СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ФРАГМЕНТА С3D КОМПОНЕНТА С3 КОМПЛЕМЕНТА ЧЕЛОВЕКА Российский патент 1996 года по МПК A61K35/14 A61K35/16 

Изобретение относится к медицине, в частности к биохимии и иммунохимии, и может быть использовано в диагностике заболеваний, связанных с активацией системы комплемента (СК): болезней иммунных комплексов, инфекционных заболеваний, респираторного дистресс-синдрома взрослых, наследственных дефицитов регуляторных белков СК.

Описанные способы выделения фрагмента С3d компонента С3 комплемента человека принципиально единообразны и схематично могут быть представлены в виде 2 этапов: 1 этап сложный, многоступенчатый процесс выделения высокоочищенного С3 компонента комплемента; 2 этап расщепление С3 компонента комплемента протеолитическими феpментами с последующей гель-фильтрацией и идентификацией С3d фрагмента.

Известен способ выделения С3d фрагмента С3 компонента комплемента из плазмы крови, предложенный J. A. Moore et al. (1976 г.): нормальную дефибринированную донорскую плазму диализуют против дистиллированной воды при слабокислом pН с добавлением ЭДТА. Из осадка эуглобулинов путем ионообменной хроматографии на ДЭФЭ-целлюлозе и хроматографии на гидроксилапатите выделяют С3 компонент комплемента, идентифицируя его с помощью иммунопреципитации. Далее очищенный С3 компонент комплемента обрабатывают С3в-инактиватором (фактором 1) совместно с кофактором Н и выделяют образовавшийся С3d фрагмент гель-фильтрацией на сефадексе G-200, идентифицируя С3d с помощью иммунопреципитации, ИЭФ и ПААГ-электрофореза.

Вышеописанный способ многостадиен, трудоемок, в нем используется ценное донорское сырье плазма, дорогостоящие ферменты, реактивы, сорбенты для хроматографий.

Целью настоящего изобретения является упрощение и удешевление способа выделения С3d фрагмента С3 компонента комплемента, что важно для диагностических препаратов, а также утилизация отходов промышленного фракционирования плазмы.

Поставленная цель достигается тем, что в качестве источника С3d используется осадок IV-I, являющийся бросовой фракцией при промышленном производстве препаратов крови спиртовом фракционировании плазмы крови на холоде по методу Кона (1946 г. ). С3d, обнаруженный в осадке IV-I по Кону, оказался идентичным как С3d, образующемуся в результате острой или хронической активации системы комплемента in vivo, так и С3d, получаемым вследствие активации комплемента in vivo путем прогревания нормальной сыворотки при 37^oC, обработки ее зимозаном, MgCl₂, Е. соli, агрегированными IgG, и представляет полипептид низкого молекулярного веса (28000 47000 Дальтон) с миграцией в α-область при иммуноэлектрофорезе.

Первой стадией выделения С3d фрагмента С3 из осадка IV-I по Кону является осаждение 20%-ного осадка IV-I, растворенного в 0,1 М К-Р, pН 7,1 7,3, 1, мМ ЭДТА, 0,5 М NaCl, поли-(этиленгликолем) с м. м. 4000 6000. 32% ПЭГ 4000 - 6000 добавляют в 20%-ный раствор осадка IV-I до конечной концентрации 16% ПЭГ 4000 6000 при перемешивании, 4^oС. Образовавшийся осадок отделяют центрифугированием в течение 20 минут при 6000 об/мин, 4^oC. Супернатант служит источником для выделения С3d фрагмента С3 компонента комплемента. На второй стадии выделения С3d супернатант диализуют против 0,01 М К-Р, pН 7,5 10 мМ ЭДТА, затем хроматографируют на колонке с ДЕАЕ-Тоyopearl, уравновешенной тем же буфером. Связавшиеся белки элюируют линейным градиентом концентрации NaCl 0 0,3 М. Сконцентрированные путем ультрафильтрации на мембране UM-10 С3d содержащие фракции, идентифицированные с помощью иммунопреципитации против антисыворотки, специфичной к С3d, фирмы "Dakopatts", дополнительно очищают гель-фильтрацией на сефакриле S-200 в 0,01 М К-Р, pН 7,5, 10 мМ ЭДТА, 0,15 М NaCl, 0,02% NaN₃. С3d, полученный описанным способом, имеет молекулярную массу около 45000 Дальтон и мигрирует в a-область в иммуноэлектрофорезе.

Предлагаемый способ выделения С3d фрагмента С3 компонента комплемента человека имеет преимущества перед прототипом: он не требует ценного исходного сырья, каким является донорская плазма, а позволяет осуществить безотходную технологию на одном из этапов производства препаратов. крови, т. к. в качестве исходного сырья используется бросовый осадок IV-I, получаемый при промышленном фракционировании плазмы крови на холоде спиртовым методом Кона; способ прост в осуществлении, не требует дорогостоящих реактивов, ферментов, сорбентов для хроматографии.

Очищенный С3d фрагмент С3 компонента комплемента может быть использован:
1) как иммуноген для гипериммунизации животных с целью получения моноспецифической анти-С3d преципитирующей сыворотки;
2) для удаления нежелательных анти-С3d антител из поливалентных сывороток;
3) для определения титров анти-С3d преципитирующих сывороток методом РИД по Манчини (см. чертеж).

Изобретение относится к медицине, в частности к иммунохимии, и может быть использовано в диагностике заболеваний, связанных с активацией системы комплемента. Цель изобретения - упрощение и удешевление способа выделения С3d фрагмента С3 компонента комплимента, а также утилизация отходов промышленного фракционирования плазмы. Спиртовый осадок IV-I по Кону осаждают 15%-ным поли-(этиленгликолем) м.м. 4000 - 6000. Из образовавшегося супернатанта выделяют С3d фрагмент С3 компонента комплимента путем 2 последовательных хроматографий: инонообменной на ДЕАЕ-Тоyopearl и гель-фильтрации на сефакриле S-200. Предлагаемый способ выделения C3d фрагмента С3 компонента комплемента прост в осуществлении, не требует ценной донорской плазмы, т. к. в качестве источника С3d используется бросовый осадок IV-I, получаемый при промышленном фракционировании плазмы крови по Кону; не требует дорогостоящих реактивов, сорбентов для хроматографий. 1 ил.

Способ выделения фрагмента СЗd компонента СЗ комплемента человека, отличающийся тем, что в качестве сырья используют осадок IV-I от промышленного фракционирования плазмы крови на холоду спиртовым методом Кона путем растворения указанного осадка в буфере высокой ионной силы, осаждения полиэтиленгликолем 4000-6000 D с последующей ионообменной хроматографией супернатанта на ДЭАЭ-анионообменнике и гель-фильтрацией.