ЛИПОСОМНЫЙ ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИЙ ПРЕПАРАТ И ЛЕЧЕБНО-ПРОФИЛАКТИЧЕСКИЙ КРЕМ НА ЕГО ОСНОВЕ Российский патент 1998 года по МПК A61K9/127 A61K35/60 C07H21/04 

Изобретение относится к медицине, а именно к фармакологии и терапии, и касается использования липосом для направленного транспорта лекарственных средств.

Изучение липосом в последние годы показало преимущества липосомального транспорта лекарственных препаратов, заключающихся в предохранении включенного вещества от агрессивной среды организма, в возможности снижения лечебной дозы, уменьшение побочного и токсического действия [2, 4, 7].

Известно включение в липосомы лекарственных веществ различных фармакологических групп - противоопухолевых препаратов [14], антидиабетических [15] , кардиологических [11], противомикробных средств [13].

Широко используются в косметологии кремы, содержащие липосомы. Они запатентованы ведущими косметическими фирмами [16 - 18]. Такие кремы стимулируют трансдермальный транспорт, однако лечебно-профилактическая активность их невелика.

Известно включение в липосомы плазмидной ДНК pGA 293. Однако такая липосома не может быть рассмотрена в качестве перспективного лечебного препарата в связи с наличием мутагенной активности [3].

В настоящее время известны липосомные фармацевтические препараты, содержащие ДНК, которые используются как с лечебной целью [18], так и в косметологии [19], выбраны в качестве наиболее близких аналогов. Однако используемая в известных решениях высокополимерная ДНК не обладает высокой биологической активностью и предполагает дополнительное введение в фармацевтическую композицию либо витаминов, либо других добавок, усиливающих лечебный эффект.

Сущность изобретения состоит в том, что предложен фармацевтический препарат, содержащий ДНК, включенную в липосому, причем используют низкомолекулярную ДНК, полученную из молок осетровых рыб со следующими характеристиками:
Молекулярная масса - 66 - 400 КД
Гипохромный эффект (G) - 30 - 46%
при этом каждая липосома содержит (мкг):
Липидов - 300 - 500
ДНК - 10 - 12
Созданный на основе липосомального препарата лечебно-профилактический крем, содержит ДНК, заключенную в липосомы с характеристиками, указанными выше, а также адекватную основу при следующих соотношениях компонентов (в мас.%), липосомы, содержащие:
ДНК - 0,15-2,5
Основа - до 100,0
Существенными признаками предложения следует считать введение в состав липосомы ДНК с определенными характеристиками, а также качественный и количественный состав крема на основе липосом с ДНК.

Получение липосом с ДНК осуществляют следующим образом: 15 - 20 мг смеси кардиолипина и лецитина в весовых соотношениях 1 : 1 растворяют в 10 мл диэтилового эфира. Раствор липидов вспрыскивают при 60^oC с постоянной скоростью 0,2 - 0,3 мл/мин в 4 мл буфера /10 мМ HEPES, 100 мМ NaCl, pH 7,4, содержащего ДНК.

Для удаления следов эфира липидную суспензию продували азотом в течение 40 минут при 37^oC.

Использовали ДНК, выделенную из молок осетровых рыб известным способом (9) со следующими характеристиками:
молекулярная масса 66 - 500 КД
гипохромный эффект 30 - 46%
После формирования липосом суспензию обрабатывали ДНКазой (50 мг/мл) при 37^oC в течение получаса в присутствии 3 мМ MgSO₄. Липосомы с включенной ДНК выделяли посредством хроматографии суспензии на колонке с сефадексом G-50.

Оценку эффективности включения проводили с использованием фрагментов меченой бромистым этидием ДНК после ультразвуковой обработки. При этом включение ДНК в липосомы оценивали по отношению интенсивности флюоресценции исходной меченой ДНК и ДНК, связанной в липосомах после добавления к образцам 1% додецилсульфата.

Препарат липосом с включенной ДНК представляет собой гетерогенный по размерам набор везикул.

Для раскрытия сущности изобретения ниже приведены результаты экспериментально-клинических исследований по изучению фармацевтического препарата на основе ДНК, включенного в липосомы.

Была исследована острая и хроническая токсичность препарата, активность при цитопении, вызванной цитотоксической терапией, антивирусная и иммунотропная активность, а также активность при наружном использовании в составе кремовой композиции в качестве косметического и лечебного крема.

1. Изучение токсичности липосомного препарата в условиях острого и хронического эксперимента
Заявленный препарат оценивали по методике Гацуро [5] - изучали поведенческие реакции, нервно-мышечную возбудимость, вегетативные рефлексы в условиях острого и хронического введения. Препарат вводили внутрибрюшинно в эквитерапевтических дозах в объеме 0,5 - 1 мл. Наблюдения за животными осуществляли в течение 40 мин после введения препарата, регистрируя состояние каждые 10 мин. Оценка проводилась по восьмибалльной шкале.

Проверка поведенческих реакций в течение всего периода наблюдения показала наличие стандартной двигательной активности, возбудимости и реактивности в пределах нормы. Ориентировочные рефлексы без изменений.

Тремора, судорог, нарушений походки и изменений тонуса мускулатуры не выявлено. Рефлексы: роговичный, зрачковый, частота дыханий и сердечных сокращений - в пределах физиологической нормы.

При изучении хронической токсичности препарат вводили животным в течение 21 дня с последующим паталогоанатомическим изучением внутренних органов (окраска гематоксилин-эозин и судан III).

При осмотре органы нормального кровенаполнения. Кровоизлияний в органы не выявлено. Вес печени в пределах нормы. Признаков интоксикации печени, т. е. атрофию, вакуолизацию клеток, полиморфизм, пикноз не обнаружен.

Таким образом, представленные данные свидетельствуют о нетоксичности заявленного препарата.

2. Изучение влияния липосомного препарата ДНК на лейкоцитопению, вызванную цитостатиками
В опытах на собаках породы "английский бигль" весом 11,0 - 15,0 кг аплазию кроветворной ткани вызывали пероральным введением миелосана в дозе 15 мг/кг однократно. Изучаемый препарат вводили внутрибрюшинно на 3 сут после введения миелосана. Собаки контрольной группы получали по 10 мл физиологического раствора подкожно в те же сроки. На 3, 7, 14, 21, 28, 42 и 49 сут опыта определяли количество лейкоцитов периферической крови и содержание кариоцентов костного мозга в стернальных пунктатах.

Во второй серии экспериментов на мышах-гибридах F₁ (CBA x CBE) массой 18 - 20 грамм, цитопению вызывали введением циклофосфана в/бр однократно в дозах 200 и 275 мг/кг Заявленный препарат вводили на 3,5 сут после введения циклофосфана. На 1, 3, 5, 7, 10, 14, 17, 21 и 25 сут определяли общее количество лейкоцитов периферической крови с использованием камеры Горяева.

Результаты исследований представлены в таблице 1. Для сравнения представлены данные, полученные при введении ДНК, при той же постановке эксперимента.

Таким образом, из представленных данных следует, что липосомальная форма ДНК обладает гораздо более выраженной гемостимулирующей активностью, чем стандартный раствор ДНК.

3. Изучение иммунотропного действия липосомального препарата ДНК
3.1. Влияние на аллергические реакции замедленного типа.

Исследовали влияние липосомального препарата ДНК на реакцию бласттрансформации лимфоцитов (РБЛ) спонтанную и ФГА-стимулированную при введении препарата кроликам однократно в эквитерапевтических дозах. Для получения культуры лимфоцитов использовали общепринятый метод, описанный М.М. Авербахом [1] . Забор крови у животных осуществляли через 5 - 6 дней. Термостатировали в течение 4 сут. Подсчет трансформированных клеток проводили в мазках под микроскопом и выражали величину РБЛ в % [6].

Результаты исследований представлены в таблице 2, из которой видно, что исследуемый препарат обладает иммуностимулирующим действием, он усиливает как спонтанную, так и ФГА-стимулированную РБЛ.

3.2. Влияние на аллергические реакции немедленного типа.

У морских свинок изучали показатели фагоцитоза на 3, 5, 10 день после введения изучаемого препарата в эквитерапевтической дозе при иммунизации Staph. aureus, как указано в методике [8].

В контрольной группе животных вводили физиологический раствор по той же схеме.

Результаты экспериментов представлены в таблице 3.

Из представленных данных следует, что заявленный препарат стимулирует фагоцитарные реакции. При этом возрастали все показатели фагоцитоза - фагоцитарная активность, фагоцитарный показатель и фагоцитарная емкость крови.

Тенденция сохранялась с 3 по 7 день. К 10 дню после введения препарата показатели снижались, что соответствует физиологической норме.

3.3. Влияние на иммунитет при СПИДе.

У больных СПИДом исследовали иммунологические показатели (T хелперы, T супрессоры и их соотношение) при введении заявленного препарата в терапевтических дозах.

Результаты исследований представлены в таблице 4, из которой видно, что введение заявленного препарата способствует увеличению количества T-хелперов, уменьшению T-супрессоров и нормализации соотношения Tx/Tc, что имеет положительное прогностическое значение при СПИДе [12]. При соотношении Tx/Tc менее 0,4 вероятность гибели больного в течение одного года составляет 80%. В то же время, при увеличении этого показателя повышается вероятность выживания. В наших наблюдениях, после проведения курса лечения заявленным препаратом вероятность гибели больных в течение 1 года составила менее 15%.

4. Исследования по изучению лечебно-профилактической активности крема, содержащего ДНК, включенную в липосому:
4.1. Изучение противогерпетической активности заявленного крема.

На двух группах испытуемых с герпетической инфекцией губ исследовали действие заявленного крема по сравнению с препаратом завиракс противогерпетического действия [10]. В третьей группе больных лечения не проводили.

Заявленный крем наносили на область поражения 1 - 2 раза в день. Использовали крем с лечебной концентрацией липосом с ДНК (1,5 - 2,0%). Результаты исследований представлены в таблице 5, из которой видно, что заявленный крем обладает выраженной клинической эффективностью при герпетической инфекции губ. Важным критерием является снижение процента рецидивов заболевания при использовании заявленного крема.

4.2. Изучение противоожоговой активности заявленного крема.

Эксперименты проведены на крысах-самцах F₁ (AMCY x Wistar), массой тела 250 - 270 граммов. Каждая группа насчитывала 10 животных. Крыс наркотизировали внутрибрюшинным введением тиопентала в дозе 60 мг/кг однократно. Для получения ожога на предварительно эпилированный участок кожи лопаточной области, размерами 3 x 3 см, накладывали четырехслойную медицинскую марлю, размером 1 см², предварительно смоченную дистиллированной водой, и прижимали нагретый термоэлектрод площадью 1 см²/с температурой нагрева 200^oC.

Степень ожога дозировали временем экспозиции электрода, которое составляло от 3 до 15 сек. Подопытных животных наблюдали в течение 1 недели. У забитых животных гистологически исследовали место нанесения ожога с подлежащими тканями. Оценку проводили с помощью световой микроскопии.

После нанесения ожога животные были разделены на три группы. В первой группе - контрольной - прослеживали процессы естественного заживления ожога. Животным второй группы обрабатывали ожоговую рану 1,5%-ным раствором ДНК. В третьей группе на рану наносили заявленный крем. Результаты исследований представлены в таблице 6.

Таким образом, из представленной таблицы следует, что заявленный крем ускоряет заживление ожоговой раны, при этом заживление происходит без образования грубой рубцовой ткани.

4.3. Изучение ранозаживляющей активности заявленного крема при лучевых реакциях.

На группе онкологических больных с лучевыми реакциями различной степени изучали действие заявленного крема на процессы заживления.

Крем наносили 2-3 раза в день в течение 5-7 дней после окончания лучевой терапии или в процессе проведения лучевой терапии.

Результаты исследований представлены в таблице 7, из которой следует, что использование заявленного крема в процессе, а также после химиолучевой терапии дает возможность снизить процент лучевых реакций.

Во всех случаях использования крема не требовалось отмены лучевой терапии или коррекции лучевой нагрузки.

При использовании заявленного фармацевтического препарата в виде биологически активной добавки для лечебно-профилактических кремов, получение его осуществляют следующим образом.

Для приготовления водной фазы триэтаноламин, воду и глицерин нагревают до 75-80^oC.

Для приготовления жировой фазы ланолин безводный, моноглицериды дистиллированные, стеарин косметический, масло парфюмерное и воск эмульсионный нагревают до 80-85^oC. Далее смешивают жировую и водную фазы. При определенных условиях (температура, pH среды) в кремовую массу добавляют липосомы и консервант. Полученный крем представляет собой эмульсию белого или светло-кремового цвета с приятным запахом.

5. В экспериментально-клинических исследованиях была изучена токсичность крема, его косметические и лечебно-профилактические свойства.

5.1. Изучение токсичности заявленного крема.

В эксперименте на животных изучена подострая токсичность с морфологическим контролем структуры кожи и внутренних органов, раздражающее и аллергизирующее действие крема (с морфологическим контролем). Эксперименты проведены на 30 половозрелых морских свинках-самцах, альбиносах весом 250-300 г, находящихся на стандартном рационе вивария. Крем наносили ежедневно, однократно в течение 21 дня на заранее депилированные участки кожи. Контролем служили интактные животные и получавшие основу крема. При экспериментальном изучении использовали следующие методики: подострая токсичность, как описано Гацуро, раздражающее и аллергизирующее действие по методу Иевлевой, изучение морфологической структуры кожи и внутренних органов с помощью окраски срезов гематоксилин-эозином и печени-суданом III.

На протяжении всего срока применения косметического средства проводилась визуальная оценка действия препарата, с учетом общего состояния кожи и шерсти испытуемых животных, а также общего состояния поведения и привес массы тела по сравнению с контролем.

В результате проведенных исследований установлено, что при длительном нанесении крема не отмечалось патологических изменений в поведении, двигательной активности, аппетите, прибавке веса, состоянии кожи и шерсти подопытных животных. Не отмечено также патологических изменений при макро- и микроскопическом изучении структуры кожи и внутренних органов.

5.2. Изучение влияния заявленного крема на состояние кожи.

Использовались биохимические тесты, характеризующие функциональное состояние кожи, количественное определение суммарных липидов по методу Хуэрго, общих и растворимых белков микробиуретовым методом по Бейли, концентрацию ДНК кожи по Шмидту и Тангаузеру, проницаемость через кожный барьер с помощью меченой ДНК C₁₄ тимидином, определение фотозащитного действия путем изучения светопоглощающих свойств препарата с помощью спектрофотометра.

Антиоксидантная активность крема изучалась методом регистрации хемолюминисценции на моделях прекисного окисления липидов. Достоверность полученных результатов подтверждалась статически с использованием критерия Стьюдента.

Клинические испытания проведены на 30 здоровых женщинах в возрасте от 30 до 60 лет с сухим, увядающим и нормальным типом кожи. При осмотре отмечалась сухость кожи, шелушение, дряблость, снижение тургора - то есть признаки преждевременного старения кожи, у некоторых пациенток были выявлены элементы воспаления - краснота, отечность.

С целью выявления индивидуальной чувствительности к крему, длительному его использованию предшествовали лоскутные пробы закрытым путем на 24 ч. В случае отрицательной лоскутной пробы, крем затем применяли в течение 21 дня на кожу лица и шеи, накладывая тонким слоем 1 раз в сутки, ежедневно на 30-40 мин. Остатки крема снимали бумажной салфеткой. При клинических испытаниях крема отмечали его влияние на цвет кожи, наличие морщин, жирность и сосудистые реакции. Эластичность кожи определяли с помощью эластомера, гидрататность с помощью влагометра фирмы "Tecom".

Результаты исследований представлены в таблице 8. В таблице, в качестве сравнения даны результаты по использованию крема, содержащего ДНК, не связанную с липосомами.

Из представленной таблицы видно, что крем, содержащий липосомы с ДНК обладает более сильным влиянием на биохимические показатели кожи. Он увеличивает содержание водорастворимых белков, ДНК и липидов в коже в большей степени, чем крем, содержащий ДНК, не связанную с липосомами.

В результате клинических испытаний заявленного крема было выявлено снижение количества морщин, повысилась эластичность кожи. При осмотре выявлено улучшение тургора и цвета кожи.

Сущность изобретения иллюстрируется следующими примерами.

Пример N 1. 15-20 мг смеси кардиолипина и лецитина в весовых соотношениях 1: 1 растворяют в 10 мл диэтилового эфира. Раствор липидов впрыскивают при 60^oC с постоянной скоростью 0,2-0,3 мл/мин в 4 мл буфера/10 мМ HEPES, 100 мМ NaCl, pH 7,4, содержащего ДНК. Для удаления следов эфира липидную суспензию продували азотом в течение 40 мин при 37^oC.

Использовали ДНК, выделенную из молок осетровых рыб известным способом [9] со следующими характеристиками: молекулярная масса 300-500 кД, гипохромный эффект 30-46%.

После формирования липосом суспензию обрабатывали ДНКазой 50 мг/мл при 37^oC в течение получаса в присутствии 3 мМ MgSO₄. Липосомы с включенной ДНК выделяли посредством хромотографии суспензии на колонке с сефадексом C-50.

Оценку эффективности включения проводили с использованием фрагментов меченой бромистым этидием ДНК после ультразвуковой обработки. При этом включение ДНК в липосомы оценивали по отношению интенсивности флюоресценции исходной меченой ДНК и ДНК, связанной в липосомах после добавления к образцам 1%-ного додецилсульфата.

Препарат липосом с включенной ДНК представляет собой гетерогенный по размерам набор возикул.

Полученный препарат в условиях острого и хронического эксперимента не проявил токсичности в широком диапазоне доз. На модели цитопении, вызванной введением миелосана, использование полученного препарата липосомальной ДНК увеличивало количество лейкоцитов с 10,9 тыс на 1 мм³ крови (на 3 сут после введения миелосана) до 17,9 (на 7 сут).

Исследование иммунологических показателей показало, что заявленное средство стимулирует реакции гуморального и клеточного иммунитета. Реакция бласттрансформации лимфоцитов возрастала с 0,18 до 9,1 (спонтанная) и с 4,0 до 27,9 (ФГА-стимулированная). Увеличивались показатели гуморального иммунитета - фагоцитная активность, фагоцитарный показатель, фагоцитарная емкость крови.

Пример N 2. Для приготовления крема сначала готовят водную и жировую фазы.

Для приготовления водной фазы 0,2 триэтаноламина, воду и 2,5 глицерина нагревают до 75-80^oC. Для приготовления жировой фазы 0,5 ланолина безводного, 2,5 моноглицеридов дистиллированных, 0,7 стеарина косметического, 1,5 масла парфюмерного и 1,5 воска эмульсионного нагревают до 80-85^oC. Далее смешивают жировую и водную фазы. При остывании смеси добавляют 0,15 липосом, 0,5 консерванта и 0,1 отдушки. Полученный крем представляет собой эмульсию белого или светло-кремового цвета с приятным запахом.

В эксперименте показано, что крем не обладает токсичностью.

В клинических испытаниях на женщинах с сухим увядающим типом кожи выявлено положительное влияние на тургор кожи. Уменьшилось количество мелких морщин, исчезло покраснение и шелушение кожи.

Исследование в эксперименте биохимических показателей кожи показало увеличение в коже водорастворимых белков (с 1,52 до 3,88 мг%), ДНК (с 21,0 до 45,2 мг%) и липидов (с 373,0 до 691,0 мг%).

Во всех случаях применения крема аллергических реакций или иных побочных явлений выявлено не было.

Пример N 3. Для приготовления лечебного крема готовят водную и жировую фазы.

Для приготовления водной фазы 3,5 триэтаноламина, воду и 4,5 глицерина нагревают до 75-80^oC. Для приготовления жировой фазы 2,5 ланолина безводного, 4,5 моноглицеридов дистиллированных, 2,5 стеарина косметического, 4,5 масла парфюмерного и 2,5 воска эмульсионного нагревают до 80-85^oC. Далее смешивают жировую и водную фазы. При остывании смеси добавляют 2,5 липосом, 1,5 консерванта. Отдушку в лечебный крем, как правило, не добавляют. Полученный крем представляет собой эмульсию белого цвета.

Лечебную активность крема исследовали на больных с герпесом (herpes labialis). При использовании заявленного крема 1 раз в день в течение 1-2 дней процесс полностью купировался.

Изучение противоожоговой активности крема проведено на животных с экспериментальным ожогом. Заявленным кремом обрабатывали ожоговую поверхность 2 раза в день в течение 3-5 дней. Сроки эпителизации составляют 19-20 дней. Отмечали безрубцовые заживления.

На онкологических больных с лучевыми реакциями различной степени выраженности: эритематозный дерматит, сухой дерматит, буллезный дерматит, язвенный дерматит - изучали процессы заживления при использовании заявленного крема 2-3 раза в день в течение 5-7 дней. Отмечали снижение процента лучевых реакций в 2-10 раз. Появилась возможность не уменьшать лучевую нагрузку.

Во всех случаях использования крема не было выявлено аллергических или иных побочных явлений.

Таким образом, заявленный препарат обладает более выраженной фармакологической активностью, чем ДНК в форме раствора.

Лечебно-профилактический крем, полученный на основе липосом с ДНК может быть использован как косметический омолаживающий крем при увядающей коже лица и в то же время при повышенной концентрации биологически активной добавки его можно использовать для ускорения процессов заживления при ожогах, лучевых реакциях, а также при герпетической инфекции.

Все это дает основание полагать, что заявленное средство и лечебно-профилактический крем на его основе найдут широкое использование в медицине и косметологии.

Список литературы
1. Авербах М.М. Повышенная чувствительность замедленного типа и инфекционный процесс. М., 1974.

2. Баджинян С.А. Липосомы - модель клеточных мембран и новые аспекты их применения. Биол. ж. Армении, 1980, N 11, с. 2289-1194.

3. Билич К.М. и др. Некоторые ультраструктурные аспекты прямой инъекции липосом, содержащих плазмидную ДНК, в печени мыши. Биополимеры и клетки. 1990, т. 6, N 1, с. 73-82.

4. Брусокас В.И. и др. Липосомы - основа нового вида лек. форм. В кн.: Достижения фармакологической науки в практику здравоохранения. Каунас, 1985.

5. Гацуро В.В. Метод первичного фармакологического исследования биологически активных веществ. М., 1974.

6. Линг Н. Стимуляция лимфоцитов. (пер. с англ.) М., 1971.

7. Марголис Л. Б. Липосомы и их взаимодействие с клетками. М., Наука, 1986.

8. Методы изучения in vitro клеточного иммунитета (под ред. Б. Блума) М. , Медицина, 1974.

9. Реброва А.К., Аносова И.Г. Получение ДНК из молок осетровых рыб. Хим. -фарм. ж., 1982, N 7, с. 835-838.

10. Реестр лекарственных средств России. М. Инфармхим, 1993.

11. Торчилин В.Н. и др. Доклады АН СССР, 1979, N 3, с. 246.

12. Хаитов Р.М. Игнатьева Г.А. СПИД, М., 1992.

13. Gregoriadis G. Febs Zett. 1973, vol 36, p. 292-296.

14. Gregoriadis G. Eur J. Biochim, 1972, vol 24, p. 485-487.

15. Великобритания, патент N 2013009, кл. A 61 K 7/48.

16. Германия, патент N 2629100, кл. A 61 K 7/00.

17. Европейский патент, заявка N 0107559, кл. A 61 K 7/48.

18. US, 5352458, кл. A 61 K 9/127, 1994.

19. US, 5376379, кл. A 61 K 9/127, 1994.

Липосомный фармацевтический препарат, содержащий ДНК, обладает выраженной гемокоррегирующей и иммунотропной активностью, в том числе и при СПИДе, а лечебно-профилактический крем, содержащий липосомы, а также в качестве противоожогового и противогерпетического средства. 2 с.п. ф-лы, 8 табл.

1. Липосомный фармацевтический препарат, содержащий ДНК, отличающийся тем, что он содержит низкомолекулярную ДНК, полученную из молок осетровых рыб, имеющую мол. м. 66 - 400 кД, гипохромный эффект 30 - 46%, при этом каждая липосома содержит 300 - 500 мкг липидов и 10 - 12 мкг ДНК. 2. Лечебно-профилактический крем, содержащий липосомы, ДНК и общепринятую основу, отличающийся тем, что каждая липосома содержит 300 - 500 мкг липидов и 10 - 12 мкг ДНК, имеющую мол.м. 66 - 400 кД, гипохромный эффект 30 - 46%, при следующем соотношении компонентов, мас.%:
Липосомы, содержащие ДНК - 0,15 - 2,5
Основа - До 1000