ПРЕПАРАТ ИММУНОГЛОБУЛИНА ДЛЯ ВНУТРИВЕННОГО ВВЕДЕНИЯ И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ Российский патент 1998 года по МПК A61K39/395 C07K1/34 

Изобретение относится к медицине, а именно к производству препаратов иммуноглобулина для внутривенного введения из крови человека.

Препараты иммуноглобулинов - высокоэффективное средство лечения и профилактики различных инфекционных и иммунодефицитных заболеваний. Однако при ряде заболеваний, когда требуются большие дозы иммуноглобулина, внутримышечное применение препарата невозможно из-за протеолиза иммуноглобулина в месте инъекции и длительном всасывании в кровь. Поэтому в настоящее время препараты вводят внутривенно, что позволяет достигать максимальной эффективности в короткий срок.

Внутривенное применение препарата иммуноглобулина связано с целым рядом побочных эффектов, основным из которых является активация системы комплемента с образованием анафилатоксинов, активации калликреин-кининовой, плазминовой систем и системы свертывания крови, клинически проявляющейся тяжелой реакцией, сопровождающейся одышкой, дрожью, тошнотой, а в некоторых случаях и коллапсом (Geha et Rosen, 1994). Считается, побочные реакции обусловлены присутствием в препарате агрегированных и поврежденных при фракционировании молекул иммуноглобулина, на Fc-участке которых происходит активация комплемента, что приводит в свою очередь к активации макрофагов и освобождению вазоактивных субстанций (Bleeker et al., 1989). Нарушение конфигурации Fc-фрагмента происходит из-за дегидратации белка при добавлении этанола к плазме (Анастасиев В.В., 1993).

Устранение комплемент-связывающей активности иммуноглобулина достигают различными способами. В препаратах первого поколения иммуноглобулины обрабатывают протеолитическими ферментами, с помощью которых от молекулы отщепляется Fc-фрагмент, ответственный за связывание комплемента (анастасиев В.В. и соавт. , 1985). Возможен кислотный гидролиз иммуноглобулина в присутствии остаточного количества пепсина (Barandun et Isliker, 1986).

В препаратах второго поколения подавление активации комплемента достигается за счет обратимого или необратимого химического преобразования как мономерного, так и полимерного IgG путем обработки в-пропиолактоном, алкилирования или сульфитолиза. В результате химического преобразования получаются продукты с хорошей толерантностью в отношении внутривенного введения, однако это всегда сопровождается значительным снижением биологической активности препаратов (Romer et al., 1982).

Другим способом сохранить структуру и функцию антител были попытки предотвратить образование агрегатов иммуноглобулина а priory во время фракционирования плазмы путем введения стабилизаторов, например альбумина, полиэтиленгликоля или других веществ (Наssig, 1987). Однако полное образование полимеров во время фракционирования не может быть подавлено, и опасность инициирования системных реакций остается.

Наиболее близким техническим решением из известных является способ получения внутривенного иммуноглобулина путем концентрирования фракции III Кона (фильтрата "Б") ультрафильтрацией при pН 4, отмывку от этанола, доведение до 8% белка и добавление стабилизаторов. Конечный препарат имеет содержание белка 5%, pН от 3,5 до 5,0 (предпочтительно 4,25), и включает в качестве стабилизатора 10% мальтозы (Tenold, 1983). Антикомплементарная активность этого препарата равняется 3 мг белка, не активирующего 1 гемолитическую единицу комплемента (что равнозначно 6 мг белка, не активирующих 2 СН₅₀). По данным зарубежных исследователей данный препарат может вызывать побочные реакции при внутривенном введении. Так, из 39 пациентов во время 232 инфузий у 5,1% наблюдались побочные реакции (Schwartz, 1987).

Препарат, пригодный в России для внутривенного введения, должен содержать не менее 10 мг белка, не активирующих 2 гемолитические единицы комплемента (2 СН₅₀) (Киселева И.А. и соавт., 1988).

Задачей изобретения является разработка препарата иммуноглобулина для внутривенного введения с антикомплементарной активностью не менее 10 мг белка, полностью ареактогенного при внутривенном применении, и способа его получения.

Препарат для внутривенного введения, содержащий иммуноглобулин, полученный концентрированием фракции III спиртового метода Кона, содержит 5% белка, имеет величину рН 3,5-5,0 и стабилизатор, отличается тем, что имеет восстановленные гидратные оболочки молекул.

Способ получения препарата для внутривенного введения, содержащего иммуноглобулин, включает концентрирование фракции III спиртового метода Кона ультрафильтрацией при величине pН 3,5-5,0, отмывку от этанола, заключительное концентрирование раствора, добавление стабилизатора, установление содержания иммуноглобулина в растворе 5% и величины pН 3,5-5,0, стерилизующую фильтрацию и высушивание. При этом дополнительно перед добавлением стабилизатора проводят операцию по восстановлению гидратных оболочек молекул иммуноглобулина методом молекулярной фильтрации (диализ или ультрафильтрация) путем создания градиента концентрации низкомолекулярных веществ по разные стороны полупроницаемой мембраны. Для ультрафильтрации или диализа используют ультрафильтрационную мембрану с пределом отсечения по молекулярной массе менее 100 тыс Да или диализные вискозные оболочки.

Преимущества предлагаемого способа получения препарата внутривенного иммуноглобулина доказаны в специальной серии экспериментов.

Образцы препаратов были проанализированы методом электро- и иммуноэлектрофореза, колоночной хроматографией на ультрагеле АсА-34. Способность иммуноглобулинов связывать комплемент оценивали тремя различными способами: общепринятым макрометодом (Киселева И.А. и соавт., 1988), микрометодом Козлов Л. В. и соавт. , 1985) и в модельной системе in vitro в соответствии с рекомендациями (Bleeker et al., 1987). В последнем случае морским свинкам внутривенно вводили 250 мг/кг иммуноглобулина, через 15 мин после инъекции забирали по 5 мл крови и отделяли сыворотку, в которой определяли титр комплемента.

При иммуноэлектрофорезе во всех образцах препарата выявлялась одна четкая дуга преципитации в области гамма-глобулина, соответствующая IgG человека.

При колоночной хроматографии препарата иммуноглобулина на ультрагеле АсА-34 или сефадексе G-200 оба образца иммуноглобулина содержали более 90% мономеров, однако только в препарате, подвергнутом диализу, агрегаты отсутствовали, что наглядно видно из фиг.1.

Оба внутримышечных препарата активно связывали комплемент, внутривенный коммерческий препарат (прототип) имел антикомплементарную активность 5 мг белка, не активирующего 2 СН₅₀, тогда как препараты, полученные предлагаемым способом, по данным как макро-, так и микровариантов реакции, не обладали способностью активировать комплемент в дозе 10 и 15 мг белка.

Полная безопасность внутривенного введения препаратов, имеющих низкую величину рН, подтверждается отсутствием падения титра комплемента у морских свинок после применения 250 мг иммуноглобулина на кг массы (Bleeker et al., 1987). Если в контроле содержание комплемента составило (100,4±5,9) ед. СН₅₀/мл, а после введения обычного интрамускулярного иммуноглобулина - только (68,2 ± 4,6), то при применении препарата, приготовленного по разработанной технологии, содержание комплемента составило (108,7 ± 4,7) СН₅₀. Содержание комплемента после введения коммерческого иммуноглобулина (прототип), составило (91,0 ± 5,1) СН₅₀. Содержание комплемента после введения коммерческого иммуноглобулина (прототип), составило (91,0 ± 5,1) СН₅₀, что доказывает преимущества предлагаемого способа получения внутривенного иммуноглобулина.

Прямое доказательство безопасности внутривенного препарата продемонстрировано в модельных экспериментах путем внутривенного введения препаратов крысам с непрерывной регистрацией артериального давления элекроманометром (фиг.2).

Антикомплементарная активность препаратов была изучена тремя методами. Результаты определения степени связывания комплемента макро- и более чувствительным микрометодом представлены в таблице.

Введение обычного внутримышечного препарата сопровождалось падением среднего артериального давления с (80,2 ± 4) мм рт.ст. до (56,3 ± 5) мм рт. ст. и сопровождалось урежением сердечных сокращений, появлением дополнительных волн. Введение 250 мг/кг препарата, полученного предлагаемым способом, практически не изменяло среднее артериальное давление (83,7 ± 5 мм рт. ст.).

Таким образом, препарат иммуноглобулина, приготовленный по разработанной технологии, не обладает спонтанной способностью связывать комплемент, не содержат агрегированных молекул и безопасен при внутривенном введении.

Препарат иммуноглобулина получают следующим образом.

Фракцию III метода Кона (соответствует фильтрату "Б"), представляющую сбой очищенный раствор иммуноглобулина с рН 5,1-5,4 и содержанием этанола 17-20%, собирают в емкость (реактор) и коррегируют рН до 4,0-4,3, а затем подвергают концентрированию на ультрафильтрационной установке с мембранами с пределом отсечения по молекулярной массе 50-100 тыс. дальтон (мол.масса молекулы иммуноглобулина 160 тыс.д.). После уменьшения объема раствора в 10-12 раз проводят отмывку от этанола путем непрерывной подачи дистиллированной воды по объему в 3-5 раз больше, чем раствор иммуноглобулина. После этого концентрируют раствор до содержания белка 8-9% и доводят величину рН до 4,25. В заключение проводят восстановление гидратных оболочек имммуноглобулина методом молекулярной фильтрации.

Для этого раствор иммуноглобулина помещают по одну сторону полупроницаемой мембраны, а другая сторона мембраны в избытке непрерывно омывается низкомолекулярным раствором (например, дистиллированной водой или 10%-ной мальтозой). В процессе циркуляции иммуноглобулина с одной стороны мембраны и низкомолекулярного раствора с другой стороны мембраны создается градиент концентраци (иммуноглобулин - вода), в результате чего молекулы воды извне непрерывно диффундируют через полупроницаемую мембрану и встраиваются в поврежденные или дегидратированные этанолом участки гидратной оболочки иммуноглобулина, за счет чего практически полностью восстанавливаются пространственная конфигурация молекулы иммуноглобулина, увеличивается электростатическое отталкивание, что приводит к дезагрегации (исчезновению агрегатов иммуноглобулина) и предотвращению их спонтанной способности активировать комплемент. В качестве полупроницаемых мембран могут быть использованы ультрафильтрационные мембраны с пределом отсечения по молекулярной массе менее 100 тыс. дальтон или диализные вискозные оболочки. В дальнейшем вводят стабилизатор, устанавливают содержание белка в растворе иммуноглобулина 5%, pН 3,5-5,0. Препарат подвергают стерилизующей фильтрации и лиофильно высушивают. Получают конечный продукт.

Термины "молекулярная фильтрация", "градиент концентрации" и "фракция III спиртового метода Кона" являются общепринятыми (Фрайфелдер, 1980, Curling, 1980).

Пример 1. Фильтрат "Б" в количестве 200 л с pН 5,3 перекачивают в реактор и с помощью 1 N раствора HCL коррегируют до 4,1, и подвергают концентрированию на ультрафильтрационной установке с мембранами УПМП-100 с площадью фильтрации 6 кв.м. в течение 3 ч. После уменьшения объема раствора до 20 л в реактор начинают непрерывно подавать 95-100 л дистиллированной воды для удаления этанола. После этого раствор концентрируют до содержания белка 8% и получают 5,3 л иммуноглобулина. Проверяют и при необходимости доводят величину pН до 4,25.

Проводят восстановление гидратной оболочки иммуноглобулина методом молекулярной фильтрации. Для этого используют ультрафильтрационный аппарат (например, половолоконный аппарат АР-1,0, выпускаемый ОКБ ТМБ г.Кириши) в режиме диафильтрации. В первичный контур ультрафильтрационного аппарата подают раствор иммуноглобулина, а во вторичном контуре аппарата с помощью насоса обеспечивают циркуляцию диализного раствора. Процесс проводят в течение 4-6 ч. После этого устанавливают содержание белка в растворе 5%, pН 4,25, иммуноглобулин подвергают стерилизующей фильтрации, разливают по флаконам и лиофилизируют. Антикоплементарная активность составляет 10 мг белка, не активирующих 2 СН₅₀.

Пример 2. Фракцию III спиртового метода Кона (фильтрат "Б") в количестве 100 л с pН 5,4 перекачивают в реактор, коррегируют pН до 4,2 и подвергают концентрированию на ультрафильтрационной установке с площадью фильтрации 4 кв. м в течение 2 ч. После уменьшения объема раствора до 10 л в реактор непрерывно подают 45-50 л дистиллированной воды, а затем концентрируют до содержания белка 8,5%, получая 2,5 л полуфабриката иммуноглобулина.

Восстанавливают гидратную оболочку иммуноглобулина, для чего полуфабрикат иммуноглобулина заливают в вискозную полупроницаемую оболочку. Оболочку с раствором иммуноглобулина герметизируют и помещают в емкость с дистиллированной водой. Проводят диализ в течение 12-15 ч при температуре 4-6^oС с периодической сменой диализного раствора (дистиллированной воды). После окончания диализа иммуноглобулин сливают в бутыль, замеряют объем раствора и вводят стабилизатор - мальтозу до конечной концентрации 10%, подводят величину рН до 4,25 и устанавливают содержание белка 5%. Препарат иммуноглобулина подвергают стерилизующей фильтрации, разливают по флаконам и лиофилизируют. Антикоплементарная активность составляет 15 мг белка, не активирующих 2 СН₅₀.

Источники информации
1. Анастасиев В.В./ Разработка молекулярных моделей процесса фракционирования иммуноглобулинов. / Иммуноглобулины. Сборник научных трудов. Нижн. Новгород. - 1993.- с.45-50.

2. Анастасиев В.В., Киселева И.А., Новикова Л.П., Тараева Г.А./ Получение из плазмы крови доноров иммуноглобулина для внутривенного введения/ Гематол. и трасфузиология. - 1985.-10.-с.46-48.

3. Киселева И.А., Анастасиев А.А., Немов В.В., Минакова Л.В., Лаптева Л. К./ Методические рекомендации/ Горький.-1988.

4. Козлов Л.В., Вавилова Л.М., Голосова Т.В. // Иммунология.-1985.-3.-с. 66-68.

5. Фрайфелдер Д. Физическая биохимия. - М.: Мир, 1980, с.165.

6. Barandun S., Isliker H.// Vox Sang.-1986.-51.-2.- p.157.

7. Bleeker W.K. et al.// Vox Sang.-1987.-4.- p.281-290.

8. Bleeker W.K. et al.// Vox Sang.-1989.-77.- p.338.

9. Curling J.M. Methods of plasma proteiin fractionation.// Acad. press. London.-1980.

10. Geha R.S., Rosen F.S.// Therapeutic Immunoloy RSG Chapter, 1994.-11. -p.1-31.

11. Hassig A. Requirements for modern intravenous immunoglobulin preparation and their safe clinical use.- Triangle.-1987.-26.-1.-23-30.

12. Romer J et al., Vox Sang.-1982.-42.-74-80.

13. Rousell R.H./A new intravenous immunoglobulin in adult and childhood idiopathic thrombocytopenic purpura: a rewiew./J.Infect.-1987.-15.-Suppl.1. -p.59-65.

14. Schwartz R.S. //American J. Med.,-1987.-83.-suppl.4A.- p.46-51.

15. Stiehm E.R. Curr. Probl. Pediatr.-1992,-22.-8.- 335-348.

16. Tenold R.A. Patent USA No. 4396608, 1983.

Препарат содержит иммуноглобулин, полученный концентрированием фракции III спиртового метода Кона и отмывкой от этанола, и стабилизатор. При этом он содержит иммуноглобулин с восстановленными гидратными оболочками. При растворении указанный препарат создает величину рН 3,5-5,0. Для получения препарата иммуноглобулина для внутривенного введения фракцию III спиртового метода Кона концентрируют ультрафильтрацией при величине рН 3,5-5,0. После чего отмывают от этанола. Осуществляют заключительное концентрирование раствора и добавляют стабилизатор. Затем устанавливают содержание иммуноглобулина в растворе 5% и величину рН 3,5-5,0. Проводят стерилизующую фильтрацию и высушивание. При этом перед добавлением стабилизатора проводят восстановление гидратных оболочек иммуноглобулина методом молекулярной фильтрации путем создания градиента концентрации низкомолекулярных веществ по разные стороны полупроницаемой мембраны. В качестве полупроницаемой мембраны используют ультрафильтрационную мембрану с пределом отсечения по молекулярной массе менее 100000 Да или диализные вискозные оболочки. Препарат иммуноглобулина, полученный с использованием указанной технологии, обладает антикомплементарной активностью не менее 10 мг белка, ареактогенный при внутривенном введении. 2 с.п. ф-лы, 2 ил, 1 табл.

1. Препарат для внутривенного введения, содержащий иммуноглобулин, полученный концентрированием фракции III спиртового метода Кона и отмывкой от этанола, и стабилизатор и создающий величину pH 3,5 - 5,0, отличающийся тем, что он содержит иммуноглобулин с восстановленными гидратными оболочками. 2. Способ получения препарата для внутривенного введения, содержащего иммуноглобулин, включающий концентрирование фракции III спиртового метода Кона ультрафильтрацией при величине pH 3,5 - 5,0, отмывку от этанола, заключительное концентрирование раствора, добавление стабилизатора, установление содержания иммуноглобулина в растворе 5% и величины pH 3,5 - 5,0, стерилизующую фильтрацию и высушивание, отличающийся тем, что перед добавлением стабилизатора проводят восстановление гидратных оболочек иммуноголобулина методом молекулярной фильтрации путем создания градиента концентрации низкомолекулярных веществ по разные стороны полупроницаемой мемебраны, в качестве которой используют ультрафильтрационную мембрану с пределом отсечения по молекулярной массе менее 100000 Д или диализные вискозные оболочки.