ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение относится к иммуногенной композиции LHRH и, в частности, к иммуногенной композиции LHRH, содержащей LHRH, содержащий пептидные конструкции, приводящие к функциональной супрессии уровня LHRH у свиней, приводящей к эффективной иммунокастрации, удалению привкуса хряка и усилению роста свиней.
ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Гонадолиберин (GnRH), также известный как рилизинг-фактор лютеинизирующего гормона (LHRH), является тропным пептидным гормоном, ответственным за высвобождение фолликулостимулирующего гормона (FSH) и лютеинизирующего гормона (LH) из передней доли гипофиза. LHRH синтезируется и высвобождается нейронами гипоталамуса.
Вакцинация против гипоталамусного рилизинг-фактора лютеинизирующего гормона (LHRH) показана в качестве иммунологического способа контроля размножения с начала 1970-х гг. Вызывание иммунного ответа на LHRH предотвращает высвобождение из передней доли гипофиза гормонов LH и FSH, необходимых для развития и поддержания половых желез - семенников у самцов и яичников у самок. Таким образом, снижение уровней LH и FSH приводит к утрате репродуктивной функции.
Операции стерилизации (или кастрации) являются наиболее широко практикуемыми хирургическими операциями в ветеринарии и животноводстве. Значительную долю обоих полов домашнего скота и животных-компаньонов общепринято хирургически стерилизуют для предотвращения множества нежелательных характеристик, сопутствующих половой зрелости.
Иммунологическое блокирование действия LHRH может приводить к бесплодию животных, т.к. LHRH контролирует продукцию тестостерона, в свою очередь, регулирующего развитие спермы, и продукцию эстрогена, в свою очередь, вызывающего созревание яйцеклетки. Кроме того, иммунотерапия на основе LHRH обеспечивает средства контрацепции у самцов и самок животных-компаньонов (например, собак, кошек, лошадей и кроликов), а также снижение нежелательного регулируемого андрогенами поведения, такого как половая охота, мечение территории и агрессия. Такой процесс является обратимым в зависимости от уровня антитела в сыворотке у подвергаемых обработке животных после иммунизации с помощью иммунотерапии на основе LHRH. В заключение, иммунологическая кастрация (например, основанное на антителах ингибирование действия LHRH) обладает дополнительным применением в производстве мясного скота. Самцов не пускают на лучшие куски мяса из-за неприятного запаха и вкуса их мяса по причине циркулирующего тестостерона (например, привкуса хряка). Т.к. механическая (например, хирургическая) кастрация самцов пищевых животных более не считается гуманной, иммунологическая кастрация представляет собой приемлемую альтернативу этой практике.
Тестируют несколько иммуногенных форм LHRH. Например, пептид LHRH конъюгируют с белками-носителями для повышения иммунологической активности пептидного гормона. Однако эти белки-носители являются слишком дорогостоящими для крупномасштабного применения, и получаемые конъюгаты пептид-белок не являются настолько эффективными, чтобы (1) приводить к иммунокастрации на длительный период времени, и неспособны (2) генерировать иммунный ответ против LHRH у всех животных, при этом оба условия необходимы для эффективной вакцины в качестве замены хирургической кастрации.
Кроме того, эффективная иммунизация с использованием LHRH, неиммуногенного 10-мерного пептида, зависит от участка конъюгации между LHRH и белками-носителями. Кроме того, белковая связь с LHRH является затруднительной в качестве иммуногена, т.к. большинство иммунных ответов против таких иммуногенов направлено против крупных белков-носителей, а не против пептида LHRH (большое количество токсинов или других белков-носителей являются гораздо более крупными, чем LHRH, 10-мерный пептид). Это явление зачастую приводит к индуцируемой белком-носителем эпитопной иммуносупрессии. Таким образом, необходимо искать иммуностимулятор, подходящий для соединения с пептидом LHRH, приводящий к получению недорогой пептидной конструкции для применения в качестве ключевого ингредиента в составе вакцины, способной стимулировать ранний и сильный иммунный ответ на основной гормон LHRH, для применения в иммунокастрации. Аналогично этот иммуномодулятор также должен избегать индуцируемой носителем эпитопной супрессии. Таким образом, вакцина LHRH, имеющая постоянно высокую эффективность для иммунокастрации, включая (1) конкретное применение для удаления привкуса хряка вместе с усиленным профилем роста у свиней; и (2) для модификации поведения для упрощения содержания животных в стаде; все еще является очень желательной для устранения существующих недостатков иммунокастрации на основе LHRH, в частности, у свиней.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Изобретение относится к вакцинной композиции для кастрации свиней, содержащей пептидный иммуноген и ветеринарно приемлемое средство доставки или адъювант, где пептидный иммуноген содержит (a) пептид LHRH в SEQ ID NO: 1 и (b) по меньшей мере один T-хелперный эпитоп или иммуностимулирующий элемент, выбранный из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5 и 6, где пептид LHRH можно ковалентно связывать его N-концом с T-хелперным эпитопом и/или иммуностимулирующим элементом с помощью спейсерной последовательности Gly-Gly или εNLys. Спейсер "εNLys" представляет собой остаток лизина, находящийся между двумя аминокислотами, связанными с (1) C-концом предшествующей аминокислоты в группе ε-NH2 остатка лизина и (2) N-концом следующей аминокислоты на C-конце остатка лизина. Термины "εNLys", "εLys" и "εK" можно использовать взаимозаменяемо.
В другом варианте осуществления пептидный иммуноген по настоящему изобретению содержит SEQ ID NO: 7, 8, 9 или 10 или их смесь, и ветеринарно приемлемый адъювант выбран из группы, состоящей из ISA50V2 и эмульсигена D. Общее количество пептидного иммуногена составляет более 6,25 мкг на дозу, предпочтительно - от 50 мкг до 200 мкг.
Другой аспект настоящего изобретения относится к способу ингибирования характеристик, вызываемых половым созреванием свиней, включающему введение свиньям эффективного количества вакцинной композиции по настоящему изобретению для снижения продукции тестостерона и его производных, таких как дигидротестостерон, и эстрогена у иммунизированного хозяина. Характеристики включают, в качестве неограничивающих примеров, привкус хряка, половую активность, фертильность и половую охоту. Способ по настоящему изобретению ингибирует привкус хряка и рост семенников или придатков яичка.
В одном из вариантов осуществления вакцинную композицию вводят посредством внутримышечной инъекции самцам свиней серией из двух доз, при этом первую дозу вакцинной композиции вводят свинье уже в возрасте 3 недель, а вторую дозу вводят в качестве бустера в возрасте от 10 до 16 недель или более, что приводит к эффективной иммунокастрации, повышенному росту и удалению привкуса хряка приблизительно через две недели после введения бустера.
Подробное описание изобретения изложено в следующих вариантах осуществления со ссылкой на сопутствующие чертежи.
Ссылки:
(1) Научное обсуждение Improvac на веб-сайте European Medicines Agency (EMA) (последнее обновление 2010/04/22):
http://www.emea.europa.eu/docs/en_GB/document_library/EPAR_-_Scientific_Discussion/veterinary/000136/WC500064057.pdf
(2) Wang, CY; Zamb, TJ.; YE, John; Kaminsky, SM.; Hosein, Barbara; Nixon, DF.; Koff, CW; Kowalski, Jacek; Walfield, A M., Structured synthetic antigen libraries as diagnostics, vaccines and therapeutics. WO 95/11998. United States: United Biomedical Inc.
(3) Anna Efim Ladd, Chang Yi Wang, Timothy Joseph Zamb., ʺImmunogenic LHRH peptide constructs and synthetic universal immunes stimulators for vaccinesʺ, патент США № 5759551. United States: United Biomedical Inc.
(4) Wang, CY. ʺArtificial T helper cell epitopes as immune stimulators for synthetic peptide immunogens including immunogenic LHRH peptidesʺ, патенты США №№ 6025468, 6228987, 6559282. United States: United Biomedical, Inc.
(5) Wang CY. Artificial T helper cell epitopes as immune stimulators for synthetic peptide immunogens. Патенты США №№ 6713301. United States: United Biomedical Inc.
(6) Meister, et al., ʺTwo novel T cell epitope prediction algorithms based on MHC-binding motifs; comparison of predicted and published epitopes from Mycobacterium tuberculosis and HIV protein sequencesʺ, Vaccine, 13(6):581-591.
(7) Synthetic Peptides: A Users Guide. Grant GA, ed. New York: WH Freeman and Company: 1992
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
На фигурах 1a и 1b показаны соответствующие титры антител против LHRH после иммунизации самцов свиней с использованием составов, содержащих LHRH3 (SEQ ID NO: 7, 8 и 9) в адъюванте ISA50V2 (1a) или эмульсигене D (1b). Свиньи во всех тестируемых группах (группах 1-4 и группах 8-11) имеют высокий титр антитела против LHRH через две недели после введения бустера (т.е. через 10 недель после исходной иммунизации, или 10 WPI, что соответствует возрасту приблизительно 18 недель). В отличие от этого, титры антител против LHRH у свиней, которым вводили доступную в настоящее время коммерческую вакцину Improvac® (группа 7 и группа 14), повышались лишь через 14 WPI, при этом титры являлись более низкими, чем в случае составов пептидных вакцин по настоящему изобретению (группы 1-4 и группы 8-11). Свиньям в группах 5 и 12 вводили физиологический раствор, и они служили в качестве отрицательных контролей, и свиней в группах 6 и 13 кастрировали посредством хирургической операции, и они служили в качестве положительных контролей.
На фигурах 2a и 2b показана длительность кастрации соответствующих животных посредством иллюстрирования соответствующих концентраций тестостерона у свиней после иммунизации самцов свиней составами, содержащими LHRH3 (SEQ ID NO: 7, 8 и 9) в составах, содержащих адъювант ISA50V2 (2a) или эмульсиген D (2b). Во всех группах с составами в ISA50V2 или эмульсиген D поддерживали низкий уровень тестостерона к 10 WPI, и он оставался низким до 16 WPI (возраста 24 недели). В отличие от этого, свиньи в группах 7 и 14, которым вводили вакцину Improvac®, имели высокие уровни тестостерона в сыворотке до 12 WPI, и низкий уровень которого начинал расти с 14 WPI, что свидетельствует о гораздо более низкой эффективности иммунокастрации с использованием Improvac®.
На фигурах 3a и 3b показаны соответствующие массы тела свиней в возрасте 24 недели после иммунизации самцов свиней составами, содержащими LHRH3 (SEQ ID NO: 7, 8 и 9) в составах, содержащих адъювант ISA50V2 (3a) или эмульсиген D (3b). Неиммунизированные группы отрицательного контроля и группы хирургически кастрированных животных имели значительно более низкие средние массы тела 94,9 кг (отрицательные контроли, группы 5 и 12) и 88,8 кг (группы кастрированных животных 6 и 13). По сравнению с группами хирургически кастрированных животных, вакцина по настоящему изобретению (группы 4 и 11) демонстрировала значительно большее преимущество в приросте массы тела приблизительно на 27,9%.
На фигурах 4a и 4b показаны соответствующие титры антител против LHRH после иммунизации самцов свиней составами, содержащими LHRH1 (SEQ ID NO: 10) в адъюванте ISA50V2 (4a) или эмульсигене D (4b). Свиньи во всех тестируемых группах имели высокие титры антител против LHRH через две недели после введения бустера через 10 WPI (т.е. в возрасте 18 недель). Можно поддерживать титры антител приблизительно 3,0 (Log10) до 16 WPI (т.е. в возрасте 24 недели), когда свиней выставляют на продажу на рынке, в случае обеих групп составов в ISA50V2 или эмульсигене D.
На фигурах 5a и 5b показаны соответствующие концентрации тестостерона после иммунизации самцов свиней составами, содержащими LHRH1 (SEQ ID NO: 10) в адъюванте ISA50V2 (5a) или эмульсигене D (5b). Концентрации тестостерона в сыворотке у свиней в группах 1-4, которым вводили составы в ISA50V, и группах 8-11, которым вводили составы в эмульсигене D, являлись обратно пропорциональными титрам антител против LHRH в сыворотке, т.е. чем выше титры антител против LHRH, тем ниже концентрация тестостерона в сыворотке до достижения приводящего к кастрации уровня тестостерона в сыворотке с пороговым значением, оцениваемым как 1,87 нмоль/л, через две недели после введения бустера (т.е. через 10 WPI или в возрасте 18 недель). Во всех группах, за исключением группы 1, которым вводили составы в ISA50V2 или эмульсигене D, поддерживали низкий уровень концентрации тестостерона в сыворотке до 16 WPI (возраста 24 недели).
На фигурах 6a и 6b показаны соответствующие массы тела свиней после иммунизации самцов свиней составами, содержащими LHRH1 (SEQ ID NO: 10) в адъюванте ISA50V2 (6a) или эмульсигене D. Группы отрицательного контроля, т.е. невакцинированные животные, (группы 5 и 11) и группы хирургически кастрированных животных (группы 6 и 12) имели значительно более низкие средние массы тела 94,9 кг и 88,8 кг, соответственно, в возрасте 24 недели. По сравнению со свиньями в группах хирургически кастрированных животных, составы вакцин по настоящему изобретению (группы 4 и 10) имели значительно большее преимущество в приросте массы тела приблизительно на 20,3%.
На фигуре 7 показана длительность нахождения титров антител против LHRH после иммунизации самцов свиней составами, содержащими LHRH1 (SEQ ID NO: 10) в адъюванте ISA50V2 или эмульсигене D. Через две недели после введения бустера (т.е. 10 WPI) титры антител против LHRH в группах 1-4 достигали более 3,0 (log10), и такие высокие титры сохранялись до 20 WPI. У иммунизированных животных из групп 2 и 3 титры антител против LHRH даже могли сохраняться на уровне 3,0 (log10) до 24 WPI (т.е. в возрасте 32 недели). В отличие от этого, в группе отрицательного контроля (группе 5) и контрольной группе животных, которым проводили хирургическую кастрацию, (группа 6) всегда сохранялся низкий титр антител против LHRH.
На фигуре 8 показана длительность кастрации соответствующих концентраций тестостерона у свиней после иммунизации самцов свиней составами, содержащими LHRH1 (SEQ ID NO: 10) в адъюванте ISA50V2 или эмульсигене D. Через две недели после введения бустера (т.е. 10 WPI) в сыворотке всех свиней в группах 1-4 обнаруживали низкий уровень тестостерона, и он достигал уровня кастрации при супрессии антителами против LHRH, показанной в этих группах. Уровень тестостерона у свиней в группах 1-4 сохранялся таким же низким, как в контрольной группе кастрированных животных (группе 6) к 20 WPI (т.е. в возрасте 28 недель).
На фигуре 9 показана масса семенников свиней после иммунизации составами, содержащими LHRH1 (SEQ ID NO: 10) в адъюванте ISA50V2 или эмульсигене D, через 24 WPI. В группах 1-4 семенники свиней уменьшались до нефункционального размера.
На фигуре 10 показана масса придатков яичка свиней после иммунизации составами, содержащими LHRH1 (SEQ ID NO: 10) в адъюванте ISA50V2 или эмульсигене D, через 24 WPI. В группах 1-4 масса придатков яичка значительно снижалась.
На фигуре 11 показана масса тела свиней после иммунизации составами, содержащими LHRH1 (SEQ ID NO: 10) в адъюванте ISA50V2 или эмульсигене D. Иммунизированные животные из групп 1-4 имеют гораздо превосходящий прирост массы тела, чем в группах отрицательного контроля и контрольных группах хирургически кастрированных животных (группах 5 и 6).
На фигуре 12 показан эффект в отношении концентрации андростенона у свиней после иммунизации LHRH1 (SEQ ID NO: 10) в адъюванте ISA50V2 или эмульсигене D. Концентрации андростенона в жире сохранялись на уровне ниже 0,5 мкг/г жира в группах 1-4. В случае группы 3 даже сохранялось среднее значение андростенона 0,1384 мкг/г жира.
На фигуре 13 показан эффект в отношении концентрации скатола у свиней после иммунизации LHRH1 (SEQ ID NO: 10) с адъювантом ISA50V2 или эмульсигеном D. Концентрация скатола сохранялась на уровне ниже 0,1 мкг/г жира в группах 1-3. В группе 3 обнаруживали наименьшее среднее значение скатола (0,0514 мкг/г).
На фигуре 14 показан график распределения фактора привкуса хряка. Группа 1 имела свойства, схожие с группой 2, в которой 7/8 образцов попадали в группу низкого риска, а один образец - в группу среднего/высокого риска. Группа 3 имела исключительные свойства до 24 WPI, при этом все образцы в ней попадали в группу низкого риска. В группе хирургически кастрированных животных (группе 6) всегда сохранялась наименьшая концентрация факторов привкуса хряка. Контрольная группа, которой вводили физиологический раствор (группа 5), включала лишь 2/8 в группе низкого риска, 2/8 в группе среднего риска и 4/8 в группе высокого риска.
На фигуре 15 показаны титры антител против LHRH после иммунизации самцов свиней составами, содержащими LHRH1 (SEQ ID NO: 10) в адъюванте ISA50V2, с различными схемами примирования и введения бустера для оценки гибкости схемы иммунокастрации. У свиней в группе 1 наблюдали высокую иммуногенность, при этом средние титры антител против LHRH составляли до 3,556 (log10) в возрасте 22 недели и сохранялись на уровне 3,235 (log10) в возрасте 26 недель. В группе 2 достигали наиболее высокого титра антител, при этом средний титр составлял 3,526 (log10) в возрасте 18 недель и сохранялся на уровне 2,869 (log10) в возрасте 26 недель. В группе 3 достигали наиболее высокого титра антител 3,219 (log10) в возрасте 24 недели, и он сохранялся на уровне 2,682 (log10) в возрасте 26 недель.
На фигуре 16 показаны концентрации тестостерона в сыворотке после иммунизации самцов свиней составами, содержащими LHRH1 (SEQ ID NO: 10) в адъюванте ISA50V2, с различными схемами примирования и введения бустера для оценки гибкости схемы иммунокастрации. У свиней в группе 1 наблюдали эффект иммунокастрации (концентрация тестостерона ≤1,87 нмоль/л) в возрасте 20 недель, т.е. через 2 недели после введения бустера, и такой эффект длился по меньшей мере в течение 6 недель до достижения возраста 26 недель. Концентрации тестостерона у свиней в группе 2 были значительно ниже 1,87 нмоль/л в течение периода от 2 до 6 недель после введения бустера (т.е. в возрасте от 22 26 недель) и оставались низкими (концентрация тестостерона ≤1,644 нмоль/л) до достижения возраста 26 недель. Через две недели после введения бустера средняя концентрация тестостерона в группе 3 составляла 4,535 нмоль/л.
На фигурах 17a, 17b, 17c и 17d показана масса семенников и придатков яичка у свиней после иммунизации составами, содержащими LHRH3 (SEQ ID NO: 7, 8 и 9) в адъюванте ISA50V2. Массу семенников измеряли в 10 WPI (17a), 12 WPI (17b), 14 WPI (17c) и 16 WPI (17d). Семенники и придатки яичка постепенно уменьшались с течением времени, и наблюдали значительную потерю веса в 10 WPI в случае придатков яичка и в 12 WPI (p<0,001) в случае семенников.
На фигурах 18a, 18b, 18c и 18d показано количество фактора привкуса хряка (андростенона и скатола) после иммунизации самцов свиней составами, содержащими LHRH3 (SEQ ID NO: 7, 8 и 9) в адъюванте ISA50V2. Количество андростенона и скатола оценивали на 10 WPI (18a и 18c, соответственно) и 12 WPI (18b и 18d, соответственно). После иммунизации тестостерон снижался до уровня кастрации (т.е. менее 1,87 нмоль/л), что приводило к снижению андростенона в жире.
На фигурах 19a и 19b показана оценка риска по результатам определения уровня андростенона и скатола в жире в группе самцов свиней отрицательного контроля, которым не вводили средство (19a), по сравнению с самцами свиней, которых иммунизировали вакцинными составами пептида LHRH (19b). Все вакцинированные группы обнаруживали в группе низкого риска при чувствительной оценке (низкая концентрация андростенона (<0,5 мкг/г жира) и низкая концентрация скатола (<0,22 мкг/г жира)) с 10 WPI по 16 WPI.
На фигуре 20 показана длительность эффекта титров антител против LHRH после иммунизации самцов свиней составами, содержащими LHRH1 (SEQ ID NO: 10) в адъюванте ISA50V2. Титр антител в группе 1 снижался с 3,636±0,577 (Log10) (на пике) до 2,418±0,742 (Log10) (в конце исследования). Титр антител в группе 2 снижался с 3,868±0,221 (Log10) до 2,806±0,213 (Log10) (в конце исследования).
На фигуре 21 показана концентрация тестостерона после иммунизации самцов свиней составами, содержащими LHRH1 (SEQ ID NO: 10) в адъюванте ISA50V2. Концентрация тестостерона во всех группах на исходной стадии исследования составляла 2,943±2,854 (среднее ± SD) нмоль/л. Временной точкой, установленной для оценки активности вакцины, являлся момент через 2 недели после введения бустера, когда наблюдали наименьшую концентрацию тестостерона. Средние концентрации тестостерона у свиней в группах 1-4 через 2 недели после введения бустера составляли 1,265±0,353, 1,329±0,636, 1,904±2,297 и 1,222±0,445 (среднее ± SD) нмоль/л, соответственно.
На фигурах 22a и 22b показана длина (фиг. 22a) и объем семенников (фиг. 22b) после иммунизации самцов свиней составами, содержащими LHRH1 (SEQ ID NO: 10) в адъюванте ISA50V2. Не наблюдали различий в массах пар семенников, пар придатков яичка и длинах семенников среди свиней в группах 1-4. Стрелками показана временная точка введения бустера в случае соответствующих групп.
На фигуры 23a, 23b и 23c показаны массы пар семенников (фиг. 23a), пар придатков яичка (фиг. 23b) и длины яичек (фиг. 23c) у свиней при некропсии после иммунизации самцов свиней составами, содержащими LHRH1 (SEQ ID NO: 10) в адъюванте ISA50V2.
На фигуре 24 показаны концентрации андростенона и скатола в возрасте 24 недель после иммунизации самцов свиней составами, содержащими LHRH1 (SEQ ID NO: 10) в адъюванте ISA50V2. На графике распределения фактора привкуса хряка факторы риска для всех свиней в группах 1-4 находились в области низкого/среднего риска, за исключением одной свиньи в группе 1.
На фигуре 25 показаны титры антител против LHRH после иммунизации самцов свиней составами, содержащими LHRH1 (SEQ ID NO: 10) в адъюванте ISA50V2. Титры антител против LHRH в возрасте 0 и 3 недель находились приблизительно на фоновом уровне 1,718±0,297, 1,765±0,340 и 1,770±0,283 (Log10) в случае свиней в группах 1, 2, и 3, соответственно. Титры антител против LHRH составляли 3,249±0,346 в группе 4 и 2,893±0,786 в группе 5 в возрасте 18 недель после введения бустера в возрасте 16 недель.
На фигуре 26 показаны концентрации тестостерона в сыворотке у свиней после иммунизации составами, содержащими LHRH1 (SEQ ID NO: 10) в адъюванте ISA50V2. Уровни тестостерона в сыворотке у свиней в группах 1 и 2 составляли 2,154±0,921 нмоль/л в возрасте 10 недель и 2,183±1,231 нмоль/л в возрасте 6 недель, соответственно. Наиболее низкий уровень тестостерона у свиней в группе 3 составлял 3,065±0,205 нмоль/л в возрасте 12 недель. Концентрации тестостерона в сыворотке снижались до низких уровней приблизительно 0,586±0,184 и 0,893±1,192 нмоль/л в случае групп 4 и 5 в возрасте 20 недель, соответственно. Для сравнения, уровень тестостерона в сыворотке у свиней, которым вводили вакцину Improvac® (группа 6), оставался высоким (приблизительно 9,415±7,560 нмоль/л) в возрасте 20 недель, а затем снижался до низкой концентрации в возрасте 22 недели.
На фигуре 27 показаны титры антител против LHRH после иммунизации самцов свиней составами, содержащими LHRH3 (SEQ ID NO: 7, 8 и 9) в адъюванте ISA50V. Титры антител против LHRH у свиней в группах 1 и 2 являлись значительно более высокими, чем в группах контролей 3 (интактные неиммунизированные) и 4 (хирургически кастрированные).
На фигуре 28 показана полная (100%) иммунокастрация самцов свиней в группах 1 и 2 после иммунизации составом, содержащим LHRH3 (SEQ ID NO: 7, 8 и 9) в адъюванте ISA50V, в различных дозах.
На фигуре 29 показан более высокий средний суточный прирост массы (ADG) в результате повышенного среднесуточного потребления корма (ADFI) в случае самцов свиней, которым проводили иммунизацию составом, содержащим LHRH3 (SEQ ID NO: 7, 8 и 9) в адъюванте ISA50V, по сравнению с группой хирургически кастрированных животных.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Следующее описание представляет собой наиболее продуманный способ осуществления изобретения. Это описание предназначено для иллюстрирования общих принципов изобретения, и его не следует истолковывать в качестве ограничения. Объем изобретения лучше всего определен посредством ссылки на формулу изобретения.
Настоящее изобретение относится к пептидам, содержащим LHRH, 10-мерный пептид, связанный N-концом с костимуляторным или T-хелперным эпитопом (Th-эпитопом).
Термин "LHRH" относится к рилизинг-фактору лютеинизирующего гормона (GenBank: AAB34379.1), являющемуся тропным пептидным гормоном, отвечающим за высвобождение фолликулостимулирующего гормона (FSH) и лютеинизирующего гормона (LH) из передней доли гипофиза. Термин LHRH, используемый в настоящем описании, включает гомологи LHRH, получаемые из различных таксонов, включая птиц, рыб, пресмыкающихся и беспозвоночных. Предпочтительно, пептиды LHRH содержат аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, как показано в таблице 1.
Термин "вакцина" является общим клиническим термином для описания иммуностимулирующей композиции, приводящей к продукции антител у индивидуума, подвергнутого воздействию вакцины. С клинической точки зрения, индивидуумы, которым вводили вакцинные композиции, будут продуцировать антитела против антигена, присутствующего в вакцине. Вакцинные композиции, описываемые в настоящей заявке, не ограничены биологическими препаратами, улучшающими иммунитет против конкретного заболевания или патогена.
Термин "T-хелперный эпитоп (Th-эпитоп)" по изобретению относится к Th-эпитопам, полученным из чужеродных патогенов, включая, в качестве неограничивающих примеров, T-хелперные эпитопы поверхностного (HBsAg) и корового антигена гепатита B (HBc), T-хелперные эпитопы коклюшного токсина (PT Th), T-хелперные эпитопы столбнячного токсина (TT Th), T-хелперные эпитопы белка F вируса кори (MVF Th), T-хелперные эпитопы основного белка внешней мембраны Chlamydia trachomatis (CT Th), T-хелперные эпитопы дифтерийного токсина (DT Th), T-хелперные эпитопы спорозоита Plasmodium falciparum (PF Th), T-хелперные эпитопы триозофосфатизомеразы Schistosoma mansoni (SM Th), T-хелперные эпитопы TraT Escherichia coli (TraT Th). Полученные из патогенов Th-эпитопы, выбранные в этом случае в качестве типичных примеров промискуитетных Th-эпитопов, приведены в качестве SEQ ID NO: 2-9 и 42-52 в патенте США № 5759551 и включены в настоящее описание в качестве ссылки.
Применимые Th-эпитопы также могут включать комбинаторные Th-эпитопы. В Wang et al. (WO 95/11998) описывали конкретный класс комбинаторных Th-эпитопов, "структурированную синтетическую библиотеку антигенов" (SSAL). Th-эпитопы SSAL содержат множество Th-эпитопов с аминокислотными последовательностями, организованными вокруг структурного каркаса инвариантных остатков с заменами в конкретных положениях. Последовательности SSAL определяют, сохраняя относительно инвариантные остатки и одновременно варьируя другие остатки для обеспечения распознавания разнообразных элементов MHC-рестрикции. Это можно осуществлять, выравнивая первичную аминокислотную последовательность промискуитетных Th-эптопов, выбирая и сохраняя в качестве скелетного каркаса, остатков, отвечающих за уникальную структуру Th-пептида, и варьируя остальные остатки в соответствии с известными элементами MHC-рестрикции. Доступны списки инвариантных и вариабельных положений с предпочтительными аминокислотами элементов MHC-рестрикции для получения MHC-связывающих мотивов. Ими можно руководствоваться при дизайне SSAL Th-эпитопов (Meister et al., Vaccine, 1995; 13:581-591). В одном из вариантов осуществления Th-эпитоп включает SEQ ID NO: 2, 3, 4 и/или 5, как представлено в таблице 1.
SEQ ID NO: 6 относится к пептидному фрагменту, полученному из белка инвазина патогенных бактерий Yersinia spp., белка внешней мембраны микроорганизма, опосредующего проникновение бактерий в клетки млекопитающих. Показано, что в случае инвазии бактерий в культивируемые клетки млекопитающих необходимо взаимодействие между молекулой инвазина Yersinia и некоторыми молекулами из β1-семейства интегринов, присутствующими на культивируемых клетках. Т.к. T-лимфоциты богаты β1-интегринами (особенно активированные T-клетки или T-клетки памяти), и демонстрируемые костимуляторные свойства T-клеток ассоциированы с этим доменом инвазина, их можно связать с промискуитетным Th-эпитопом, содержащим конструкции LHRH, для дополнительного повышения иммуногенности сконструированного пептидного иммуногена (патент США № 6025468).
Пептиды по изобретению включают по меньшей мере один LHRH, Th-эпитоп и, необязательно, костимуляторный пептидный домен инвазина. Пептид LHRH (включая его гомологи) можно ковалентно связывать его N-концевыми аминокислотами посредством спейсера с пептидом, содержащим по меньшей мере одну последовательность, о которой известно, что она содержит Th-эпитоп. Th-эпитоп можно ковалентно связывать его N-концом с костимуляторным пептидным доменом инвазина. Спейсер включает, в качестве неограничивающих примеров, Gly-Gly, Lys, εNLys, εNLys-(Lys)n, где n=от 1 до 3, или Lys-Lys-Lys-εNLys (SEQ ID NO: 11) и т.д.
Пептиды по изобретению содержат от приблизительно 20 до приблизительно 100 аминокислотных остатков, предпочтительно - от приблизительно 20 до приблизительно 70 аминокислотных остатков, и более предпочтительно - от приблизительно 25 до приблизительно 50 аминокислотных остатков. В другом предпочтительном варианте осуществления пептид содержит от приблизительно 27 до приблизительно 45 аминокислотных остатков.
Количество Th-эпитопов включает, в качестве неограничивающих примеров, один, два, три, четыре или более Th-пептидов, как представлено в таблице 1 описания. Пептиды по изобретению содержат по меньшей мере один пептид Th-эпитопов, выбранных из SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, который, необязательно, можно соединять с N-концом пептида LHRH SEQ ID NO: 1. В одном из вариантов осуществления Th-эпитопы можно соединять с N-концом LHRH для получения пептида по изобретению. Например, пептиды SEQ ID NO: 2 и 3 можно последовательно соединять с N-концом LHRH с помощью спейсеров (Gly-Gly, Lys или εNLys). Специалист в этой области будет изменять количество Th-эпитопов и типы спейсеров, соединенных с пептидным иммуногеном LHRH, для получения оптимального пептида по изобретению, при необходимости.
В другом варианте осуществления пептиды по изобретению содержат SEQ ID NO: 7, 8, 9 и/или 10, как представлено в таблице 2, или имеют по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% или по меньшей мере 99% сходства с ними.
Пептиды по настоящему изобретению можно получать способами химического синтеза, как правило, хорошо известными специалистам в этой области; см., например, Grant, ed. (1992) Synthetic Peptides: A User's Guide, W.H. Freeman & Co., New York, N.Y., pp. 382. Таким образом, пептиды можно синтезировать с использованием автоматизированного твердофазного синтеза трет-бутилоксикарбониловым (t-Boc) или 9-вторенил-метилоксикарбониловым (F-moc) способом с помощью Applied Biosystems Peptide Synthesizer модели 430A или 431. Для синтеза полилизинового корового остатка используют незащищенные ди(t-Boc)- или ди(F-moc)-Nα, Nε-лизиновые остатки вместо t-Boc или F-moc с защищенной ε-аминогруппов. Для улучшения растворимости сконструированного пептида его можно удлинять с помощью дополнительных остатков серина или/и лизина на N-конце. После полной сборки желаемого пептида смолу обрабатывают стандартными способами для отщепления пептида от смолы и деблокирования защитных групп на боковых цепях аминокислот. Свободный пептид очищают посредством ВЭЖХ и биохимически охарактеризовывают. Альтернативно, более длинные пептиды можно синтезировать хорошо известными способами рекомбинантной ДНК. В любом стандартном руководстве по технологии ДНК представлены подробные способы получения пептидов по изобретению.
Пептид по изобретению при использовании в качестве ключевого ингредиента в вакцинном составе может приводить к иммунокастрации, включая утрату физических и/или химических характеристик, ассоциированных с половой зрелостью, таких как половое поведение, драки, миграция, агрессивное половое поведение, нежелательные органолептические характеристики, опухоли репродуктивных органов и беременность, цикл половой охоты, фертильность, беременность, и опухоли репродуктивных органов у иммунизированного животного. Таким образом, ингибирование характеристик включает ингибирование половой активности (например, предотвращение залезания одного самца крупного рогатого скота на другого самца), предотвращение или задержку овуляции, уменьшение семенников и придатков яичка, снижение концентрации тестостерона, снижение агрессивного поведения или снижение нежелательных органолептических характеристик, таких как привкус хряка.
Пептиды по изобретению составляют для удобного и эффективного введения в эффективных количествах с подходящим фармацевтически приемлемым носителем в стандартной лекарственной форме, как представлено в настоящем описании. Стандартная лекарственная форма, например, может содержать основной пептидный антиген в количестве в диапазоне от 0,5 мкг до приблизительно 2000 мкг, как правило, предпочтительно, более 6,25 мкг, наиболее предпочтительно - 25 мкг, 30 мкг, 40 мкг, 50 мкг, 60 мкг, 70 мкг, 80 мкг, 90 мкг, 100, 150 или 200 мкг. В случае композиций, содержащих дополнительные активные ингредиенты, дозы определяют с учетом общепринятой дозы и способа введения указанных ингредиентов.
Настоящее изобретение также относится к композициям, содержащим фармацевтически приемлемые системы доставки для введения пептидных иммуногенов. Композиции содержат иммунологически эффективное количество по меньшей мере одного пептида по настоящему изобретению. Количество пептида по изобретению включает, в качестве неограничивающих примеров, один, два, три, четыре или более в композиции (вакцине) по изобретению. Например, композиция по изобретению содержит SEQ ID NO: 7, 8, 9, 10 или их смесь. В одном из вариантов осуществления композиция по изобретению включает один пептид из SEQ ID NO: 7, 8, 9, или 10. В другом варианте осуществления композиция по изобретению включает SEQ ID NO: 7, 8 и 9, обозначаемые как LHRH3 в следующих примерах. В другом варианте осуществления композиция по изобретению включает SEQ ID NO: 10, обозначаемую как LHRH1 в следующих примерах. При составлении таким образом композиции по настоящему изобретению, содержащие LHRH или его гомолог в качестве антигенного участка-мишени, используют для предотвращения появления/удаления привкуса хряка, повышения профиля роста, иммунокастрации свиней и контрацепции самцов и самок.
Пептидные иммуногены по изобретению можно составлять в виде иммуногенных композиций с использованием адъювантов, эмульгаторов, фармацевтически приемлемых носителей или других ингредиентов, общепринято используемых в вакцинных композициях.
Адъюванты или эмульгаторы, которые можно использовать в настоящем изобретении, включают квасцы, неполный адъювант Фрейнда (IFA), липосин, сапонин, сквален, L121, эмульсиген, монофосфориллипид A (MPL), QS21, и ISA 720, ISA 50, ISA 50V2, ISA 35 или ISA 206, а также другие эффективные адъюванты и эмульгаторы. Специалист в этой области легко определит составы, и они также включают составы с немедленным высвобождением и/или замедленным высвобождением. Вакцины по настоящему изобретению можно вводить любым удобным путем, включая подкожный, пероральный, внутримышечный, интраперитонеальный или другой парентеральный или энтеральный путь. Аналогично, иммуногены можно вводить в виде однократной дозы или многократных доз. Специалисты в этой области, как правило, легко определяют схемы иммунизации.
В конкретном варианте осуществления средством доставки и адъювантом является Montanide™ ISA 50V2 (масляная композиция вакцинного адъюванта, состоящая из растительного масла и олеата маннида, для получении эмульсий "вода-в-масле" (т.е. w/o)), Tween® 80 (также известный как: полисорбат 80 или полиоксиэтилен (20) сорбитан моноолеат), CpG-олигонуклеотид, и/или любая их комбинация. В другом варианте осуществления фармацевтическая композиция является эмульсией "вода-в-масле-в-воде" (т.е. w/o/w) с эмульсигеном или эмульсигеном D в качестве адъюванта. Настоящее изобретение также относится к другим ингредиентам, общепринято включаемым в вакцинные составы, и инструкциям по дозированию таким образом, что достигают сбалансированного B- и T-клеточного иммунного ответа.
Фармацевтические формы, подходящие для инъекционного применения, включают стерильные водные растворы (водорастворимые) или дисперсии и стерильные порошки для экстемпорального получения стерильных инъецируемых растворов или дисперсии. Они должны быть стабильными в условиях производства и хранения и защищенными от контаминации микроорганизмами, такими как бактерии и грибки. Носитель может являться растворителем или дисперсионной средой, содержащей, например, воду, этанол, полиол (например, глицерин, пропиленгликоль и жидкий полиэтиленгликоль и т.п.), их подходящие смеси и растительные масла. Можно поддерживать правильную текучесть, например, с использованием покрытия, такого как лецитин, посредством поддержания необходимого размера частиц в случае дисперсии и с использованием поверхностно-активных веществ. Предотвращения действия микроорганизмов можно достигать с помощью различных антибактериальных и противогрибковых средств, например, парабенов, хлорбутанола, фенола, сорбиновой кислоты, тиомерсала и т.п. Во многих случаях предпочтительным может являться включение изотонических средств, например, сахаров или хлорида натрия. Пролонгированной абсорбции или отсроченного высвобождения инъецируемых композиций можно достигать с использованием композиций средств, замедляющих абсорбцию, например, моностеарата алюминия или/и желатина.
Изобретение также относится к способу индуцирования титра антител против LHRH, снижению концентрации тестостерона, предотвращения появления привкуса хряка, уменьшения семенников и придатков яичка, иммунокастрации свиней и контрацепции посредством введения пептидных композиций по изобретению млекопитающим в течение периода времени.
Как правило, способом по изобретению можно индуцировать титр антител против LHRH у свиньи, и титр антител против LHRH составляет более 2,0, предпочтительно - 2,5 или 3,0 (Log10) после одной или двух вакцинаций. Способом по изобретению также можно супрессировать концентрацию тестостерона у свиней, и концентрация тестостерона составляет менее 2,5 нмоль/л, предпочтительно - 2,0, 1,87 или 1,0 нмоль/л после одной или двух вакцинаций. Кроме того, способом по изобретению можно повышать массу тела свиней, предпочтительно - с повышением на 10% или более.
Композиции по изобретению можно вводить любым подходящим, известным в этой области способом, включая, в качестве неограничивающих примеров, пероральное введение или введение посредством инъекции, предпочтительно, внутримышечной инъекции.
Композиция по настоящему изобретению содержит эффективное количество одного или нескольких пептидных иммуногенов по настоящему изобретению и фармацевтически приемлемый носитель. Такая композиция в подходящей стандартной лекарственной форме, как правило, содержит от приблизительно 0,5 мкг до приблизительно 1 мг пептидного иммуногена на кг массы тела. При введении в многократных дозах ее может быть удобным разделять на соответствующее количество на дозу. Например, дозу, например, от 6,25 мкг до 200 мкг; предпочтительно - 50 мкг, можно вводить посредством инъекции, предпочтительно - внутримышечно. После нее можно вводить повторные (бустерные) дозы. Дозировка будет зависеть от возраста, массы тела и общего состояния здоровья индивидуума, как известно в области вакцин и терапии.
Изобретение также относится к способу ингибирования характеристик, вызываемых половой зрелостью свиней, включающему введение эффективного количества вакцинной композиции по изобретению.
Количество и время введения доз не ограничены способом по изобретению. Как правило, способ по изобретению включает по меньшей мере одну дозу, предпочтительно - две, три, четыре, пять доз или более, предпочтительно - две дозы или более. Специалисту в этой области известно о повышении количества доз для индуцирования эффективности. Первую дозу можно вводить свиньям в любом возрасте (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 недель). Временные точки вакцинации можно менять или модифицировать в зависимости от различных типов свиней, дозировки, адъюванта и способа введения.
Как правило, примирование (введение первой дозы) осуществляют после возраста 3, предпочтительно - от 3 до 8 недель. Бустерную вакцинацию (введение второй дозы), предпочтительно, проводят через 3-13 недели после примирования. Стандартная схема будет включать от 3 до 13 недель между примированием и введением бустера.
В одном из вариантов осуществления предпочтительная схема вакцинации будет следующей: примирование будут проводить приблизительно в возрасте 8 недель, бустер будут вводить приблизительно в возрасте 16 недель, и в случаях, когда свиней умерщвляют, это осуществляют через 6-8 недель после введения бустера.
Схема примирования/бустерной вакцинации по изобретению подходит для свиней. В зависимости от способов получения, используемых в различных странах, во многих случаях свиньи могут не достигать возраста 21 недели.
Конкретные варианты осуществления настоящего изобретения включают, в качестве неограничивающих примеров, следующие:
(1) Вакцинную композицию для кастрации свиней, содержащую пептидный иммуноген и ветеринарно приемлемое средство доставки или адъювант, где пептидный иммуноген содержит
(a) пептид LHRH SEQ ID NO: 1, и
(b) по меньшей мере один T-хелперный эпитоп, выбранный из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2, 3, 4 и 5, и, необязательно, иммуностимулирующий пептид SEQ IN NO:6, где пептид LHRH ковалентно связан своим N-концевым остатком с T-хелперным эпитопом.
(2) Вакцинную композицию по п. (1), где пептид LHRH, T-хелперный эпитоп и, необязательно, иммуностимулирующий пептид, связан с помощью Gly-Gly, εNLys, Lys-εNLys, Lys-Lys-εNLys, Lys-Lys-Lys-εNLys (SEQ ID NO: 11), εNLys-Lys-Lys или εNLys-Lys-Lys-Lys (SEQ ID NO: 12).
(3) Вакцинную композицию по п. (1), где пептидный иммуноген содержит SEQ ID NO: 7, 8, 9 и/или 10, или их смесь.
(4) Вакцинную композицию по п. (1), где ветеринарно приемлемый адъювант содержит ISA50, ISA50V2 или эмульсиген D.
(5) Вакцинную композицию по п. (1), где общее количество пептидного иммуногена составляет от приблизительно 12,5 мкг до 200 мкг на дозу.
(6) Способ ингибирования характеристик, вызываемых половой зрелостью свиньи, включающий введение свинье эффективного количества вакцинной композиции по п. 1.
(7) Способ по п. (6), где характеристика содержит привкус хряка, половую активность, половое поведение, фертильность и половую охоту.
(8) Способ по п. (6), где вакцинную композицию вводят посредством внутримышечной или подкожной инъекции.
(9) Способ по п. (6), где первую дозу вакцинной композиции вводят свинье в возрасте от 3 до 8 недель.
(10) Способ по п. (6), где вторую дозу вакцинной композиции вводят свинье в возрасте от 6 до 16 недель.
Дополнительные конкретные варианты осуществления настоящего изобретения включают, в качестве неограничивающих примеров, следующие:
(1) Ветеринарную композицию, содержащую:
(a) пептидный иммуноген, выбранный из группы, состоящей из
(i) смеси SEQ ID NO: 7, 8 и 9,
(ii) SEQ ID NO: 10, и
(iii) комбинации (i) и (ii); и
(b) ветеринарно приемлемое средство доставки или адъювант.
(2) Ветеринарную композицию по п. (1), где пептидный иммуноген в (a) является (i) смесью SEQ ID NO: 7, 8 и 9.
(3) Композиция по п. (2), где ветеринарно приемлемый адъювант содержит ISA50, ISA50V2 или эмульсиген D.
(4) Композиция по п. (2), где общее количество пептидного иммуногена составляет от приблизительно 12,5 мкг до 200 мкг на дозу.
(5) Способ ингибирования характеристик, вызываемых половой зрелостью свиней, включающий введение свинье эффективного количества композиции по п. (2).
(6) Способ по п. (5), где характеристики включают привкус хряка, половую активность, половое поведение, фертильность и половую охоту.
(7) Способ по п. (5), где композицию вводят посредством внутримышечной или подкожной инъекции.
(8) Способ по п. (5), где первую дозу композиции вводят свинье в возрасте от 3 до 8 недель.
(9) Способ по п. (5), где вторую дозу композиции вводят свинье в возрасте от 6 до 16 недель.
(10) Способ снижения продукции тестостерона и его производных у животного, включающий введение животному эффективного количества композиции по п. (2).
(11) Ветеринарная композиция по п. (1), где пептидный иммуноген в (a) является (ii) SEQ ID NO: 10.
(12) Композиция по п. (11), где ветеринарно приемлемый адъювант содержит ISA50, ISA50V2 или эмульсиген D.
(13) Композиция по п. (11), где общее количество пептидного иммуногена составляет от приблизительно 12,5 мкг до 200 мкг на дозу.
(14) Способ ингибирования характеристик, вызываемых половой зрелостью свиней, включающий введение свинье эффективного количества композиции по п. (11).
(15) Способ по п. (14), где характеристики включают привкус хряка, половую активность, половое поведение, фертильность и половую охоту.
(16) Способ по п. (14), где композицию вводят посредством внутримышечной или подкожной инъекции.
(17) Способ по п. (14), где первую дозу композиции вводят свинье в возрасте от 3 до 8 недель.
(18) Способ по п. (14), где вторую дозу композиции вводят свинье в возрасте от 6 до 16 недель.
(19) Способ снижения продукции тестостерона и его производных у животного, включающий введение животному эффективного количества композиции по п. (11).
ПРИМЕР 1
Синтез пептида LHRH
Способы синтеза конструкций родственного LHRH пептида, включенные в опытно-конструкторские работы для дизайна эффективной, направленной против LHRH вакцины и составления, описаны ниже. Пептиды можно синтезировать в малом масштабе, что применимо для лабораторных пилотных и полевых исследований, а также в крупном масштабе (килограммы), что применимо для промышленного/коммерческого получения вакцинных составов и серологических анализов.
Для скрининга и селекции наиболее оптимальных пептидных конструкций для применения в эффективной вакцине против LHRH конструировали широкий репертуар родственных LHRH антигенных пептидов, имеющих последовательности длиной от приблизительно 10 до 40 аминокислот. Каждая конструкция содержит пептид LHRH (SEQ ID NO: 1), синтетически связанный с тщательно сконструированным T-хелперным (Th) эпитопом или иммуностимулирующим пептидом, идентифицированным в таблице 1 (SEQ ID NO: 2-6). Пептиды LHRH, используемые в вакцине против LHRH по изобретению, представляют собой SEQ ID NO: 7-10.
Все пептиды, используемые для исследования иммуногенности или связанных серологических тестов для детекции и/или измерения антитела против LHRH синтезировали в малом масштабе способом Fmoc с помощью пептидных синтезаторов Applied BioSystems моделей 430A, 431 и/или 433. Каждый пептид получали посредством независимого синтеза на твердофазной подложке с использованием защиты Fmoc на N-конце и защитных групп боковой цепи трифункциональных аминокислот. Завершенные пептиды отщепляли от твердой подложки и удаляли защитные группы боковой цепи с помощью 90% трифторуксусной кислоты (TFA). Синтетические препараты пептидов оценивали посредством времяпролетной масс-спектрометрии с лазерной ионизацией и десорбцией из жидкой матрицы (MALDI-TOF) для обеспечения правильного содержания аминокислот. Каждый синтетический пептид также оценивали посредством обращенно-фазовой ВЭЖХ (RP-ВЭЖХ) для подтверждения профиля синтеза и концентрирования препарата.
Несмотря на строгий контроль способа синтеза (включая поэтапный мониторинг эффективности соединения), также получали аналоги пептидов по причине непредусмотренных событий в течение циклов элонгации, включая инсерцию, делецию, замену аминокислот и преждевременную терминацию. Таким образом, синтезированные препараты, как правило, включали многочисленные аналоги пептидов вместе с целевым пептидом. Несмотря на включение таких непредусмотренных аналогов пептидов, получаемые препараты синтезированных пептидов все же являлись пригодными для иммунологического применения, включая иммунодиагностику (в качестве антигенов для захвата антител) и вакцинацию (в качестве пептидных иммуногенов). Как правило, такие аналоги пептидов, преднамеренно сконструированные или полученные посредством способа синтеза в виде смеси побочных продуктов, зачастую являются настолько же эффективными, как очищенный препарат желаемого пептида, при условии, что разрабатывают способ QC распознавания для мониторинга способа производства и способа оценки продукта для обеспечения воспроизводимости и эффективности конечного продукта, в котором используют эти пептиды. Крупномасштабный синтез пептидов в количестве от сотен граммов до килограммов осуществляли с помощью сделанного на заказ автоматизированного пептидного синтезатора UBI 2003 в масштабе от 15 ммоль до 50 ммоль в соответствии с тем же принципом твердофазного пептидного синтеза.
В случае активных ингредиентов, используемых в конечных вакцинных составах для полевых исследований, конструкции пептида LHRH очищали посредством препаративной RP-ВЭЖХ с пологим градиентом элюции и охарактеризовывали посредством масс-спектрометрии MALDI-TOF, анализа аминокислот и RP-ВЭЖХ на чистоту и идентичность.
ПРИМЕР 2
Получение вакцинного состава
Смесь трех пептидных иммуногенов LHRH (LHRH3: SEQ ID NO: 7, 8 и 9) и одного пептидного иммуногена (LHRH1: SEQ ID NO: 10) составляли, соответственно, в эмульсионной системе доставки "вода-в-масле" (W/O) с использованием адъюванта ISA от Seppic (France) или в эмульсии "вода-в-масле-в-воде" (W/O/W) с эмульсигеном D от MVP (USA). В кратком изложении, пептиды в физиологическом растворе (20% масс./об. NaCl раствор) комбинировали в равных молярных соотношениях, асептически фильтровали (с использованием фильтров 0,22 мкм), а затем смешивали со средством доставки ISA50V2 или адъювантом эмульсигеном D посредством гомогенизации. Способы составления проверяли на всем их протяжении на вязкость. Конечные продукты охарактеризовывали посредством тестирования идентичности, физического теста и теста на стерильность. Все способы составления, наполнения и упаковки осуществляли в чистом помещении для поддержания стерильных условий.
ПРИМЕР 3
Иммунизация самцов свиней различными дозами вакцинных составов LHRH3 (SEQ ID NO: 7, 8 и 9)
Всего для исследования использовали 40 хряков возрастом 8 недель и 8 хирургически кастрированных свиней. Этих свиней разделяли на группы по 8 свиней на группу, как представлено в таблицах 3 и 4, при этом LHRH3 (SEQ ID NO: 7, 8 и 9) составляли с адъювантом на основе масла (Montanide™ ISA50V или ISA50V2) для получения эмульсии "вода-в-масле" (W/O), как представлено в таблице 3 (группы 1-4), или с адъювантом на основе масла эмульсигеном D для получения эмульсии "вода-в-масле-в-воде" (W/O/W), как представлено в таблице 4 (группы 8-11), для повышения иммуногенности конечных вакцинных продуктов. Три контрольные группы включали свиней, которым вводили физиологический раствор, в качестве отрицательных контролей (группы 5 и 12), хирургически кастрированных свиней в качестве положительных контролей (группы 6 и 13) и свиней, которым вводили находящуюся на современном уровне техники вакцину LHRH Improvac® для прямого сравнения эффективности (группы 7 и 14).
Образцы крови собирали через 0, 4, 8, 10, 12, 14 и 16 недель после исходной иммунизации (или WPI) для измерения титров антител против LHRH в сыворотке и концентраций тестостерона в сыворотке, соответственно, у свиней.
a. Титрование антител против LHRH в сыворотке посредством твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA).
Разрабатывали анализ ELISA, используемый для оценки титров антител против LHRH в сыворотке, и он описан ниже.
Лунки 96-луночных планшетов отдельно покрывали в течение 1 часа при 37°C 100 мкл отдельных целевых пептидов в количестве 2 мкг/мл в отдельности или в качестве эквимолярной смеси, если конкретно не указано иное, в 10 мМ буфере NaHCO3, pH 9,5, если конкретно не указано иное.
Покрытые пептидом лунки инкубировали с 250 мкл 3% масс. желатина в PBS при 37°C в течение 1 часа для блокирования неспецифических участков связывания белка с последующими тремя промывками PBS, содержащим 0,05% об. Tween® 20, и сушили. 100 мкл разведенных образцов сывороток добавляли в каждую лунку и позволяли реагировать в течение 60 минут при 37°C. Затем лунки шесть раз промывали 0,05% об. Tween® 20 в PBS для удаления несвязавшихся антител. 100 мкл меченых пероксидазой антител козы против IgG свиньи в предварительно протитрованном оптимальном разведении и в 1% об. нормальной сыворотки козы с 0,05% об. Tween® 20 в PBS добавляли в каждую лунку и инкубировали при 37°C еще в течение 30 минут. Лунки шесть раз промывали 0,05% об. Tween® 20 в PBS для удаления несвязавшегося антитела и проводили реакцию с 100 мкл смеси субстратов, содержащей 0,04% по массе 3',3',5',5'-тетраметилбензидина (TMB) и 0,12% об. пероксида водорода в буфере цитрата натрия еще в течение 15 минут. Эту смесь субстратов использовали для детекции пероксидазной метки по образованию окрашенного продукта. Реакции останавливали добавлением 100 мкл 1,0 M H2SO4 и определяли поглощение при 450 нм (A450).
Разведения сыворотки осуществляли в соответствии с целью для измерения титров антител против LHRH в сыворотке. Для определения титров антител у свиней, которым вводили вакцинные составы на основе пептида LHRH, осуществляли 10-кратное серийное разведение сывороток от 1:10 до 1:10000 для ELISA и титр в тестируемой сыворотке, выражаемый как Log10, вычисляли посредством линейного регрессионного анализа A450.
В соответствии с фиг. 1a и 1b, за исключением групп отрицательного контроля (группы 5 и 12) и хирургически кастрированных животных (группы 6 и 13), все группы, которым вводили тестируемые SEQ ID NO: 7, 8 и 9, демонстрировали высокий титр антител против LHRH через две недели после введения бустера в 10 WPI (возраст 18 недель). Титры антител в вакцинированных группах (группах 1-4 и группах 8-11) сохранялись близкими к 3,0 (Log10) или выше до 16 WPI (возраст 24 недели), времени продажи свиней на рынке, не только в случае групп, которым вводили состав с ISA50V2 (группы 1-4), но также и групп, которым вводили состав в эмульсигене D (группы 8-11). В отличие от этого, титры антител у свиней, которым вводили Improvac® (группа 7), повышались только к 14 WPI, через 2 недели после введения бустера, при этом титры антител были ниже, чем в случае пептидной вакцины по изобретению (группы 1-4 и группы 8-11).
b. Оценка концентрации тестостерона в сыворотке
Концентрацию тестостерона (TT) в сыворотке измеряли с помощью коммерческих наборов для ELISA или RIA. Наборы включали набор для ELISA тестостерона DRG® (EIA-5179), набор для ELISA BioVendor и набор для RIA Seamans. В этом конкретном примере концентрации тестостерона в сыворотке в группах 1-4 и группах 8-11, которым вводили состав в ISA50V2 или эмульсигене D, соответственно, измеряли с помощью набора для ELISA тестостерона DRG®, при этом он обратно коррелировал с соответствующими титрами антител в сыворотке свиней, при этом концентрации снижались ниже порогового значения кастрации (1,87 нмоль/л, в целом, или 1,0 нмоль/л при более строгих критериях) через две недели после введения бустера (т.е. 10 WPI или в возрасте 18 недель). У свиней во всех других группах, которым вводили состав в ISA50V2 или эмульсигене D, поддерживался уровень тестостерона, соответствующий кастрации, как показано на фиг. 2a и 2b, вплоть до 16 WPI (т.е. возраста 24 недели), окна для продажи свиней на рынке. Результаты свидетельствуют о том, что вакцинный состав LHRH3 по изобретению демонстрировал дозозависимое ингибирование тестостерона, и в группах 4 и 11 наблюдали более высокий уровень ингибирования по сравнению с другими группами.
По сравнению со свиньями, которым вводили вакцинные составы, у свиней в группах отрицательного контроля и контрольных кастрированных животных всегда наблюдали фоновый уровень низких титров антител против LHRH, при этом концентрации тестостерона в сыворотке колебались у отрицательных контролей (в группах 5 и 12) в качестве некастрированных животных; в случае свиней в группах положительных хирургически кастрированных контролей (группах 6 и 13) концентрации тестостерона в сыворотке сохранялись на низком уровне кастрации.
У свиней, которым вводили вакцину LHRH Improvac®, сохранялся высокий уровень концентрации тестостерона в сыворотке до 12 WPI, когда вводили бустер, и такой уровень снижался после 14 WPI, т.е. через две недели после введения бустера. Результаты четко свидетельствуют о том, что Improvac® не является настолько же мощной, как вакцинные составы по изобретению (группы 1-4 и группы 8-11, которым вводили составы, содержащие пептид SEQ ID NO: 7, 8 и 9 в ISA50V2 или эмульсигене D) для иммунокастрации свиней.
c. Масса тела
В соответствии с фиг. 3a и 3b, массу тела свиней проверяли все время от преиммунизации (в возрасте 3 недели) до конца исследования (16 WPI, в возрасте 24 недели). Результаты свидетельствовали о влиянии вакцинации на массу тела животного. Все свиньи, которым вводили физиологический раствор в качестве отрицательных контролей и которым проводили хирургическую кастрацию в качестве положительных контролей, имели значительно более низкие средние массы тела 94,9 кг (отрицательный контроль, группы 5 и 12) и 88,8 кг (хирургически кастрированные контрольные животные, группы 6 и 13), соответственно, в возрасте 24 недели. По сравнению со свиньями, которым проводили хирургическую кастрацию (группы 6 и 13), свиньи, которым вводили вакцинные составы по изобретению в количестве 200 мкг/мл/дозу (группы 4 и 11) имели значительно более высокое экономическое преимущество в приросте массы тела приблизительно на 27,9%.
ПРИМЕР 4
Иммунизация самцов свиней различными дозами вакцинных составов LHRH1 (SEQ ID NO: 10)
В этом примере способ являлся схожим со способом из примера 3, за исключением того, что пептидный иммуноген в настоящем вакцинном составе заменяли SEQ ID NO: 10, и дозу заменяли в соответствии с таблицами 5 и 6. После иммунизации сыворотки всех животных собирали в различные моменты времени для определения титров антител против LHRH и соответствующих концентраций тестостерона в сыворотке. Кроме того, во время умерщвления также собирали половые органы (семенники и придатки яичка) свиней возрастом 24 недели для измерения массы.
a. Титрование антител против LHRH в сыворотке посредством ELISA
В соответствии с фиг. 4a и 4b, за исключением групп отрицательного (физиологический раствор) и положительного (хирургического кастрация) контроля, все тестируемые группы, которым вводили состав, содержащий пептидный иммуноген SEQ ID NO: 10, имели высокий титр антитела против LHRH через две недели после введения бустера в 10 WPI (возраст 18 недель). Титры антител сохранялись близкими к 3,0 (Log10) или выше до 16 WPI (возраст 24 недели), окна для продажи свиней на рынке, не только в случае свиней в группах 1-4, которым вводили состав в адъюванте ISA50V2, но также свиней в группах 7-10, которым вводили состав в адъюванте эмульсигене D.
b. Оценка концентрации тестостерона в сыворотке
В соответствии с фиг. 5a и 5b, концентрации тестостерона в сыворотке свиней в группах 1-4, которым вводили состав в ISA50V2, или в группах 7-10, которым вводили состав в эмульсигене D, обратно коррелировали с соответствующими титрами антител, и все из них достигали уровня ниже порогового значения кастрации (<1,87 нмоль/л) через две недели после введения бустера (т.е. 10 WPI, возраст 18 недель). За исключением наименьшей дозы в группах 1 и 7, свиньи во всех других группах, которым вводили состав в ISA50V2 или эмульсигене D, сохраняли уровень тестостерона в сыворотке, соответствующий кастрации, до 16 WPI (возраста 24 недели), что представляет собой окно для продажи свиней на рынке.
c. Масса тела
В соответствии с фиг. 6a и 6b, массу тела свиней проверяли все время от преиммунизации (возраста 3 недели) до конца исследования (16 WPI, возраст 24 недели). Результаты свидетельствовали о влиянии вакцинации на массу тела животного. Свиньи, которым вводили физиологический раствор в качестве отрицательных контролей и которым проводили хирургическую кастрацию в качестве положительных контролей, имели значительно более низкую среднюю массу тела 94,9 кг (отрицательные контроли, группы 5 и 11) и 88,8 кг (хирургически кастрированные контроли, группы 6 и 12), соответственно, в возрасте 24 недели. По сравнению со свиньями, которым проводили хирургическую кастрацию (группы 6 и 12), свиньи, которым вводили вакцинные составы (группы 4 и 10) по настоящему изобретению, имели значительно более высокое экономическое преимущество в приросте массы тела приблизительно на 20,3%.
ПРИМЕР 5
Длительность иммунитета у свиней, которым вводили различные дозы вакцинных составов LHRH1 (SEQ ID NO: 10)
В этом примере способ являлся схожим со способом из примера 3, за исключением того, что пептидный иммуноген заменяли SEQ ID NO: 10 при дозировке, приведенной в таблице 7. После иммунизации сыворотки собирали в различные моменты времени для определения титров антител против LHRH и соответствующих концентраций тестостерона в сыворотке. Кроме того, также собирали половые органы (семенники и придатки яичка) свиней после умерщвления в возрасте 32 недель для измерения массы.
Целью этого исследования являлось расширение полевого исследования до 24 WPI, или возраста 32 недели, при этом образцы сыворотки собирали для измерения титров антител против LHRH и соответствующих концентраций тестостерона в сыворотке для оценки длительности эффективности иммунокастрации с помощью вакцинных составов по изобретению с использованием стандартного способа иммунизации с примированием в возрасте 8 недель (0 WPI) и введением бустера в возрасте 16 недель (8 WPI).
a. Титрование антител против LHRH в сыворотке посредством ELISA
Как показано на фиг. 7, образцы сыворотки свиней в группах 1-4 собирали через две недели после введения бустера (т.е. 10 WPI) и анализировали на титры антител против LHRH. Обнаруживали, что все образцы имели титр антител против LHRH более 3,0 (log10) и такие титры сохранялись на уровне 3,0 (log10) в течение 10-недельного периода до 20 WPI (т.е. возраста 28 недель). Кроме того, в группах 2 и 3 сохранялись титры антител против LHRH на уровне 3,0 (log10) до 24 WPI (т.е. возраста 32 недели). В отличие от этого, в группе отрицательного контроля (группе 5) и группе кастрированных контролей (группе 6) всегда сохранялся низкий фоновый уровень титр антител.
b. Оценка концентрации тестостерона в сыворотке
Как показано на фиг. 8, образцы сыворотки свиней в группах 1-4 собирали через две недели после введения бустера (т.е. 10 WPI) и анализировали на концентрацию тестостерона в сыворотке. Обнаруживали, что все образцы от свиней из групп 1-4 имеют концентрации тестостерона в сыворотке на уровне кастрации, что является результатом супрессии высокими титрами антител против LHRH. Уровни тестостерона в группах 1-4 сохранялись такими же низкими, как в группе хирургически кастрированных контролей (группе 6) до 20 WPI (т.е. возраста 28 недель).
c. Уменьшение половых органов (семенников и придатков яичка) после иммунокастрации посредством вакцинных составов LHRH1
В конце расширенного исследования на 24 WPI (т.е. свиней в возрасте 32 недели) свиней умерщвляли и взвешивали их половые органы, включая семенники и придатки яичка, для оценки эффективности иммунокастрации. Обнаруживали, что семенники и придатки яичка свиней из групп 1-4 уменьшались до нефункциональных размеров, как показано на фиг. 9-10. Массы семенников и придатков яичка также коррелировали с концентрацией тестостерона в сыворотке.
d. Масса тела
Свиньи из группы 1-4 превосходили свиней в контрольных группах (группах 5 и 6) по приросту массы тела, как показано на фиг. 11.
e. Удаление привкуса хряка, измеряемое по концентрациям андростенона и скатола в жире на животе
В этом исследовании длительности количественная оценка факторов привкуса хряка в конце исследования показала, что эффективное удаление привкуса хряка в жире на животе может расширять окно продажи свиней до 24 WPI (т.е. возраста 32 недели). В этом исследовании, андростенон и скатол экстрагировали из жира на животе, когда свиней умерщвляли, а затем определяли их посредством ВЭЖХ. В соответствии с фиг. 12, концентрации андростенона в жире сохранялись на уровне ниже 0,5 мкг/г жира у свиней в группах 1-4. В частности, в группе 3 среднее значение андростенона сохранялось на уровне до 0,1384 мкг/г жира. В соответствии с фиг. 13, концентрация скатола сохранялась на уровне ниже 0,1 мкг/г жира у свиней в группах 1-3. У свиней в группе 3 обнаруживали наименьшее среднее значение скатола 0,0514 мкг/г.
Кроме того, строили графики отдельных концентраций андростенона и скатола в конкретном образце для оценки факторов риска появления привкуса хряка и разделяли их на четыре сектора, низкий, средний/низкий, средний/высокий и высокий, для всех образцов, собранных в этом исследовании, как показано на фиг. 14. В соответствии с фиг. 14, в группе хирургически кастрированных животных (группе 6) всегда сохранялась наименьшая концентрация факторов привкуса хряка. Образцы от свиней в группе 3 имели исключительные свойства, при этом все образцы попадали в сектор низкого риска до 24 WPI. Образцы от свиней из группы 2 имели хорошие свойства до 24 WPI, когда 7/8 образцов попадали в сектор низкого риска, а один образец - в сектор высокого риска. Образцы свиней из группы 1 имели свойства, схожие со свойствами в группе 2, при этом 7/8 образцов попадали в сектор низкого риска, а один образец - в сектор среднего/высокого риска. В отличие от этого, в контрольной группе, которой вводили физиологический раствор, лишь 2/8 образцов попадали в сектор низкого риска, 2/8 - в сектор среднего риска, и 4/8 - в сектор высокого риска (фиг. 14). Вакцинные составы LHRH1 по изобретению демонстрировали активность удаления привкуса хряка все время до 24 WPI (т.е. возраста 32 недели). Результаты, полученные в этом исследовании, четко свидетельствовали о том, что у свиней, которым вводили вакцинные составы LHRH1 по изобретению в различных дозах, можно эффективно супрессировать продукцию андростенона и скатола и, таким образом, удалять привкус хряка из соответствующих мясных продуктов.
ПРИМЕР 6
Эффект схемы иммунизации в отношении иммунокастрации с примированием и введением бустера, осуществляемыми с различными временными интервалами с использованием вакцинных составов LHRH 1
В этом примере способ являлся схожим со способом из примера 3, за исключением того, что пептидный иммуноген, используемый в вакцинных составах, заменяли SEQ ID NO: 10 с адъювантом ISA50V2, и временные точки примирования и бустерной иммунизации модифицировали в соответствии с таблицей 8. Сыворотки собирали в различные моменты времени для измерения титров антител против LHRH и концентраций тестостерона в сыворотке.
Как показано на фиг. 15, у свиней в группе 1 наблюдали высокую иммуногенность со средним титром антител против LHRH, измеряемым на уровне 3,556 (log10) в случае свиней возрастом 22 недели, и такие титры сохранялись на уровне 3,235 (log10) до возраста 26 недель. В случае свиней в группе 2, обнаруживали наиболее высокий титр антител на уровне 3,526 (log10) в возрасте 18 недель, и он сохранялся на уровне 2,869 (log10) в возрасте 26 недель. В случае свиней в группе 3, по причине поздней схемы бустерной иммунизации в возрасте 18 недель, наиболее высокий титр антител составлял 3,219 (log10) в возрасте 20 недель через две недели после введения бустера, и титр сохранялся на уровне 2,682 (log10) до возраста 26 недель.
Кроме того, как показано на фиг. 16, у свиней в группе 1 обнаруживали эффект иммунокастрации (концентрация тестостерона ≤1,0 нмоль/л) в возрасте 20 недель, т.е. через две недели после введения бустера, при этом эффект иммунокастрации длился в течение по меньшей мере 6 недель до возраста 26 недель. У свиней в группе 2 также обнаруживали высокую эффективность иммунокастрации. Концентрация тестостерона у свиней из группы 2 составляла менее 1,0 нмоль/л в течение периода от 2 до 6 недель после введения бустера (т.е. в возрасте 22 недель) и сохранялась на относительно низком уровне (концентрация тестостерона ≤1,644 нмоль/л) до возраста 26 недель. Через две недели после введения бустера средняя концентрация тестостерона у свиней из группы 3 составляла 4,535 нмоль/л. Концентрация тестостерона свиней из группы 3 снижалась до 1,968 нмоль/л в возрасте 26 недель. Для фермеров выгодно начинать примирование свиней вакциной в более раннем возрасте, предпочтительно, в возрасте приблизительно 3 недели, для простоты содержания животных. Фермеры также могут вводить бустер свиньям более старшего возраста, таким образом, обеспечивая временную буферную зону для работников для иммунизации свиней и обеспечения поддержания концентрации тестостерона на постоянном низком уровне кастрации в практических целях для операции иммунокастрации на фермах. Результаты, представленные в этом исследовании, свидетельствуют о том, что вакцинные составы по изобретению можно использовать уже в возрасте от 3 до 4 недель и так поздно в случае бустера, как в возрасте 18 недель. Схемы примирования и введения бустера могут приводить к высокой иммуногенности, что приводит к эффективной супрессии концентрации тестостерона в сыворотке у свиней в возрасте от 22 до 26 недель, что является общепринятым в свиноводстве окном для продажи свиней на рынке.
ПРИМЕР 7
Удаление привкуса хряка посредством вакцинных составов LHRH3
В свиноводстве разработан консервативный и дружественный потребителю подход для установления порогового значения андростенона на уровне 0,5 мкг/г жира для оценки фактора риска привкуса хряка. Низкого риска получения мяса с привкусом можно достигать при среднем уровне андростенона (0,5-1,0 мкг/г жира) в комбинации с низким уровнем скатола (<0,1 мкг/г жира) или при низком уровне андростенона (<0,5 мкг/г жира) в комбинации со средним уровнем скатола (0,1-0,22 мкг/г жира). Средний риск будет возникать, когда оба параметра (биомаркера) привкуса хряка возникают на средних уровнях (андростенон 0,5-1,0 мкг/г жира; скатол 0,1-0,22 мкг/г жира). Если оба биомаркера (андростенон и скатол) одновременно превышают эти пороговые значения, это будет означать высокий риск того, что мясо будут считать мясом с привкусом (таблица 9).
В этом примере способ являлся приблизительно тем же, что и в примере 3. Свиней иммунизировали с использованием LHRH3 (SEQ ID NO: 7, 8 и 9), составленного в адъюванте ISA50V2 для получения эмульсии "вода-в-масле" (W/O), как представлено в таблице 10. После иммунизации, сыворотки собирали в различные моменты времени для измерения концентраций тестостерона в сыворотке и титров антител против LHRH. Кроме того, собирали ткани и органы свиней для измерения массы семенников и придатков яичка и для измерения количества скатола и андростенона в жире на животе посредством ВЭЖХ.
a. Уменьшение семенников и придатков яичка
Наблюдали уменьшение семенников и придатков яичка при взвешивании выделенных органов, когда свиней умерщвляли в различные моменты времени исследования, т.е. 10, 12, 14 и 16 WPI, соответственно (фиг. 17a-17d, соответственно). Обнаруживали, что после иммунизации вакцинными составами (LHRH3) по изобретению семенники и придатки яичка уменьшались с течением времени под супрессирующим влиянием повышенных концентраций антител против LHRH в течение этого исследования со значительной потерей веса, наблюдаемой на 10 WPI в случае придатков яичка и на 12 WPI (p<0,05) в случае семенников, как показано на фиг. 17.
b. Измерение привкуса хряка
5 г хребтового шпика, собранного у вакцинированных свиней или интактных хряков, по отдельности добавляли в 1,5 мл 100% метанола. Затем жир измельчали с использованием прессов на основе песка до полной гомогенизации тканей. Экстракт жира переносили в центрифужные пробирки емкостью 15 мл и обрабатывали ультразвуком в течение 5 минут при комнатной температуре. Экстракт жира охлаждали на льду в течение 15 минут, а затем центрифугировали при 4000 об./мин. в течение 20 минут при 5°C для отделения от тканевого дебриса. Супернатант переносили в другую центрифужную пробирку емкостью 1,5 мл.
После иммунизации свиней вакцинными составами пиковый титр антител против LHRH появлялся на 10 WPI, т.е. через 2 недели после введения бустера, при этом уровень тестостерон аснижался приблизительно до уровня кастрации приблизительно 1,0 нмоль/л или ниже, что приводило к снижению концентраций андростенона в жире, как показано на фиг. 18a. Концентрации андростенона у свиней, которым вводили вакцинные составы LHRH3 по изобретению, находились в диапазоне от менее 0,02 до 0,53 мкг/г жира по сравнению с концентрациями андростенона у свиней из группы отрицательного контроля, которым вводили физиологический раствор, которые составляли от приблизительно менее чем 0,02 до 2,12 мкг/г жира. Концентрация андростенона значительно снижалась на 10 WPI по сравнению с контрольными группами (p<0,05) до конца этого исследования на 16 WPI (в возрасте 24 недели).
Кроме того, концентрация скатола у свиней, которым вводили вакцинные составы LHRH3 по изобретению, составляла от приблизительно 0,004 до 0,2 мкг/г жира (фиг. 19b) по сравнению с концентрацией скатола у свиней из группы отрицательного контроля, составлявшей от приблизительно 0,04 до 0,36 мкг/г жира (фиг. 19a). Концентрации скатола у свиней, которым вводили вакцинные составы LHRH3 по изобретению, значительно снижались лишь на 14 WPI по причине того, что он зачастую контролируется посредством корма, которым кормят свиней, и метаболизируется в производные, такие как скатол, хранящийся в соответствующей жировой ткани. По заключению отрасли, если и андростенон, и скатол одновременно превышают пороговое значение (андростенон: 0,5 мкг/г жира; скатол: 0,22 мкг/г жира), это будет означать высокий риск, того, что мясо будут считать мясом с привкусом. Как показано на фиг. 19, результаты свидетельствовали о том, что все образцы жира, полученные из вакцинированных групп, относятся к сектору низкого риска при чувствительной оценке неприятного запаха с низкой концентрацией андростенона (<0,5 мкг/г жира) и низкой концентрацией скатола (<0,22 мкг/г жира) на 10 WPI или 16 WPI; в то время как свиньи в группе отрицательного контроля имеют приблизительно 50%-ную подверженность риску того, что мясо низкого качества будет иметь неприятный запах при его приготовлении.
ПРИМЕР 8
Гибкость схемы иммунизации вакцинными составами LHRH1 по изобретению
В этом примере способ являлся схожим со способом из примера 3, при этом свиней иммунизировали пептидом LHRH1 (SEQ ID NO: 10), составленным в адъюванте ISA50V2 для получения эмульсии "вода-в-масле" (W/O), как представлено в таблице 11, за исключением того, что дозировка составляла 25 мкг/2 мл/дозу, и временные точки вакцинации модифицировали в соответствии с таблицей 11.
a. Титрование антител против LHRH в сыворотке посредством ELISA
Титр антител против LHRH на исходной стадии этого исследования составлял 1,458±0,007 (Log10) (среднее ± SD), что представляло собой фоновое значение для анализа. После примирования и бустерной иммунизации (группы 1-3) титры антител постепенно повышались, и все из них достигали уровней через 2 недели после введения бустера. Средний титр антител в группе 1 снижался с 3,636±0,577 (Log10) на пиковом уровне на 10 WPI до 2,418±0,742 (Log10) в конце исследования. Средний титр антител в группе 2 снижался с 3,868±0,221 (Log10) на наиболее высоком уровне среди этих 4 групп до 2,806±0,213 (Log10) в конце исследования. Иммунные ответы в группах 3 и 4 являлись схожими по профилям антител. Результаты свидетельствовали о том, что 1-ую иммунизацию, предпочтительно, можно проводить с возраста 8 недель до возраста 3 недель (фиг. 20).
b. Оценка концентрации тестостерона в сыворотке
Как показано на фиг. 21, концентрации тестостерона во всех группах на исходной стадии эксперимента составляли 2,943±2,854 (среднее ± SD) нмоль/л. Временной точкой, установленной для оценки активности вакцины, являлось время через 2 недели после введения бустера, когда, как правило, наблюдают наименьшую концентрацию TT при иммунокастрации. Основываясь на этом наблюдении, обнаруживали, что средняя концентрация тестостерона в группах 1-4 составляет 1,265±0,353, 1,329±0,636, 1,904±2,297 и 1,222±0,445 (среднее ± SD) нмоль/л, соответственно. Не наблюдали статистически значимых различий (p=0,992) между группами, что анализировали посредством одностороннего дисперсионного анализа Краскела-Уоллиса. Кроме того, для титров антител против LHRH наблюдали обратную корреляцию с концентрациями тестостерона с коэффициентом корреляции -0,72, при этом высокий титр антител против LHRH приводил к низким концентрациям тестостерона после введения бустера.
В случае оценки длительности иммунитета свиньи в группе 3 имели лучшие свойства (т.е. наименьшие концентрации тестостерона), при этом их средняя концентрация тестостерона в сыворотке в возрасте 24 недели составляла 0,896±0,386 нмоль/л. Не наблюдали значимых различий (P=0,835) между группами 3 и 4. При продвижении по схеме концентрация тестостерона повышалась до 1,913±0,930 нмоль/л (группа 2) и 4,149±3,603 нмоль/л (группа 1). Наблюдали значимое различие между группами 1 и 3 (P=0,010), что анализировали методом Данна.
c. Измерение половых органов
Прижизненный размер семенников (длину и ширину) измеряли с возраста 12 недель и вычисляли их объем с использованием следующей формулы:
Объем семенника=1/2×a×b2, где
"a" является длиной семенника
"b" является шириной семенника
Измерения половых органов включали (1) прижизненные измерения семенника в длину и ширину и (2) измерения массы, длины и ширины семенника и придатка яичка при некропсии. В соответствии с фиг. 22 и 23, не наблюдали различий в массе пары семенников, пары придатков яичка и длины яичка между группами 1-4. Прижизненные длина и объем семенников (фиг. 22a и 22b) значительно снижались к возрасту 22 недель. Однако по каждому параметру свиньи в группе 2 имели лучший результат.
Распределение концентраций андростенона и скатола в возрасте 24 недель показано на фиг. 24. В соответствии с предпочтительной категорией концентрации фактора привкуса хряка, 87,5% свиней из группы 1, 3 и 4 относились к "низкому риску", что не является чувствительным для чувства вкуса и обоняния человека. Все свиньи в группе 2 попадали в зону "низкого риска", что, таким образом, соответствовало 100% эффективности.
d. Масса тела
В этом исследовании также измеряли массу тела каждой свиньи. Каждую группу свиней выращивали схожим образом. Средняя масса для продажи свиней на рынке Тайваня составляет приблизительно 115 кг, чего можно достигать к возрасту 26 недель.
В заключение, по сравнению с программой регулярной иммунизации с примированием и введением бустера, осуществляемыми в возрасте 8 и 16 недель, соответственно, схему примирования по настоящему изобретению можно легко приспосабливать для свиньи возрастом 3 недели. Кроме того, введение бустера можно осуществлять так поздно, как в возрасте от 14 до 16 недель, как показано в этом исследовании.
ПРИМЕР 9
Исследование гибкости обработки на ранней стадии с использованием вакцинного состава LHRH1
В этом примере способ являлся схожим со способом из примера 3, за исключением того, что пептидный иммуноген, используемый в вакцинном составе, заменяли SEQ ID NO: 10, и временные точки вакцинации модифицировали в соответствии с таблицей 12. Целью этого примера является оценка длительности кастрации, если вакцинный состав вводят очень маленьким поросятам, и иммунологическая обработка приводит к атрофии половых органов. Этот эксперимент планировали для оценки "гибких схем обработки" и для определения самого раннего времени примирования в схеме иммунизации.
a. Титрование антител против LHRH в сыворотке
Как показано на фиг. 25, при ранней иммунизации достигали среднего титра антител против LHRH 2,346±0,451 (Log10) в возрасте 12 недель в группе 1, которую иммунизировали в возрасте трех дней (D3) в качестве примирования и в возрасте трех недель в качестве бустера, и 2,173±0,527 (Log10) в возрасте 6 недель в группе 2, которую иммунизировали в возрасте семи дней в качестве примирования и в возрасте трех недель в качестве бустера (фиг. 25).
Из этих групп только у свиней в группе 3, которым проводили примирование в возрасте три недели и введение бустера в возрасте 6 недель, устанавливался высокий титр антител против LHRH 2,767±0,476 (Log10) в возрасте восьми недель. В случае свиней в группах 1-3, после достижения антителами против LHRH наиболее высоких титров через две недели после введения бустера, титры антител сохранялись на уровне 1,718±0,297, 1,765±0,340 и 1,770±0,283 (Log10) в группах 1, 2, и 3, соответственно. Свиньям в группах 3 и 4 также проводили примирование, осуществляемое в возрасте трех недель, а бустер вводили в возрасте 16 недель. У свиней в группах 4 и 5 могут устанавливаться более высокие титры антител 3,249±0,346 и 2,893±0,786 в возрасте 18 недель, соответственно, через две недели после введения бустера в возрасте 16 недель. Что касается свиней, которым вводили коммерческую вакцину Improvac® (группа 6), титры антител против LHRH достигали 1,724±0,339 (Log10) в возрасте 20 недель, т.е. через две недели после введения бустера. Ни в положительном контроле, т.е. у свиней, которым проводили хирургическую кастрацию (группа 7), ни в отрицательном контроле, т.е. у свиней, которым не проводили вакцинацию (группа 8), не наблюдали титры антител против LHRH выше фонового уровня, значение которого при анализе составляло 1,451±0,006 и 1,445±0,010 (Log10), соответственно.
b. Оценка концентрации тестостерона в сыворотке
Как показано на фиг. 26, уровень тестостерона в сыворотке свиней в группах 1 и 2 снижался до наименьшей концентрации 2,154±0,921 нмоль/л в возрасте 10 недель и 2,183±1,231 нмоль/л в возрасте 6 недель, соответственно. В группе 3 первую дозу вводили в возрасте трех недель, и профиль тестостерона является схожим с таковым в группах 1 и 2. Наименьший уровень тестостерона в группе 3 составлял 3,065±0,205 нмоль/л в возрасте 12 недель.
Если бустерную иммунизацию откладывали до возраста 16 недель в группах 4 и 5, независимо от того, вводили ли первую дозу в возрасте 3 или 8 недель, концентрация тестостерона снижалась до низких уровней приблизительно 0,586±0,184 и 0,893±1,192 нмоль/л в группах 4 и 5 в возрасте 20 недель, соответственно. В отличие от этого, хотя в случае свиней в группе 6 следовали инструкциям по иммунизации Improvac®, уровень тестостерона в сыворотке у свиней оставался высоким (приблизительно 9,415±7,560 нмоль/л) в возрасте 20 недель. В случае свиней в группе 7, которым проводили хирургическую кастрацию, концентрации тестостерона у каждой из свиней всегда сохранялся на фоновом уровне (приблизительно 0,559±0,372 нмоль/л). Что касается свиней в группе 8, которым не проводили вакцинацию и которые служили в качестве отрицательных контролей, средняя концентрация тестостерона сохранялась на нормальном уровне (от 3,546±2,409 нмоль/л до 7,380±3,269 нмоль/л) в течение исследования.
В заключение, титры антител против LHRH можно эффективно индуцировать с использованием примирования уже в возрасте 3 недель и последующего введения бустера, поддерживая высокие титры таких антител до конца исследования, получая профиль антител, схожий с профилем после схемы регулярной иммунизации с примированием в возрасте 8 недель и введением бустера в возрасте 16 недель. Таким образом, концентрацию тестостерона в сыворотке можно эффективно снижать до низких уровней, если примирование проводили в возрасте от 3 недель до 8 недель, в то время как бустер вводили в возрасте 16 недель. Фермерам удобно проводить иммунокастрацию с использованием гибкой схемы иммунизации на ранней стадии в случае свиней в возрасте 3 недель, когда, в основном, вводят многие другие вакцины.
ПРИМЕР 10
Эффективная иммунокастрация, продемонстрированная в полевом исследовании с использованием вакцинного состава LHRH3 в концентрации 100 мкг/мл/дозу с примированием и бустерной иммунизацией, осуществляемыми в возрасте 8 и 16 недель, с окончанием исследования в возрасте 22 недель.
Крупномасштабное полевое исследование осуществляли на свиноводческой ферме, находящейся в южном Тайване, для оценки эффективности иммунокастрации в полевых условиях с использованием двух партий вакцинных составов LHRH3, соответствующих GMP. В этом исследовании, на ферме получали тридцать шесть кроссбредных самцов свиней и восемь кастрированных свиней возрастом от 8 до 9 недель.
Свиней классифицировали на 4 группы и взвешивали на 0, 8, 10, 12 и 14 WPI. Всех свиней иммунизировали на 0 и 8 WPI и забирали кровь на 0, 8, 10, 12 и 14 WPI для определения титров антител против LHRH в сыворотке и концентраций тестостерона в сыворотке, как представлено в таблице 13. После умерщвления измеряли массы половых органов (семенников, придатков яичка, семенных пузырьков и предстательных желез), толщину хребтового шпика и площадь мышечного глазка (длиннейшей мышцы спины).
a. Титрование антител против LHRH в сыворотке посредством ELISA
Как показано на фиг. 27 и в таблице 14, титры антител против LHRH у свиней в группах 1 и 2 были значительно выше, чем у свиней в группах 3 (интактный контроль) и 4 (хирургически кастрированный контроль). В качестве примера, уровни титров антител против LHRH составляли приблизительно от 1,52±0,12 (Log10) до 2,90±0,42 (Log10) в группе 1 и от 1,45±0,01 (Log10) до 3,09±0,37 (Log10) в группе 2. Для сравнения, все титры антител против LHRH в группах 3 и 4 были значительно ниже таковых в группах 1 и 2.
b. Оценка концентрации тестостерона в сыворотке для иммунокастрации
Как показано на фиг. 28 и в таблице 15, всех свиней в группах 1 и 2 кастрировали с коэффициентом иммунокастрации 100% после иммунизации вакцинным составом LHRH3 в концентрации 100 мкг/мл/дозу. Концентрации тестостерона всех свиней в группах 1 и 2 снижались до очень низкого уровня с 8 WPI до достижения иммунокастрации. Результаты свидетельствовали о том, что вакцинный состав LHRH 3 по настоящему изобретению может эффективно ингибировать характеристики половой зрелости у свиней.
c. Повышение масс тела у вакцинированных свиней
Массу тела каждой свиньи измеряли, как указано в таблице 16. Как наблюдали, массы тела свиней в группах 1 и 2 превосходили таковые в группе 3.
Как показано на фиг. 29 и в таблице 17, повышенный средний суточный прирост массы (ADG) свиней был больше в вакцинированных группах (группах 1 и 2) по сравнению с кастрированными контролями (группа 4). Повышение ADG, в основном, являлось результатом повышенного среднесуточного потребления корма (ADFI), но не эффективности корма (FE). Результаты этого полевого исследования свидетельствовали о том, что вакцинный состав LHRH3 по настоящему изобретению при введении в количестве 100 мкг на дозу по схеме примирования и введения бустера в возрасте 8 и 16 недель, соответственно, являлся высокоэффективным, чтобы приводить к иммунокастрации со значительно повышенным ростом у самцов свиней. В результате этого повышенного роста, свиней можно продавать на рынке более чем на две недели вперед относительно общепринятой схемы скрещивания, таким образом, также достигая значительной дополнительной экономической выгоды для фермеров.
d. Уменьшение половых органов
В конце этого исследования на 14 WPI (т.е. в возрасте 22 недель) свиней умерщвляли и взвешивали семенники, придатки яичка, семенные пузырьки и предстательную железу для оценки эффективности иммунокастрации. В случае свиней в группах 1 и 2 обнаруживали, что массы половых органов, включая семенники, придатки яичка, семенные пузырьки и предстательную железу, значительно снижались (таблица 18), при этом эти половые органы уменьшались до нефункциональных размеров.
В заключение, вакцинные составы на основе пептидного иммуногена LHRH по настоящему изобретению имеют более высокий эффект иммунокастрации, чем доступный в настоящее время коммерческий (Improvac®). В дополнение к гуманному фактору преобразования общепринятой хирургической кастрации в развивающуюся в области животноводства иммунокастрацию, значительное увеличение массы в результате такой практики иммунокастрации будет приводить к значительной экономической выгоде, которая будет выдвигать тенденцию кастрации животных на передовую после десятилетий исследований.
Хотя настоящее изобретение описано с помощью примеров и в терминах предпочтительных вариантов осуществления, следует понимать, что изобретение не ограничено описываемыми вариантами осуществления. Наоборот, оно предназначено для охвата различных модификаций и схожих расстановок (как будет очевидно специалистам в этой области). Таким образом, объем прилагаемой формулы изобретения должен соответствовать наиболее широкой интерпретации для включения всех таких модификаций и схожих расстановок.
Таблица 1
Последовательности LHRH, Th-эпитопов и костимуляторного пептидного домена инвазина
Таблица 2
Последовательности пептидных иммуногенов LHRH по изобретению
Таблица 3
Дизайн исследования состава LHRH3 в ISA50V2
*Возраст в неделях
#WPI: Недели после (первой) иммунизации
LHRH3 содержит пептиды SEQ ID NO:7, 8 и 9.
Таблица 4
Дизайн исследования состава LHRH3 в эмульсигене D
*Возраст в неделях
#WPI: Недели после (первой) иммунизации
LHRH3 содержит пептиды SEQ ID NO: 7, 8 и 9.
Таблица 5
Дизайн исследования состава LHRH1 в ISA50V2
*Возраст в неделях;
# WPI: Недели после (первой) иммунизации
LHRH1 содержит пептид SEQ ID NO: 10
Таблица 6
Дизайн исследования состава LHRH1 в эмульсигене D
*Возраст в неделях;
# WPI: Недели после (первой) иммунизации
LHRH1 содержит пептид SEQ ID NO. 10
Таблица 7
Дизайн исследования длительности иммунитета
*Возраст в неделях;
# WPI: Недели после (первой) иммунизации
LHRH1 содержит пептид SEQ ID NO: 10
Таблица 8
Временные точки вакцинации
Вакцинация: SEQ ID NO: 10, 25 мкг/мл
B: Забор крови
Таблица 9
Оценка риска возникновения привкуса хряка с помощью комбинаторных пороговых значений андростенона и скатола
Таблица 10
Дизайн исследования удаления привкуса хряка
*Возраст недель
LHRH3 содержит пептиды SEQ ID NO: 7, 8 и 9.
Таблица 11
Исследование гибкости схемы иммунизации
Таблица 12
Исследование гибкости схемы с введением в раннем возрасте
†D: возраст в днях;
*W: возраст в неделях;
# WPI: Недели после (первой) иммунизации.
Таблица 13
Дизайн исследования длительности иммунитета
Таблица 14
Титрование антител против LHRH
Таблица 15
Концентрация тестостерона и иммунокастрация
*Устанавливали уровень кастрации для тестостерона ≤1,87 нмоль/л (99%-ный доверительный интервал) через две недели после второй инъекции (10 WPI).
Таблица 16
Масса тела свиней, которым вводили вакцинные составы (группы 1 и 2) по сравнению с контролем (группы 3 и 4)
Таблица 17
Средний суточный прирост массы, среднесуточное потребление корма и эффективность корма
Таблица 18
Масса половых органов
--->
СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> Wang, Chang-Yi
Wen-Jiun, Peng
<120> ИММУНОГЕННАЯ КОМПОЗИЦИЯ LHRH И ЕЕ ПРИМЕНЕНИЕ У СВИНЕЙ
<130> 1004263.212WO (2033-WO)
<140> TBD
<141> 2014-07-25
<160> 12
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 10
<212> PRT
<213> Свинья
<220>
<221> ПЕПТИД
<222> (1)..(10)
<223> Пептид LHRH
<400> 1
Glu His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly
1 5 10
<210> 2
<211> 17
<212> PRT
<213> Свинья
<220>
<221> ПЕПТИД
<222> (1)..(17)
<223> Столбнячный токсин (аминокислоты 830-844)
<400> 2
Lys Lys Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Leu Thr Glu
1 5 10 15
Leu
<210> 3
<211> 17
<212> PRT
<213> Свинья
<220>
<221> ПЕПТИД
<222> (1)..(17)
<223> MVF Th
<400> 3
Leu Ser Glu Ile Lys Gly Val Ile Val His Arg Leu Glu Gly Val Gly
1 5 10 15
Gly
<210> 4
<211> 15
<212> PRT
<213> Свинья
<220>
<221> ПЕПТИД
<222> (1)..(15)
<223> Th HBsAg
<400> 4
Phe Phe Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr Ile Pro Gln Ser Leu Glu
1 5 10 15
<210> 5
<211> 19
<212> PRT
<213> Свинья
<220>
<221> ПЕПТИД
<222> (1)..(19)
<223> SSAL1 Th
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> S или T
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(7)
<223> K или R
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (8)..(8)
<223> G или T
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (12)..(12)
<223> H или T
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (13)..(13)
<223> K или R
<400> 5
Ile Ser Ile Xaa Glu Ile Xaa Xaa Val Ile Val Xaa Xaa Ile Glu Thr
1 5 10 15
Ile Leu Phe
<210> 6
<211> 16
<212> PRT
<213> Свинья
<220>
<221> ПЕПТИД
<222> (1)..(16)
<223> Костимуляторный пептидный домен инвазина
<400> 6
Thr Ala Lys Ser Lys Lys Phe Pro Ser Tyr Thr Ala Thr Tyr Gln Phe
1 5 10 15
<210> 7
<211> 27
<212> PRT
<213> Свинья
<220>
<221> ПЕПТИД
<222> (1)..(17)
<223> Th столбнячного токсина
<220>
<221> ПЕПТИД
<222> (18)..(27)
<223> LHRH
<400> 7
Lys Lys Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu
1 5 10 15
Leu Glu His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly
20 25
<210> 8
<211> 45
<212> PRT
<213> Свинья
<220>
<221> ПЕПТИД
<222> (1)..(16)
<223> Костимуляторный пептидный домен инвазина
<220>
<221> ПЕПТИД
<222> (17)..(18)
<223> Линкер
<220>
<221> ПЕПТИД
<222> (19)..(35)
<223> Th MVF
<220>
<221> ПЕПТИД
<222> (36)..(45)
<223> LHRH
<400> 8
Thr Ala Lys Ser Lys Lys Phe Pro Ser Tyr Thr Ala Thr Tyr Gln Phe
1 5 10 15
Gly Gly Leu Ser Glu Ile Lys Gly Val Ile Val His Arg Leu Glu Gly
20 25 30
Val Gly Gly Glu His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly
35 40 45
<210> 9
<211> 45
<212> PRT
<213> Свинья
<220>
<221> ПЕПТИД
<222> (1)..(16)
<223> Костимуляторный пептидный домен инвазина
<220>
<221> ПЕПТИД
<222> (17)..(18)
<223> Линкер
<220>
<221> ПЕПТИД
<222> (19)..(33)
<223> Th HBsAg
<220>
<221> ПЕПТИД
<222> (34)..(35)
<223> Линкер
<220>
<221> ПЕПТИД
<222> (36)..(45)
<223> LHRH
<400> 9
Thr Ala Lys Ser Lys Lys Phe Pro Ser Tyr Thr Ala Thr Tyr Gln Phe
1 5 10 15
Gly Gly Phe Phe Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr Ile Pro Gln Ser Leu
20 25 30
Glu Gly Gly Glu His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly
35 40 45
<210> 10
<211> 47
<212> PRT
<213> Свинья
<220>
<221> ПЕПТИД
<222> (1)..(16)
<223> Костимуляторный пептидный домен инвазина
<220>
<221> ПЕПТИД
<222> (17)..(17)
<223> эпсилон K в качестве линкера
<220>
<221> ПЕПТИД
<222> (18)..(36)
<223> Th SSAL1
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (21)..(21)
<223> S или T
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (24)..(24)
<223> R или K
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (25)..(25)
<223> T или G
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (29)..(29)
<223> T или H
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (30)..(30)
<223> K или R
<220>
<221> ПЕПТИД
<222> (37)..(37)
<223> эпсилон K в качестве линкера
<220>
<221> ПЕПТИД
<222> (38)..(47)
<223> LHRH
<400> 10
Thr Ala Lys Ser Lys Lys Phe Pro Ser Tyr Thr Ala Thr Tyr Gln Phe
1 5 10 15
Lys Ile Ser Ile Xaa Glu Ile Xaa Xaa Val Ile Val Xaa Xaa Ile Glu
20 25 30
Thr Ile Leu Phe Lys Glu His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly
35 40 45
<210> 11
<211> 4
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> ПЕПТИД
<222> (4)..(4)
<223> эпсилон K
<220>
<221> ПЕПТИД
<222> (1)..(4)
<223> Спейсер
<400> 11
Lys Lys Lys Lys
1
<210> 12
<211> 4
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> ПЕПТИД
<222> (1)..(1)
<223> Эпсилон K
<220>
<221> ПЕПТИД
<222> (1)..(4)
<223> Спейсер
<400> 12
Lys Lys Lys Lys
1
<---
| название | год | авторы | номер документа |
|---|---|---|---|
| ПЕПТИДЫ GnRH-I И ПЕПТИДЫ GnRH-II | 2001 |
|
RU2348648C2 |
| ПЕПТИДНАЯ ВАКЦИНА ДЛЯ ПРЕДУПРЕЖДЕНИЯ И ИММУНОТЕРАПИИ ДЕМЕНЦИИ АЛЬЦГЕЙМЕРОВСКОГО ТИПА | 2013 |
|
RU2696566C2 |
| УЛУЧШЕННЫЙ ПЕПТИД, ИММУНОГЕННАЯ КОМПОЗИЦИЯ И ВАКЦИНА С ЕГО ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ, СПОСОБ ИММУНИЗАЦИИ ЖИВОТНЫХ ПРОТИВ ГОРМОНА ЛГВГ | 1996 |
|
RU2147307C1 |
| ПЕПТИДНАЯ ВАКЦИНА ДЛЯ ПРЕДУПРЕЖДЕНИЯ И ИММУНОТЕРАПИИ ДЕМЕНЦИИ АЛЬЦГЕЙМЕРОВСКОГО ТИПА | 2013 |
|
RU2811687C2 |
| ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ КОМБИНИРОВАННЫХ ВАРИАНТОВ ГОНАДОТРОПИН-РИЛИЗИНГ-ГОРМОНА (GnRH) В КАЧЕСТВЕ ИММУНОГЕНА | 2009 |
|
RU2537138C2 |
| ЛЕЧЕНИЕ СВИНЕЙ С ПОМОЩЬЮ АНТИГЕНА PCV2 | 2007 |
|
RU2520087C2 |
| ПРИМЕНЕНИЕ ПЕПТИДА, УСИЛИВАЮЩЕГО СЕКРЕЦИЮ СОМАТОТРОПНОГО ГОРМОНА, В КАЧЕСТВЕ АДЪЮВАНТА ВАКЦИНЫ | 2017 |
|
RU2768134C2 |
| ИММУНОГЕННЫЙ ПЕПТИД ПРОТИВ СТРЕПТОКОККОВ ГРУППЫ А | 2018 |
|
RU2775621C2 |
| ИММУНОГЕННЫЕ КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ | 2008 |
|
RU2468034C2 |
| РЕКОМБИНАНТНЫЙ ВИРУС СВИНОЙ ОСПЫ (SWINEPOX) И ВАКЦИНЫ | 2015 |
|
RU2727899C2 |
Группа изобретений относится к ветеринарной композиции для иммунокастрации свиней и ее применению. Предложена ветеринарная композиция для иммунокастрации свиней, состоящая из (a) эффективного количества смеси в равных молярных соотношениях пептидных иммуногенов, имеющих аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NOs: 7, 8 и 9, в физиологическом растворе; и (b) приемлемого в ветеринарии средства доставки или адъюванта, выбранного из группы, состоящей из воды, физиологического раствора, квасцов, неполного адъюванта Фрейнда (IFA), липосина, сапонина, сквалена, L121, эмульсигена, монофосфориллипида A (MPL), QS21, ISA 720, ISA 50, ISA 50V2, эмульсигена D, ISA 35, ISA 206, масел, липидов, полисорбата 80, эмульгаторов, этанола, полиола и любых их комбинаций. Предложенная композиция используется в способе иммунокастрации свиньи, способе снижения продукции тестостерона у животного, способе индуцирования антител против рилизинг-фактор лютеинизирующего гормона (LHRH) у свиньи. Группа изобретений обеспечивает высокую эффективность для иммунокастрации. 4 н. и 9 з.п. ф-лы, 29 ил., 18 табл., 10 пр.
1. Ветеринарная композиция для иммунокастрации свиней, состоящая из:
(a) эффективного количества смеси в равных молярных соотношениях пептидных иммуногенов, имеющих аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NOs: 7, 8 и 9, в физиологическом растворе; и
(b) приемлемого в ветеринарии средства доставки или адъюванта, выбранного из группы, состоящей из воды, физиологического раствора, квасцов, неполного адъюванта Фрейнда (IFA), липосина, сапонина, сквалена, L121, эмульсигена, монофосфориллипида A (MPL), QS21, ISA 720, ISA 50, ISA 50V2, эмульсигена D, ISA 35, ISA 206, масел, липидов, полисорбата 80, эмульгаторов, этанола, полиола и любых их комбинаций.
2. Ветеринарная композиция по п. 1, где приемлемое в ветеринарии средство доставки или адъювант представляет собой ISA 50V2.
3. Композиция по п. 1, где приемлемый в ветеринарии адъювант представляет собой ISA 50, ISA 50V2 или эмульсиген D.
4. Композиция по п. 1, где физиологический раствор представляет собой 20% масс./об. NaCl.
5. Композиция по п. 1, где общее количество пептидного иммуногена составляет от 12,5 мкг до 200 мкг на дозу.
6. Композиция по п. 1, где ветеринарная композиция составлена в виде 1 мл стандартной лекарственной формы, содержащей:
(a) всего 100 мкг смеси в равных молярных соотношениях пептидных иммуногенов в 20% масс./об. NaCl физиологическом растворе и
(b) ISA 50V2 в качестве приемлемого в ветеринарии адъюванта.
7. Способ иммунокастрации свиньи, включающий введение свинье эффективного количества композиции по любому из пп. 1-6.
8. Способ по п. 7, где мясо свиньи обладает сниженным привкусом хряка и свинья обладает сниженной половой активностью, половым поведением, фертильностью и половой охотой после введения композиции.
9. Способ по п. 7, где композицию вводят посредством внутримышечной или подкожной инъекции.
10. Способ по п. 7, где дозу композиции вводят свинье в возрасте от 3 до 8 недель.
11. Способ по п. 10, где другую дозу композиции вводят свинье в возрасте от 6 до 16 недель.
12. Способ снижения продукции тестостерона у животного, включающий введение животному эффективного количества композиции по любому из пп. 1-6.
13. Способ индуцирования антител против рилизинг-фактор лютеинизирующего гормона (LHRH) у свиньи, включающий введение свинье эффективного количества композиции по любому из пп. 1-6.
| US 2004009897 A1, 15.01.2004 | |||
| УЛУЧШЕННЫЙ ПЕПТИД, ИММУНОГЕННАЯ КОМПОЗИЦИЯ И ВАКЦИНА С ЕГО ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ, СПОСОБ ИММУНИЗАЦИИ ЖИВОТНЫХ ПРОТИВ ГОРМОНА ЛГВГ | 1996 |
|
RU2147307C1 |
| ПРОИЗВОДНЫЕ ПЕПТИДОВ И КОМПОЗИЦИЯ, ВЫЗЫВАЮЩАЯ ИММУННЫЙ ОТВЕТ НА LHRH | 1990 |
|
RU2078770C1 |
| US 5843446 A, 01.12.1998 | |||
| FINSTAD C.L | |||
| ET AL | |||
| Synthetic luteinizing hormone releasing hormone (LHRH) vaccine for effective androgen deprivation and its application to prostate cancer immunotherapy | |||
| Vaccine, 22 (2004), pp | |||
| Прибор для черчения параллельных линий и нанесения углов | 1924 |
|
SU1300A1 |
