ГЕМОСТИМУЛЯТОР Российский патент 1997 года по МПК A61K31/195 

Изобретение относится к медицине, конкретно к клинической гематологии, и может быть использовано для фармакологической коррекции нарушений со стороны костномозгового кроветворения, возникающих при действии на организм ионизирующей радиации, цитостатиков, а также на фоне гемолитической анемии.

Известны средства, стимулирующие регенерацию кроветворения. К ним относятся нуклеиновокислый натрий, пентоксил, метацил, лейкоген. В качестве неспецифических протекторов гемопоэза используются такие средства как зимозан, сплецин, витамины C, B₁, B₆. К гемостимуляторам нового поколения относятся интерлейкины, колониестимулирующие факторы, эритропоэтин. Имеются данные, указывающие на стимуляцию кроветворения солями лития. Гемопоэзиндуцирующим действием обладает ряд гормональных препаратов. Обнаружены гемостимулирующие свойства у гликозаминогликанов. Однако перечисленные выше препараты не нашли широкого применения в клинической практике, так как оказались либо малоэффективными, либо обнаруживали побочное токсическое действие.

Средства, способные избирательно стимулировать эритропоэз, отсутствуют. Предлагаемый аппарат не имеет адекватных аналогов среди стимуляторов гемопоэза, применяемых при гипопластических состояниях костного мозга.

Целью предлагаемого изобретения является стимуляция костно-мозгового кроветворения, подавленного действием миелоингибирующих факторов (ионизирующая радиация, цитостатики), а также на фоне фенилгидразиновой гемолитической анемии.

Поставленная цель достигается лекарственной композицией для стимуляции гемопоэза, содержащей байкалинат лизина (L-лизина-5,6,7-триокси-флавон-7-0-β-D-глюкоронидат), пропиленгликоль и дистиллированную воду при следующем соотношении компонентов, мас.

Байкалинат лизина 15-25
Пропиленгликоль 35-45
Вода дистиллированная Остальное
Отличие предлагаемого изобретения от известных решений заключается в том, что лекарственная композиция для стимуляции гемпоэза содержит байкалинат лизина (L-лизина-5,6,7-триокси-флавон-7-9-b-D-глюкоронидат), пропиленгликоль и дистиллированную воду при следующем соотношении компонентов, мас.

Байкалинат лизина 15-25
Пропиленгликоль 35-45
Вода дистиллированная Остальное
Гемостимулятоp является новым веществом и автоpы дают описание способа его получения. В качестве действующего сpедства оно содеpжит байкалинат лизин, котоpый получают следующим обpазом: байколинат и лизин смешивают в эквивалентном соотношении в воде (20% pаствоp). Затем добавляют 96% этиловый спиpт (для начала кpистализации) и из pаствоpа выделяют кpисталлы. Кpисталлы пpомывают 96% этиловым спиpтом и высушивают. Полученный поpошок используют в качестве действующего начала вместе с пpопиленгликолем и дистиллиpованной водой пpи соотношении компонентов: байкалинат лизин 15-20% пpопиленгликоль 35-45% дистиллиpованная вода остальное.

Впервые обнаружено, что предлагаемая лекарственная композиция обладает способностью стимулировать восстановление эритропоэза и, в меньшей степени, гранулоцитопоэза. Это позволяет получить неизвестный ранее положительный эффект, заключающийся в уменьшении повреждающего действия ионизирующей радиации, цитостатиков, гемолитического яда фенилгидразина на систему крови.

Свойство предлагаемой лекарственной композиции стимулировать эритропоэз и, в меньшей степени, гранулоцитопоэз, в литературе не описано. Конкретные механизмы действия на гемопоэтические клетки неизвестны.

Предлагаемое средство приготовляют следующим образом:
Пример 1. Берут 15 г байкалината лизина, 35 г пропиленгликоля и доводят до 100 мл дистиллированной водой.

Пример 2. Берут 20 г байкалината лизина, 30 г пропиленгликоля и доводят до 100 мл дистиллированной водой.

Пример 3. Берут 25 г байкалината лизина, 45 г пропиленгликоля и доводят до 100 мл дистиллированной водой.

Изменение содержания компонентов в меньшую или большую сторону резко ухудшает гемостимулирующие свойства предлагаемой композиции.

Исследования были проведены на 300 мышах линии СВА.

В первой серии экспериментов изучалось влияние предлагаемой композиции на процессы восстановления костно-мозгового кроветворения мышей, подвергнутых однократному тотальному облучению. Опыты проводились на 130-и мышах. Животных облучали на установке РУМ-17 в дозе 2,0 Гр (напряжение 200 кВ, сила тока 15 мА, фильтры: Cu 0,5 мм + AL 1,0 мм, фокусное расстояние 45 см, мощность дозы 0,062 Гр/мин). Предлагаемую композицию вводили внутривенно мышам опытной группы в дозе 50 мк/кг на 4, 5 и 6 сутки после облучения. Животные контрольной группы получали дозу, соответствующую дозе физиологического раствора. У животных интактной группы (здоровые мыши) излучали фоновые гематологические показатели. Мышей контрольной группы умерщвляли на 1 10 и 12 сутки опыта. Забой животных, получавших предлагаемую композицию, начинали с четырех суток. Результаты данной серии экспериментов представлены в табл. 1-7.

Во второй серии экспериментов изучали влияния предлагаемой композиции на процессы восстановления костно-мозгового кроветворения, подавленного цитостатиком. Опыты проводились на 70 мышах. Активность предлагаемой композиции оценивали на модели аплазии костно-мозгового кроветворения, вызванной однократным введением циклофосфана в МПД (250 мг/кг внутрибрюшинно). Эта группа животных служила контролем. У мышей опытной группы применяли предлагаемую композицию, начиная с трех суток после введения циклофосфана и продолжали в течение трех дней в дозе 50 мг/кг внутривенно. Животных забивали на 4, 5, 6 и 8 сутки после введения цитостатика. Результаты данной серии экспериментов представлены в табл. 8-10.

В третьей серии экспериментов изучали влияние предлагаемой композиции на показатели системы крови у мышей с фенилгидрозиновой гемолитической анемией. Эксперименты проведены на 100 мышах. Моделирование гемолитической анемии осуществляли путем однократного введения фенилгидразина в дозе 50 мг/кг (контрольная группа животных). Мыши опытной группы, начиная с первого дня эксперимента, ежедневно получали предлагаемую композицию внутривенно в дозе 50 мг/кг. Результаты данной серии эксперимента представлены в табл. 11-12.

Определение гемолитических показателей осуществляли стандартными методами. Методом клонирования ин витро в метилцеллюлозе определяли содержание в костно-мозговой ткани гранулоцитарно-макрофагальных (КОЕ-ГМ) и эритродных (КОЕ-Э) прекурсоров. Тестирование колониестимулирующей (КСА) и эритропоэтической (ЭПА) активностей производили по известному методу.

Результаты были подвергнуты статистической обработке с применением критерия Стьюдента.

Проведенные эксперименты показали, что применение предлагаемой композиции у облученных мышей оказывало стимулирующее влияние на костно-мозговое кроветворение. Так, на четвертые сутки после курсового воздействия общее количество миелокариоцитов в костном мозге животных достоверно превышало таковой показатель у контрольных мышей, не получавших композицию (12,3 ± 0,54 и 8,08 ± 0,47 соответственно, P < 0,05). В этот же срок в кроветворной ткани мышей, получавших предлагаемую композицию, выявлялись выраженная гиперплазия эритроидного ростка костного мозга (3,38 ± 0,30 - опыт и 1,32 ± 0,26 контроль, P < 0,05). Следует отметить, что одновременно наблюдалась стимуляция миелоидного ростка гемопоэза. Количество молодых и зрелых форм гранулоцитов, а также лимфоцитов, на четвертые сутки эксперимента было выше (P < 0,05) у животных, получавших предлагаемую композицию, к концу периода наблюдения (12 суток) общая клеточность мозга у опытных мышей достоверно превышала аналогичный показатель животных, подвергавшихся только облучению.

Стимуляция костно-мозгового кроветворения под влиянием предлагаемой композиции повлекла за собой соответствующие изменения со стороны показателей периферической крови. Наиболее характерным оказалось изменение содержания эритроцитов, количество которых, начиная с шести суток и до конца эксперимента (за исключением 10 суток) достоверно превышало таковое у контрольных мышей, не получавших композицию. Кроме того, в группе опытных животных на шестые сутки был отмечен ретикулоцитоз (23,5 ± 2,29% при 12,3 ± 1,5% в контроле, P < 0,05).

Более ранним и стабильным оказалось восстановление общего числа лейкоцитов в периферической крови животных, получавших предлагаемую композицию. Оно произошло на шестые сутки (седьмые в контроле) и сохранилось на уровне интактных животных до конца периода наблюдения, в отличие от контрольных мышей, у которых на 10 и 12 сутки было отмечено достоверное снижение лейкоцитов.

Принципиальное значение имеет тот факт, что введение предлагаемой композиции животным опытной группы сопровождалось активацией колониеобразования в постлучевой период. Наиболее выраженное стимулирующее действие предлагаемая композиция оказывала на предшественники типа КОЕ-Э. Число колоний, формирующихся из эритроидных прекурсоров от опытных животных на 4, 6, 7 и 8 сутки было значительно выше, чем в контрольной группе. Стимуляционный эффект композиции на колониеобразование из миелоидных предшественников типа КОЕ-ГМ оказался более слабым.

Эксперименты показали, что стимуляция эритропоэза под влиянием предлагаемой композиции была обусловлена не только активацией колониеобразования. Введение предлагаемой композиции облученным мышам способствовало усилению секреции костно-мозговыми клетками эритропоэтической активности (ЭПА) и, соответственно, повышало ее уровень в периферической крови. Аналогичный эффект предлагаемая композиция оказывала на продукцию и уровень содержания в периферической крови колониестимулирующей активности (КСА).

Таким образом, введение предлагаемой композиции облученным мышам активирует процесс регенерации костно-мозгового кроветворения. Стимулирующий эффект предлагаемой композиции проявляется в ранние сроки восстановительного периода (4-6 сутки) и характеризуется более высоким темпом нарастания общей клеточности костного мозга за счет повышения содержания клеточных элементов как белого, так и, особенно, красного ростков кроветворения. Активация предлагаемой композиции репаративных процессов в облученном костном мозге обусловлена усилением колониеобразующей активности клеток-предшественников типа КОЕ-Э и КОЕ-ГМ, а также увеличением продукции миелокарицитами ЭПА и КСА.

Применение предлагаемой композиции у мышей на фоне предварительного введения им циклофосфана в МПД привело к стимуляции процессов восстановления эритроидного ростка кроветворения, подавленного действием цитостатика. Так, на 4, 5, 6 и 8 сутки после инъекции циклофосфана количество эритроидных элементов в костно-мозговой полости бедра мышей, получавших предлагаемую композицию, достоверно превышало таковое у животных, получавших один цитостатик. Изучение колониеобразующей способности клеток костного мозга мышей, получавших циклофосфан и циклофосфан с последующим введением предлагаемой композиции, выявило стимуляцию эритроидного колониеобразования. В периферической крови значимых различий в изучаемых показателях между опытной и контрольной группами животных обнаружено не было.

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что применение предлагаемой композиции у мышей на фоне введения им циклофосфана в МПД позволяет нивелировать одно из побочных действий цитостатика подавление костно-мозгового эритропоэза.

На модели гемолитической анемии показана способность предлагаемой композиции ускорить восстановительные процессы в системе красной крови. Ежедневное применение предлагаемой композиции снижало у экспериментальных животных выраженность анемии.

Так, в указанной группе мышей достоверное уменьшение числа эритроцитов в периферической крови наступало лишь на третьи сутки опыта. На 2, 5, 6 и 8 сутки после введения фенилгидразина содержание гемоглобина в периферической крови животных, получавших инъекции предлагаемой композиции, оказалось достоверно выше такового у анемизированных мышей без коррекции. В то же время развитие ретикулоцитоза у животных при введении предлагаемой композиции отмечалось уже с первого дня опыта и было достоверно более выражено на третьи сутки, чем в группе анемизированных мышей, не получавших предлагаемую композицию. Ускоренное восстановление показателей системы красной крови под влиянием предлагаемой композиции подтверждалось также исследованием у них костно-мозгового кроветворения. Так, у мышей, получавших предлагаемую композицию, содержание эритроидных клеток в костном мозге достоверно превышало таковое у интактных (на 2-8 сутки) и анемизированных (на 2 и 6 сутки) животных. Таким образом, стимуляция эритрона под влиянием предлагаемой композиции оказалась более выраженной по сравнению с анемизированными животными, не получавшими предлагаемую композицию.

По-видимому, этим определялось и более раннее восстановление числа эритроцитов в периферической крови мышей, получавших предлагаемую композицию. На восьмые сутки после введения фенилгидразина в указанной экспериментальной группе животных содержание эритроцитов не отличалось достоверно от исходного.

Полученные в эксперименте данные свидетельствуют о том, что введение предлагаемой композиции мышам с гемолитической анемией уменьшало у них степень анемической реакции и способствовало более выраженной стимуляции эритроидного ростка с ускорением нормализации содержания эритроцитов в периферической крови. Изобретение иллюстрируется табл. 1-12.

В табл.3 приведена динамика содержания КОЕ-Э в костном мозге мышей линии СВА (х10⁶/бедро), подвергнутых однократному тотальному облучению в дозе 2,0 Гр и при трехкратном введении им предлагаемой композиции в дозе 50 мг/кг на 4, 5, 6 сутки после облучения (число колоний •10⁵ клеток костного мозга), X±m.

В табл.4 приведена динамика содержания КОЕ-ГМ в костном мозге мышей линии СВА, подвергнутых однократному тотальному облучению в дозе 2,0 Гр и при трехкратном введении им предлагаемой композиции в дозе 50 мг/кг на 4, 5, 6 сутки после облучения (число колоний •10⁵ клеток костного мозга); X±m.

В табл.5 приведена динамика продукции эритропоэтической активности (ЭПА) клетками костного мозга мышей линии СВА, подвергнутых однократному тотальному облучению в дозе 2,0 Гр и при трехкратном введении им предлагаемой композиции в дозе 50 мг/кг на 4, 5, 6 сутки после облучения (число колоний •10⁵ клеток костного мозга), X±m.

В табл. 6 приведена динамика продукции колониестимулирующей активности (КСА) клетками костного мозга мышей линии СВА, подвергнутых однократному тотальному облучению в дозе 2,0 Гр и при трехкратном введении им предлагаемой композиции в дозе 50 мг/кг на 4, 5, 6 сутки после облучения (число колоний •10⁵ клеток костного мозга), X±m.

В табл. 7 представлена динамика содержания эритропоэтической и колониестимулирующей активности в периферической крови мышей линии СВА, подвергнутых однократному тотальному облучению в дозе 2,0 Гр и при трехкратном введении им предлагаемой композиции в дозе 50 мг/кг на 4, 5, 6 сутки после облучения (число колоний •10⁵ клеток костного мозга), X±m.

В табл. 9 представлено содержание КОЕ-Э и КОЕ-М (число колоний •10⁵ клеток костного мозга) у мышей линии СВА после однократного введения циклофосфана в МПД (250 мг/кг) (числитель) и при сочетанном введении циклофосфана и предлагаемой композиции (50 мг/кг) трижды (знаменатель), (X±m).

В табл. 11 представлена динамика показателей периферической крови у мышей линии СВА с гемолитической анемией, вызванной однократным введением фенилгидразина в дозе 50 мг/кг (числитель) и на фоне ежедневного введения им предлагаемой композиции в дозе 50 мг/кг (знаменатель) (X±m).

Список литературы
1. Абдулина Р.И. Ланго З.Я. Влияние пентоксила и тезана на картину периферической крови лучевой болезни//Патологич. физиол. и эксперим. терапия. 1958. N 1. С.39.

2. Алмазов В.А. Афанасьев Б.В. Зарицкий А.Ю. Шишков А.Л. Лейкопинии. - Л. Медицина, 1981. 240 с.

3. Гершанович М. Д. Осложнения при химио- и гормонстерапии злокачественных опухолей. М. Медицина, 1982. 224 с.

4. Баркан Р. С. Яковлева Т.К. Чувствительность клеток костного мозга к мутагенному действию циклофосфана// Вопросы радиобиологии и биологического действия цитостатических препаратов. Томск, 1977. С. 91-94.

5. Платонова В.И. Софьина З.И. Роль углеводного компонента в протевоопухолевых свойствах глюкокортикоидов//Химиотерапия опухолей в СССР. - 1975. Вып. 20. С. 96-100.

6. Козлов В.А. Громыхина Н.Ю. Интерлейкин-I: роль в иммунитете// иммунология. 1987. N 4/ C.32-38.

7. Moore M. A.S. Warren P.L. Synergy of inrerleuhine-1 and gramulocyze cjlomy srimulfting factor: in vivo stimukation of szem cell recoterg and haemopoietic regeneration folloting 5-fluorouracil vreqthment of mice // Proc. ACad. Sci. USA 87 7134.

8. Jhe influeunce of Il-1 treeathment an the recontitudion of the haemopoietic and immurne systems aftes sublethal irradiqtton (MoOi say p. Charrier K. Bressler L. Aepert A.//J. of immunol. 1988. Vol.140. N 12. P.42004 4210.

9. Watt S.M. Yrea Ves M.F.//Nature. 1987. Vol. 326. P. 403 - 405.

10. Meteaff D. Haemopoietic grauth factors. 2. Clinical applicofions // Lancer. 1989. N 8643. P. 881 887.

11. Erslev A.S. iryfhropoitin // Leuhemiq Pusiarch 1990. Vol.14. - P.638 688
12. Metcaelf D. Hfemofopoietic graofh factors // Jhe hanclt. 19989. - Vol.15. N 8642. P.825 827.

13. Rothstein ej. clarcson D.K. Larsen Sf fect of lithium on neutrophill mase and production// Ncu Ruge. J. Mid 1978. Vol.298 P.178 189.

14. Creco F.A, Breton H.D. Rffect of lithinm carfonoete on fhe neutropenid caused by chemetherapy a preliminary clinical trial// Oncology. - 1977. Vol.34. P.153-155.

15. Byron J. m. Rffee jf szeroids On fhe cycling of hou mopoietic szem cell// Nature. 1970. Vol. 228. P.1204.

16. Ludoushy M. A. Paimer R.H. sradies on fhe rob siqlicaciol in fhe physical and biological pcoperfies of erythroetin// Canad. J.Biochtin. 1972. Vjo.50. N 8. P.909-917.

17. Юшков Б.Г. Механизмы повреждения и компенсации гемопоэза в условиях воздействия на организм экстремальных факторов: Автореф. дис. докт. мед. наук. Томск, 1984. 22с.

18. О влиянии гликозаминогликанов лейкоцитов на пролиферативную активность и клональную способность клеток-предшественников грануломоноцитопоэза и стромы кроветворной ткани/Харченко М.Ф. и др.//Гемотол. и трансфузиол. 1986ю N 7. С. 24-28.

19. Лабораторные методы исследования в клинике: Справочник/ Под ред. В. В.Меньшиковаю М. Медицина, 1987. 386с.

20. Справочник по клиническим лабораторным методам исследования//Под ред. Кост Е.А. Мю Медицина, 1975. 105с.

21. Metcalf D. Haemopoiefic colonies. Berlin, 1977. 227p.

22. Iscave N. Sieber F. Winterhalter K.N. // J.Cell. Phisiol. 1974. - Vol. 83. P.309.

23. Iscave N. Sieber F.// Exp. Hemat. 1975. Vol 3. P.32.

Гемостимулятор может быть использован для фармакологической коррекции нарушений со стороны костно-мозгового кроветворения, возникающих при действии на организм ионизирующей радиации, цитостатиков, а также на фоне гемолитической анемии. Сущность изобретения заключается в том, что гемостимулятор содержит байкалинат лизина, пропиленгликоль и дистиллированную воду при следующем соотношении компонентов, мас. %: байкалинат лизина 15-25, пропеленгликоль 35-45, дистиллированная вода - остальное. Целью изобретения является стимуляция костномозгового кроветворения, подавленного действием миелоингибирующих факторов. 12 табл.

Гемостимулятор, включающий действующее средство и основообразующее, отличающийся тем, что в качестве действующего средства он содержит байкалинат лизина (L-лизина-5,6,7-триоксифлавон-7-O-β-D-глюкоронидат), в качестве основообразующего пропиленгликоль и дистиллированную воду при следующем соотношении компонентов, мас.

Байкалинат лизина 15 25
Пропиленгликоль 35 45
Дистиллированная вода Остальноеа