемента является способ, описанный Tack B.F. и Prahi W. (1976). Он включает: ступенчатое фракционирование свежей плазмы с поли-(этиленгликолем) м.м.4000-6000, ряд последовательных хроматографических процедур (биоспецифическая хромотография на L-лизин-сефарозе 4B для удаления плазминогена), ионообменная хроматография на DEAE-целлюлозе, гель-фильтрация на сефарозе CL-6B, хроматография на гидроксил-апатите) с контролем гемолитической активности на каждой стадии. Этот способ многостадиен, в связи с чем значительны потери на каждой хроматографической стадии, в нем используются дорогостоящие реактивы, сорбенты для хроматографий, ценная донорская плазма.

Целью изобретения является упрощение и удешевление способа выделения C5 компонента комплемента, а также утилизация отходов промышленного фракционирования плазмы.

Поставленная цель достигается тем, что в качестве источника C5 компонента комплемента используется осадок IV-1, являющийся бросовой фракцией при промышленном производстве препаратов крови спиртовом фракционировании плазмы на холоду по методу Кона (Cohn et al. 1946), содержащий компоненты комплемента.

Первой стадией выделения C5 компонента комплемента является осаждение 20% -ного осадка IV-1, растворенного в 0,1 M K-P, pH 7,0, 10 мМ ЭДТА, 0,5 M NaCl, поли-(этиленгликолем) м.м. 4000-6000 до конечной концентрации 16% ПЭГ при перемешивании при 4^oC. Образовавшийся осадок отделяют центрифугированием в течение 20 мин при 6000 об/мин, 4^oC. На второй стадии 16%-ный ПЭГ-осадок, растворенный в 0,01 M K-P, pH 7,0, 10 мМ ЭДТА, 50 мМ NaCl, хроматографируют на DEAE-Toyopearl, уравновешенной тем же буфером. Для элюции связавшихся белков используют линейный градиент концентрации NaCl 0,05-0,25 M. На этой стадии C5 содержит 20-30% измеренного в РИД по Манчини. Для удаления C3 отдиализованный в 0,01 M K-P, pH 7,0, пул C5/C3 подвергают хроматографии на катионообменнике KM-сефадексе в 0,01 M K-P, pH 7,0, для элюции связывавшегося C5 компонента комплемента используют линейный градиент концентрации NaCl 0-0,15 M. На четвертой стадии сконцентрированные с помощью ультрафильтрации C5-содержащие фракции дополнительно очищают гель-фильтрацией на сефакриле S-200 в 0,01 M K-P, pH 7,0, 0,15 M NaCl, 0,02% NaN₃. Идентификацию C5 компонента комплемента на каждой стадии проводят иммунохимически.

Предлагаемый способ получения C5 компонента комплемента не требует ценного исходного сырья донорской плазмы, а позволяет осуществить безотходную технологию на одном их этапов производства препаратов крови, способ достаточно прост в осуществлении, не требует дорогостоящих сорбентов для хроматографии.

Очищенный C5 компонент комплемента может быть использован:
как иммуноген для гипериммунизации животных с целью получения моноспецифической анти-C5 преципитирующей сыворотки,
для удаления нежелательных анти-C5-антител из поливалентных сывороток,
для определения титров анти-C5 преципитирующих сывороток методом РИД по Манчини.

Схема выделения С5 компонента комплемента человека из осадка IY-1 по Кону представлена ниже.

н

Изобретение относится к медицине, в частности к биохимии и иммунохимии, и может быть использовано в диагностике заболеваний, связанных с активацией системы комплемента. Цель изобретения - упрощение и удешевление способа выделения C5 компонента комплемента, утилизация отходов промышленного фракционирования плазмы. Спиртовой осадок IV-1 по Кону осаждают 16% поли-(этиленгликолем) м. м. 4000-6000, из образовавшегося осадка выделяют пул C5/C3 путем анионообменной хроматографии на DEAE-Toyoperl, затем отделяют C5 на катионообменнике CM-сефадексе и дополнительно дочищают C2-содержащие фракции гель-фильтрацией на сефакриле S-200. Предлагаемый способ выделения C5 компонента комплемента прост в осуществлении, не требует дорогостоящих сорбентов для хроматографии, и что особенно важно в качестве источника C5 компонента комплемента используется бросовый осадок IV-1 по Кону.

Способ выделения С5-компонента комплемента человека, включающий обработку сырья на основе крови человека с помощью полиэтиленгликоля 4000 6000, центрифугирование с последующей очисткой осадка на ДЭАЭ-анионообменнике, отличающийся тем, что в качестве исходного сырья используют осадок IV-I фракционирования плазмы крови по Кону, перед обработкой полиэтиленгликолем его растворяют в буферном растворе высокой ионной силы при нейтральном pH, ионообменную хроматографию проводят на КМ-катионообменнике, а гель-фильтрацию на сефакриле S-200.