СПОСОБ СТИМУЛЯЦИИ ЛЕЙКОПОЭЗА Российский патент 1997 года по МПК A61K38/16 A61K35/60 

Изобретение относится к медицине и в частности, к онкологии и может быть использовано для стимуляции лейкопоэза при миелодепрессии, вызванной цитостатической терапией.

Известно, что цитостатическая терапия, составляющая основу лекарственного лечения при опухолях, вызывает угнетение гемопоэза даже в терапевтических дозах /5/. При этом токсическая миелодепрессия регистрируется в периферической крови как лейкопения, тромбоцитопения и далее анемия /2/. Предупреждение этого осложнения осуществляется за счет коррекции доз цитостатиков и назначения средств, стимулирующих лейкопоэз. Известно использование с этой целью спленина, лейкогена, пентоксила, зимозана, витаминов различных групп /3/. В процессе поиска новых биологически активных материалов было выявлено лейкостимулирующее действие нуклеиновых кислот /1, 4/. Так известен способ стимуляции лейкопоэза, включающий введение препарата гомологичной дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК), полученной из тимуса и селезенки крыс /6/. Однако этот способ обладает рядом недостатков, наиболее существенными из них являются медленное развитие лейкоцитарной реакции и отсутствие стимуляции костно-мозгового кроветворения.

Сущность изобретения состоит в том, что впервые в рамках заявленного способа стимуляцию лейкопоэза осуществляют за счет натриевой соли ДНК, полученной из молок осетровых рыб, при этом введение препарата проводят одно-, трех- или пятикратно подкожно в эквитерапевтических дозах.

Существенными признаками предложения следует считать использование натриевой соли ДНК, полученной из молок осетровых рыб, ранее по данным показаниям не применявшейся, а также разработку режимов введения препарата.

Для получения натриевой соли ДНК проводят гомогенизацию молок осетра в водном растворе натрия хлорида и натрия цитрата, промывание материала, смешивание с детергентом, отделение и обогащение жидкой фракции, отмывание в пермеате, выделение очищенного биоактивного материала.

Соль ДНК, полученная в результате описанного процесса, имеет следующие свойства. Это белый порошок, содержащий не менее 80% по весу натриевой соли нативной, низкомолекулярной, низкополимерной ДНК, полученной из молок осетра, не более 1% по весу белков, не более 17% по весу влаги, остальное натрия хлорид.

ДНК, полученная из молок осетра, имеет следующий состав нуклеотидов:
Нуклеотид Мольный продукт
аденин 29,0
тимин 27,0
гуанин 22,0
цитозин 20,0
Натриевая соль ДНК имеет молекулярный вес 270 500•10³ дальтон и гиперхромный эффект не менее 37%
Для раскрытия сущности изобретения ниже приведены результаты экспериментальных исследований по стимуляции лейкопоэза препаратом ДНК в условиях лейкоцитопении, вызванной цитостатиками.

В первой серии экспериментов исследования проведены на собаках породы "английский бигль" весом 11,5 15,6 кг. Аплазию кроветворной ткани вызывали пероральным введением миелосана в дозе 15 мг/кг однократно на сутки "0" опыта. Натриевую соль ДНК вводили подкожно в разовых дозах 10 мг/кг и 25 мг/кг двукратно на 3 и 7 сутки после введения миелосана. Суммарные дозы ДНК составили, соответственно, 20 мг/кг и 50 мг/кг. Собаки контрольной группы получали по 10 мл физиологического раствора подкожно в те же сроки. На 3, 7, 14, 21, 28, 42 и 49 сутки опыта определяли количество лейкоцитов в периферической крови и содержание кариоцитов костного мозга в стернальных пунктатах.

Результаты экспериментов представлены в таблице 1.

Как видно из представленных результатов, введение миелосана вызвало резкое падение содержания лейкоцитов в периферической крови и кариоцитов в костном мозге. В контрольной группе содержание лейкоцитов и кариоцитов у животных оставалось низким до 28 суток опыта и начинало постепенно восстанавливаться, начиная с 42 суток, однако до конца наблюдения на 49 сутки не достигало исходного уровня.

Введение натриевой соли ДНК существенно меняло картину токсического действия цитостатика и способствовало более быстрому восстановлению содержания костномозговых клеток и лейкоцитов. Так, в обеих группах при введении натриевой соли ДНК в суммарных дозах 20 и 50 мг/кг наблюдалась менее глубокая лейкоцитопения.

Тенденция к восстановлению количества лейкоцитов периферической крови отмечалось уже с 21 суток опыта, а к концу наблюдения уровень лейкоцитов практически достигал исходного. Аналогичная картина наблюдалась и в восстановлении содержания кариоцитов костного мозга.

Таким образом, в данной серии экспериментов на собаках было показано, что натриевая соль ДНК в суммарной дозе 20 мг/кг и наиболее отчетливо в дозе 50 мг/кг способствует ускоренному восстановлению показателей кроветворения при угнетении гемопоэза, вызванном цитостатиком миелосаном.

Вторая серия экспериментов была проведена на мышах гибридах F₁(CBAXC₅₇Bl) самцах массой 18 20 г. Цитопению вызывали путем введения циклофосфана внутрибрюшинно однократно в дозах 200 и 275 мг/кг. Натриевую соль ДНК вводили подкожно однократно в дозах 150 и 30 мг/кг, а также на 3, 5, 7 сутки после введения циклофосфана. На 1, 3, 5, 7, 10, 12, 14, 17, 21 и 25 сутки определяли общее количество лейкоцитов в периферической крови с использованием камеры Горяева. Результаты эксперимента представлены в таблице 2.

Как видно из результатов, представленных в таблице 2, максимальный цитопенический эффект при введении циклофосфана развивается к 3 суткам, восстановление количества клеток отмечается к 7 9 суткам. Однако на 12 13 сутки наблюдается второе, менее глубокое снижение количества лейкоцитов. При введении ДНК в дозе 150 мк/кг на 3, 5 и 7 сутки достигается максимальный стимулирующий эффект. Причем через 2 3 дня после первой инъекции ДНК количество клеток возвращается к фоновому уровню до введения миелосана, а к 7 10 суткам количество клеток достигает максимальной величины, превышающей этот уровень. Важно отметить, что в отличие от других гемокорректоров, ДНК не вызывает компенсаторного падения количества клеток после гемостимуляции.

В целом анализ экспериментальных материалов позволяет сделать следующие выводы: 1. в отличие от прототипа при использовании заявленного способа осуществляется быстрое восстановление количества лейкоцитов в периферической крови и увеличение количества кариоцитов в костном мозге; 2. для получения стимулирующего эффекта достаточно одной инъекции препарата ДНК. Наилучший эффект достигается при трех- или пятикратном применении препарата с интервалом 48 часов; 3. заявленный способ в отличие от прототипа не вызывает компенсаторного уменьшения количества клеток после гемостимуляции; 4. при использовании способа не выявлено побочных явлений и осложнений.

Пример N1. Эксперимент проведен на 9 собаках породы "Английский бигль" (6 самцов и 3 самки) массой 11,5 15,6 кг. Аплазию кроветворной ткани вызывали пероральным введением миелосана в дозе 15 мг/кг однократно. Натриевую соль ДНК вводили подкожно двукратно на 3 и 7 сутки в разовых дозах 10 мг/кг и 25 мг/кг после введения миелосана. Суммарные курсовые дозы ДНК составили 20 мг/кг и 50 мг/кг. Животные контрольной группы получали по 10 мл физиологического раствора подкожно в те же сроки. Количество лейкоцитов (в тыс. на 1 мм³ крови) по дням исследования у одного экспериментального животного составили: при введении ДНК в суммарной дозе 20 мг/кг на 3 день 11,2; на 7 день 5,9; на 14 день 3,9; на 21 день 3,1; на 28 день 3,9; на 42 день 6,9; на 49 день 9,9; при введении ДНК в суммарной дозе 50 мг/кг на 3 день 9,6; на 7 день 6,9; на 14 день 4,3; на 21 день 4,5; на 28 день 5,95; на 42 день 8,95; на 49 день 10,95.

Количество кариоцитов в стернальном пунктате (в тыс. на мм³ пунктата) у одного экспериментального животного составили: при введении ДНК в суммарной дозе 20 мг/кг на 3 день 51,0; на 7 день 7,2; на 14 день 10,8; на 21 день 12,9; на 28 день 13,3; на 42 день 25,5; на 49 день 32,1; при введении ДНК в суммарной дозе 50 мг/кг на 3 день 48,5; на 7 день 11,2; на 14 день 12,3; на 21 день 13,7; на 42 день 27,4; на 49 день 44,7.

Таким образом, представленный пример иллюстрирует восстановление количества лейкоцитов в периферической крови и клеток костного мозга при введении натриевой соли ДНК в заявленном режиме.

Пример N2. Эксперимент проведен на 50 мышах гибридах F₁(CBAXC₅₇Bl₆), самцах массой 18 20 г. Цитопению вызывали путем введения циклофосфана внутрибрюшинно однократно в дозе 200 мг/кг. Натриевую соль ДНК вводили в двух схемах: однократно в дозах 30 и 150 мг/кг через 3 суток после цитостатика и 3-х кратно с интервалом 48 часов в разовой дозе 150 мг/кг, начиная с 3 суток после цитостатика. Суммарная доза в последнем случае составила 450 мг/кг.

Таким образом, представленный пример иллюстрирует стимуляцию лейкопоэза при введении натриевой соли ДНК на модели цитопении, полученной под действием цитостатиков.

Сравнение результатов проведенных исследований с литературными данными по изучаемому вопросу позволило охарактеризовать заявленный способ следующим образом (см. табл. 3).

В целом следует отметить, что заявленный способ по сравнению с известными по уровню техники обладает следующими преимуществами: 1. при использовании способа осуществляется не только быстрое восстановление количества лейкоцитов в периферийной крови, но и увеличение количества кариоцитов костного мозга, что практически не встречается у аналогов и прототипа; 2. в отличие от других препаратов ДНК, способ не вызывает мутагенных изменений в организме; 3. способ не вызывает компенсаторного падения количества клеток после гемостимуляции.

Таким образом, заявленный способ значительно расширяет арсенал методов коррекции лейкопоэза при лейкоцитопении, вызванной цитостатиками и, по-видимому, найдет широкое применение не только в онкологии, но и радиационной медицине, медицине экстремальных состояний.

Использование: в области медицины и, в частности, в онкологии и может применяться при миелодепрессии, вызванной цитостатической терапией. Сущность изобретения: осуществляют однократное подкожное введение экзогенной ДНК, полученной из молок осетровых рыб, в виде порошка низкополимерной, содержащей не менее 80% нативной натриевой соли ДНК с молекулярной массой 270 - 500•10³Д при мольных соотношениях нуклеотидов: аденин - 29.0, тимин - 27.0, гуанин - 22,0, цитозин - 20.0. Способ не вызывает осложнений и одновременно стимулирует костномозговое кроветворение.

Способ стимуляции лейкопоэза, включающий введение ДНК, отличающийся тем, что в качестве ДНК используют экзогенную ДНК, полученную из молок осетровых рыб, в виде порошка низкополимерной, содержащей не менее 80% нативной натриевой соли, ДНК с молекулярной массой 270 500•10³Д, при мольных соотношениях нуклеотидов аденин 29,0, тимин 27,0, гуанин 22,0, цитозин 20,0, а введение препарата осуществляют однократно, 2 3 раза через 48 ч или 5 раз через 24 ч подкожно в эквитерапевтических дозах.