СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ C - КОМПОНЕНТА КОМПЛЕМЕНТА ЧЕЛОВЕКА Российский патент 1995 года по МПК G01N33/531 

Изобретение относится к медицине, в частности к биохимии и иммунохимии, и может быть использовано в диагностике заболеваний, связанных с активацией системы комплемента: болезней иммунных комплексов, инфекционных заболеваний, респираторного дистресс-синдрома взрослых, наследственных дефицитов регуляторных белков системы комплемента.

Известно несколько способов выделения очищенного С₃ компонента комплемента человека. Например, широко используется способ выделения С₃ компонента комплемента из плазмы, предложенный R. A. Harrison и R. J. Lachmann в 1979 г. , включающий предварительную обработку свежей плазмы ингибиторами (ЭДТА, азидом натрия, фенилметилсульфонилфторидом) с целью предотвращения активации протеолитических ферментов плазмы крови и запуска каскада реакций при активации системы комплемента с последующим фракционированием плазмы гидросульфатом натрия до 20% и переосаждением образовавшегося осадка 11% сульфатом натрия. Супернатант от второго осаждения разделяют на псевдоглобулиновую и эуглобулиновую фракции при диализе в низкой ионной силе и слабокислом рН. С₃ компонент комплемента выделяют из осадка эуглобулинов путем ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе и хроматографии на гидроксил-апатите. Заканчивают выделение С₃ компонента комплемента диализом С₃-содержащих фракций против раствора ингибиторов (ЭДТА, NaN₃), ультрафильтрацией.

Прототипом получения высокоочищенного С₃ компонента комплемента является способ, описанный Tach. B. F. и Prahly. W. (1976 г.). Он включает: ступенчатое фракционирование свежей плазмы с поли-(этиленгликолем) м. м. 4000-6000, ряд последовательных хроматографических процедур (биоспецифическая хроматография на L-лизин-сефарозе 4В для удаления плазминогена, ионообменная хроматография на ДЭАЭ-целлюлозе, гель-фильтрация на сефарозе СL-6В, хроматография на гидроксилапатите) с контролем гемолитической активности на каждой стадии. Способ многостадиен, трудоемок, в нем исползуются дорогостоящие реактивы, сорбенты для хроматографий.

Целью настоящего изобретения является упрощение и удешевление способа выделения С₃ компонента комплемента человека, что особенно важно для диагностических препаратов, а также утилизация отходов промышленного фракционирования плазмы.

Цель достигается тем, что С₃ компонент комплемента выделяют всего в 3 основные стадии, используя в качестве источника С₃ компонента бросовый осадок IV-I по Кону. По данным Cohnetal. (1946 г.) в осадке IV-I, получаемом при фракционировании плазмы крови на холоду, содержатся компоненты комплемента.

Первой стадией выделения С₃ из осадка IY-I является осаждение 20% осадка IV-I, растворенного в 0,1 М К-Р, рН 7,1-7,3, 10 мМ ЭДТА, 0,5 М NaCl поли-(этиленгликолем) 4000-6000. 32% ПЭГ 4000-6000 добавляют в 20%-ный раствор осадка IV-I до конечной концентрации 16% ПЭГ 4000-6000 при перемешивании. Образовавшийся осадок отделяют центрифугированием в течение 20 мин при 6000 об/мин, 4^оС. Осадок служит источником для выделения С₃ компонента комплемента. На второй стадии осадок растворяют в 0,01 М К-Р, рН 7,5, 10 мМ ЭДТА и хроматографируют на колонке с ДЕАЕ-Тоyopear I, уравновешенной тем же буфером, для элюции связавшегося белка, используя линейный градиент концентрации NaCl 0-0,3 М. Идентификацию фракций, содержащих С₃, проводят иммунохимически. Далее сконцентрированный с помощью ультрафильтрации на мембране РМ-30 компонент С₃ дополнительно очищают гель-фильтрацией на сефакриле S-200 в 0,01 М К-Р, рН 7,5, 10 мМ ЭДТА, 0,15 М NaCl, 0,02% NaN₃.

Предлагаемый способ очистки С₃ компонента комплемента из бросового осадка IV-I по Кону имеет преимущества перед прототипом, так как способ не требует дорогостоящих реактивов, прост в осуществлении, имеет всего 3 основных стадии: I - осаждение ПЭГ 4000-6000;
2 - ДЭАЭ-хроматография;
3 - гель-фильтрация.

Очищенный С₃ компонент комплемента может быть использован: 1) как иммуноген для гипериммунозации животных с целью получения моноспецифической анти-С₃ преципитирующей сыворотки; 2) для удаления нежелательных анти-С₃ антител из поливалентных сывороток; 3) для определения титров анти-С₃ преципитирующих сывороток методом РИД по Манчини.

Изобретение относится к медицине, в частности к биохимии и иммунохимии, и может быть использовано в диагностике заболеваний, связанных с активацией системы комплемента. Сущность изобретения заключается в том, что спиртовой осадок IУ - I по Кону осаждают 16%-ным поли- (этиленгликолем) м.м. 4000 - 6000. Из образовавшегося осадка выделяют C₃ компонент комплемента, применяя ионообменную хроматографию на ДЕАЕ-Тоуореа 1 и гельфильтрацию на сефакриле S-200. Предлагаемый способ очистки C₃ компонента комплемента человека из осадка IУ - I по Кону имеет преимущества перед прототипом, так как способ не требует дорогостоящих реактивов, исходного сырья, прост в осуществлении. Преимущества изобретения - упрощение и удешевление способа выделения C₃ компонента комплемента, утилизация отходов промышленного фракционирования плазмы.

СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ C₃ -КОМПОНЕНТА КОМПЛЕМЕНТА ЧЕЛОВЕКА, включающий обработку сырья на основе крови человека с помощью ПЭГ 4000-6000, центрифугирование с последующими очисткой осадка на ДЭАЭ-анионообменнике и гель-фильтрацией, отличающийся тем, что в качестве сырья используют осадок IV - I фракционирования плазмы крови по Кону, перед обработкой ПЭГ его растворяют в буферном растворе высокой ионной силы при нейтральном рН, а гель-фильтрацию проводят с помощью сефекрила S - 200.