НОВАЯ ВАКЦИНА ПРОТИВ HAEMOPHILUS PARASUIS Российский патент 2024 года по МПК C07K14/05 A61K39/102 

ОБЩЕЕ ОПИСАНИЕ ОБЛАСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Изобретение в общем относится к лечению свиней от инфекции патогенной бактерией Haemohilus parasuis. В частности, изобретение относится к новой вакцине для профилактического лечения свиней от инфекции этой бактерией, которая индуцирует защиту против наиболее распространенных серотипов H. parasuis.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Haemophilus parasuis является одной из наиболее важных бактерий, поражающих свиней. Заболевание, вызываемое этим патогеном, характеризуется полисерозитом и известно как болезнь Глассера. Haemophilus parasuis присутствует во всех основных осуществляющих свиноводство странах и остается значительным патогеном в современных системах свиноводства. Помимо того, что она вызывает заболевание, Haemophilus parasuis часто выделяется из верхних дыхательных путей здоровых свиней. Существуют различные известные серотипы Haemophilus parasuis, каждый из которых может быть идентифицирован с использованием способа иммунодиффузии (Kielstein et al. in J. Clin. Microbiol. 30:862-865; 1992 и Rapp-Gabrielson et al. in AJVR 53:659-664; 1992). С использованием различных типов вакцин была достигнута успешная вакцинация, обеспечивающая снижение смертности.

В настоящее время широко используются вакцины с инактивированными H. parasuis (т.е. бактерин). Все коммерчески доступные вакцины против H. parasuis представляют собой инактивированные вакцины. Большинство из доступных в настоящее время коммерческих вакцин получают путем увеличения в количестве вирулентного штамма H. parasuis с последующей инактивацией штамма. Бактериальные культуры осаждают путем высокоскоростного центрифугирования и ресуспендируют в стерильном фосфатно-солевом буфере, а затем составляют с соответствующим адъювантом, таким как минеральное масло, гидроксид алюминия, Карбопол, сапонин, витамин E ацетат, сквален, сквален и т.д. В дополнение к одновалентным вакцинам, существуют двухвалентные, трехвалентные или четырехвалентные вакцины против H. parasuis, которые включают различные серотипы. Они, как правило, обеспечивают низкий уровень перекрестной защиты, и они являются более эффективными против гомологичных серотипов. Эти инактивированные вакцины, например, такие как Porcilis Glässer (MSD, Boxmeer, Нидерланды), играют важную роль в контроле вспышек болезни Глассера по всему миру.

Стабильно аттенуированные штаммы H. parasuis в теории могут выступать в качестве безопасных и эффективных вакцин. Однако разработка вакцин на основе аттенуированных H. parasuis ограничена вследствие отсутствия информации об основных факторах вирулентности H. parasuis, что затрудняет создание мутантов H. parasuis, которые могли бы служить в качестве потенциальных вакцин. На сегодняшний день отсутствуют генно-модифицированные живые аттенуированные или инактивированные H. parasuis, являющиеся кандидатами для вакцин.

Исследовано несколько субъединичных вакцин, однако существующие данные указывают на то, что мало субъединичных вакцин индуцируют высокие уровни нейтрализующих антител против H. parasuis и защищают свиней от заражения H. parasuis. Однако коммерческие субъединичные вакцины, которые предупреждают и контролируют болезнь Глассера, в настоящее время недоступны. Недавно (Huisheng Liu et al, Veterinary Immunology and Immunopathology, Volume 180, 1 November 2016, pp 53-58) было показано, что субъединичные вакцины, которые содержат вновь идентифицированные защитные антигены, такие как рекомбинантный трансферрин-связывающий белок B (TbpB), составы наружного мембранного белка (OMP), обогащенные TbpB, OMP2 и OMP5, трансферрин-связывающий белок A (TbpA), тримерные аутотранспортеры (VtaA), шесть секретируемых белков (PflA, Gcp, Ndk, HsdS, RnfC и HAPS_0017), три слитых белка глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (GAPDH), OapA и HPS-0675, различные альтернативные OMP (SmpA, YgiW и FOG), 6-фосфоглюконатдегидрогеназа, субъединицы A, B и C цитолетального растягивающего токсина, и нейраминидаза или липопротеин, обеспечивают частичную защиту от заражения H. parasuis.

На сегодняшний день, также было показано, что ДНК-вакцина способна и обеспечивают некоторую частичную защиту от H. parasuis. Вакцина содержит ДНК, кодирующую GAPDH H. parasuis.

Однако, несмотря на коммерческую доступность вакцин, противомикробные средства все еще широко используются для лечения инфекций H. parasuis в основном вследствие неполной эффективности многих существующих вакцин, в частности, с учетом того, что в различных свиных стадах одновременно присутствуют различные серотипы. Свиньи, которым вводят противомикробные средства на раннем этапе инфекции H. parasuis, обычно способны пережить системную инфекцию. Однако существуют значительные затруднения для снижения количества противомикробных средств, используемых для растущих свиней.

ЗАДАЧА ИЗОБРЕТЕНИЯ

Задачей изобретения является предоставление альтернативной вакцины для профилактического лечения свиньи от инфекции H. parasuis, которая предпочтительно обеспечивает защиту, по меньшей мере настолько же хорошую, как и общепринятая вакцина на основе бактерина, в частности против двух наиболее распространенных серотипов H. parasuis, т.е. серотипов 4 и 5.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Для достижения задачи изобретения, было обнаружено, что белок, обладающий по меньшей мере 69% идентичностью последовательности с белком согласно SEQ ID No: 1, или иммуногенный фрагмент этого белка, может использоваться в профилактическом способе для защиты свиньи от инфекции Haemophilus parasuis серотипа 4 и инфекции Haemophilus parasuis серотипа 5 путем введения свинье вакцины, причем вакцина содержит белок или его иммуногенный фрагмент в качестве антигена.

Тот факт, что этот белок или его иммуногенный фрагмент может использоваться для лечения свиньи от инфекции H. parasuis, был основан на неожиданном открытии, что нативный белок, предполагаемая сериновая протеаза, который является консервативным в различных серотипах H. parasuis (включая вирулентные серотипы 4, 5, 12, 13 и 15), играет ключевую роль в инфицировании H. parasuis. Это смогли установить, поскольку вакцинация (частью) встречающимся в природе белком обеспечивала хорошую защиту от патогенных H. parasuis на уровне, который является даже лучшим, чем защита, которая может быть достигнута посредством общепринятой и испытанной вакцины на основе бактерина. Это демонстрирует, что эта сериновая протеаза играет ключевую роль в патогенности бактерии, и что нейтрализация функции этого белка помогает снижать инфекцию, включая клиническое заболевание в результате нее. В этом отношении, заслуга авторов изобретения состоит в осознании, что эта сериновая протеаза играет ключевую роль в патогенности H. parasuis. Из того, что это стало понятно, следовало, что индукция антител против этого белка может быть эффективной в качестве способа лечения инфекции H. parasuis. Наиболее простым способом индукции таких антител является введение белка или полипептида, который напоминает белок дикого типа. Далее, было обнаружено, что эти антитела также могут обеспечивать гетерологичную защиту, возможно вследствие высокого уровня консервативности этого белка среди различных серотипов, в частности среди наиболее распространенных серотипов 4 и 5.

Что касается самого белка, среди различных серотипов природное варьирование белка в отношении его полной длины составляет приблизительно 69% относительно белка, имеющего аминокислотную последовательность согласно SEQ ID No:1. Таким образом, белок, который удовлетворяет этому уровню идентичности, может использоваться для обеспечения защиты против различных штаммов H. parasuis дикого типа различных серотипов, которые естественным образом продуцируют соответствующий белок.

Хотя для определения значения изобретения белок согласно (полной) SEQ ID No:1 использовали в качестве антигена для индукции антител против природного белка, является общеизвестным, что, когда необходима индукция антител против определенного (встречающегося в природе) белка, обычно необязательно использовать целый белок. Также является возможным использование иммуногенного фрагмента этого белка, который способен, сам по себе или связанный с носителем, например, таким как KLH, индуцировать иммунный ответ против соответствующего белка. Это, в частности, является справедливым для сериновой протеазы по настоящему изобретению. Для начала, белок согласно SEQ ID No:1 уже является только частью встречающегося в природе белка, которая включает бета-бочонок аутотранспортера. Далее, хотя его функция в патогенности H. parasuis остается неизвестной, было обнаружено, что белок является гомологичным белку Mac-1 человека. Это смогли установить посредством так называемого выравнивания Cobalt: инструмент множественного выравнивания последовательностей, который находит набор попарных ограничений, получаемый из базы данных консервативных доменов, базы данных белковых мотивов и сходства последовательностей, с использованием RPS-BLAST, BLASTP и PHI-BLAST, где затем попарные ограничения включают в прогрессивное множественное выравнивание (см. Papadopoulos JS and Agarwala R, Bioinformatics 23:1073-79, 2007; PMID: 17332019). Это было подтверждено посредством поиска в базе данных NCBI для белка "семейства Mac-1" в бактериях "haemophilus", который подтвердил присутствие белка с гомологом домена Mac-1 в H. parasuis. В свою очередь известно, что белок Mac-1 является гомологичным протеазе IgM патогенной бактерии свиней Streptococus suis, как описано в WO 2015/181356 (IDT Biologika GmbH). Как описано в WO 2015/181356, вакцина, направленная против полноразмерного белка или фрагмента, содержащего только высококонсервативный домен Mac-1, способна индуцировать антитела против полноразмерного встречающегося в природе белка, тем самым обеспечивая защиту против соответствующей бактерии. Хотя H. parasuis является абсолютно неродственным S. suis, тот факт, что обе бактерии продуцируют белок с гомологом домена Mac-1, о котором известно, что он обладает активностью пептидазы иммуноглобулинов (см. базу данных PFAM European Molecular Biology Institute, как подтверждено в WO 2015/181356), в сочетании с тем фактом, что заболевания являются клинически сходными (они оба ведут к полисерозиту, обычно являются патогенными только для поросят, и оба индуцируются стрессом, таким как отъем и транспортировка), указывает на то, что также в H. parasuis, подобно Streptococcus suis, соответствующий природный белок вовлечен в ускользание от иммунитета. Более того, тот факт, что в обеих патогенных бактериях домен Mac-1 является высококонсервативным среди серотипов, но что в остальном белки H. parasuis и Streptococcus suis являются полностью неродственными (уровень идентичности на протяжении целого белка, включая домен Mac-1, составляет только 13%), в комбинации с тем фактом, что среди серотипов 3, 4, 5, 9, 12, 13 и 15 H. parasuis идентичность домена Mac-1 составляет даже 100% (в то время как для остальной части белка она является значительно более низкой, вплоть до 69%), даже доказывает то, что домен Mac-1 содержит основной иммуногенный эпитоп(ы), и, таким образом, сам по себе способен индуцировать антитела, которые нейтрализуют встречающуюся в природе сериновую протеазу, которая содержит этот так называемый домен Mac-1. Предпочтительно, фрагмент включает встречающийся в природе домен Mac-1 H. parasuis, т.е. последовательность согласно SEQ ID NO:2. Однако, как общеизвестно, последовательность с небольшим варьированием идентичности 10-20%, даже вплоть до 30%, все еще может быть пригодной в качестве эффективного антигена и способна индуцировать нейтрализующие антитела. Это варьирование может отражаться аминокислотным отличием(ями) общей последовательности или делециями, заменами, инсерциями, инверсиями или вставками аминокислоты(аминокислот) в указанной последовательности. Аминокислотные замены, которые не изменяют существенно биологическую или иммунологическую активность, описаны, например, Neurath et al. в "The Proteins" Academic Press New York (1979). Аминокислотные замены между родственными аминокислотами или замены, которые часто происходили в ходе эволюции, представляют собой, среди прочих, Ser/Ala, Ser/Gly, Asp/Gly, Asp/Asn, Ile/Val (см. Dayhof, M.D., Atlas of Protein sequence and structure, Nat. Biomed. Res. Found., Washington D.C., 1978, vol. 5, suppl. 3). Другие аминокислотные замены включают Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Thr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Leu/Ile, Leu/Val и Ala/Glu. На основе этой информации, Lipman и Pearson разработали способ быстрого и чувствительного сравнения белков (Science 227, 1435-1441, 1985) и определения функционального сходства между гомологичными белками. Такие аминокислотные замены иллюстративных вариантов осуществления настоящего изобретения, а также варианты, имеющие делеции и/или инсерции, входят в объем изобретения. Таким образом, фрагмент для применения в рамках настоящего изобретения может включать полипептид, который по меньшей мере на 70% идентичен полипептиду согласно SEQ ID NO:2, предпочтительно по меньшей мере на 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или выше.

В целом, было обнаружено, что с использованием белка согласно изобретению в вакцине можно индуцировать антитела, которые направлены против встречающейся в природе сериновой протеазы H. parasuis серотипов 4 и 5. Это означает, что можно лечить инфекцию (после вакцинации) H. parasuis этих серотипов с использованием только одного антигена одного серотипа, который может представлять собой антиген серотипа 5 или антиген серотипа 4. Затем, исходя из гомологии с белком Mac-1 и продуцирования Streptococcus suis протеазы IgM, содержащей домен Mac-1, понятно, что полипептид, содержащий (по меньшей мере) домен Mac-1 сериновой протеазы (необязательно связанный с иммуногенным носителем, например, таким как KLH), является достаточным, когда он используется в качестве антигена в вакцине для индукции антител против встречающегося в природе белка.

Также вариантом осуществления изобретения является вакцина для защиты свиньи от инфекции Haemophilus parasuis серотипа 4 и Haemophilus parasuis серотипа 5, содержащая белок, обладающий по меньшей мере 69% идентичностью последовательности с белком согласно SEQ ID No: 1, или иммуногенный фрагмент этого белка, и фармацевтически приемлемый носитель.

Также изобретение относится к применению белка, обладающего по меньшей мере 69% идентичностью последовательности с белком согласно SEQ ID No: 1 или его иммуногенным фрагментом, в качестве антигена для производства вакцины для защиты свиньи от инфекции Haemophilus parasuis серотипа 4 и инфекции Haemophilus parasuis серотипа 5.

Далее, изобретение также относится к способу защиты свиньи от инфекции Haemophilus parasuis серотипа 4 и инфекции Haemophilus parasuis серотипа 5 путем введения вакцины свинье, причем вакцина содержит в качестве антигена белок, обладающий по меньшей мере 69% идентичностью последовательности с белком согласно SEQ ID No: 1, или иммуногенный фрагмент этого белка.

ОПРЕДЕЛЕНИЯ

Антиген представляет собой антигенный материал, происходящий из микроорганизма, несмотря на то, что антиген в конечном итоге продуцируется искусственным образом. Антиген инициирует и опосредует образование антитела, которое действует против соответствующего встречающегося в природе соединения (как правило, белка). Важными источниками антигенов являются бактерии, вирусы, простейшие и другие микроорганизмы. Они могут представлять собой, например, белки или полисахариды наружных поверхностей клеток (капсульные антигены), внутренней среды клеток (соматические или O-антигены), жгутиков (жгутиковые или H-антигены), или экскретируемых продуктов, включая, например, ферменты и токсины.

Вакцина представляет собой состав, пригодный для применения у животного, содержащий один или несколько антигенов в иммунологически эффективном количестве, т.е. способный стимулировать иммунную систему целевого животного в достаточной степени для индукции иммунного ответа, такого как антитела, против антигенов и вместе с тем против соответствующих встречающих в природе белков, как правило, в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем (т.е. биологически совместимый носитель, а именно, носитель, который после введения не индуцирует значительные неблагоприятные реакции в рассматриваемом животном, способный предоставлять антиген иммунной системе животного-хозяина после введения вакцины), таким как жидкость, содержащая воду и/или любой другой биосовместимый растворитель или твердый носитель, такой как те, которые часто используются для получения лиофилизированных вакцин (на основе сахаров и/или белков), необязательно содержащий иммуностимулирующие агенты (адъюванты), которые после введения животному индуцируют иммунный ответ, который способен защитить животных от инфекции (после вакцинации).

Профилактический способ представляет собой способ, предназначенный для защиты от инфекции или соответствующего заболевания путем действия до того, как инфицирование фактически произойдет, как правило, путем введения рассматриваемому животному вакцины до ожидаемого инфицирования рассматриваемого животного.

"Защита свиньи от инфекции H. parasuis" означает способствование предупреждению, облегчению или излечению патогенной инфекции H. parasuis, или способствование предупреждению, облегчению или излечению нарушения, возникающего вследствие этой инфекции, например, для предупреждения или снижения одного или нескольких клинических признаков в результате инфекции H. parasuis.

Иммуногенный фрагмент представляет собой фрагмент белка, который все еще сохраняет его способность индуцировать иммунный ответ у хозяина, т.е. содержит B- или T-клеточный эпитоп. Широко доступны различные способы для идентификации без труда иммуногенных фрагментов (детерминант), в частности, иммуногенных фрагментов белков. Способ, описанный Geysen et al (патентная заявка WO 84/03564, патентная заявка WO 86/06487, патент США № 4833092, Proc. Natl Acad. Sci. 81: 3998-4002 (1984), J. Imm. Meth. 102, 259-274 (1987), так называемый способ PEPSCAN, представляет собой легко проводимый, быстрый и испытанный способ обнаружения иммуногенных эпитопов белков. Способ используется по всему миру и по существу хорошо известен специалисту в данной области. Этот (эмпирический) способ является особенно пригодным для детекции B-клеточных эпитопов. Также, используя последовательность гена, кодирующего какой-либо белок, компьютерные алгоритмы способны указывать конкретные белковые фрагменты в качестве иммунологически важных эпитопов, исходя из соответствия их последовательности и/или структуры эпитопам, которые в настоящее время известны. Определение этих областей основано на комбинации критериев гидрофильности согласно Hopp and Woods (Proc. Natl. Acad. Sci. 78: 38248-3828 (1981)), и аспектах вторичной структуры согласно Chou и Fasman (Advances in Enzymology 47: 45-148 (1987) и патент США 4554101). T-клеточные эпитопы, аналогично, могут быть спрогнозированы из последовательности компьютером с помощью критерия амфифильности Berzofsky (Science 235, 1059-1062 (1987) и патентная заявка США NTIS US 07/005.885). Краткий обзор представлен в: Shan Lu в отношении основных принципов: Tibtech 9: 238-242 (1991), Good et al on Malaria epitopes; Science 235: 1059-1062 (1987), Lu для обзора; Vaccine 10: 3-7 (1992), Berzofsky для эпитопов ВИЧ; The FASEB Journal 5:2412-2418 (1991). Является общеизвестным, что для того, чтобы быть иммуногенными, пептиды должны иметь минимальную длину: 8-11 а.к. для связывания рецептора MHC I, и 11-15 а.к. для связывания рецептора MHC II (рассмотрено, например, R.N. Germain & D.H. Margulies, 1993, Annu. Rev. Immunol., vol. 11, p. 403-450: The biochemistry and cell biology of antigen processing and presentation).

Идентичность последовательностей между двумя полипептидами (или нуклеиновыми кислотами) означает процент идентичных аминокислот (или нуклеотидов) в перекрывающихся областях полипептидов (или нуклеиновых кислот), как установлено посредством программы BLAST с использованием алгоритма blastp с параметрами по умолчанию (см. Tatiana A. Tatusova, Thomas L. Madden FEMS Microbiol. Letters 174: 247-250; 1999).

ДРУГИЕ ВАРИАНТЫ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В следующем варианте осуществления белок обладает по меньшей мере 90% идентичностью последовательности с белком согласно SEQ ID No: 1, даже по меньшей мере 95% идентичностью последовательности с белком согласно SEQ ID No: 1, вплоть до 100% идентичности последовательности.

В другом варианте осуществления белок или иммуногенный фрагмент используют в способе защиты свиньи от повышенного риска смерти вследствие инфекции Haemophilus parasuis серотипа 4 и/или серотипа 5.

В другом варианте осуществления белок или иммуногенный фрагмент используют в способе защиты свиньи от одного или нескольких клинических признаков вследствие инфекции Haemophilus parasuis серотипа 4 и/или серотипа 5.

Изобретение далее иллюстрируется с использованием следующих конкретных примеров.

ПРИМЕРЫ

Пример 1

Задача

Задачей этого эксперимента с выравниванием был поиск уровня идентичности последовательностей сериновой протеазы среди различных штаммов H. parasuis различных серотипов и идентификация домена Mac-1 в сериновой протеазе.

Результаты

В таблице, приведенной в настоящем описании ниже, указана идентичность последовательности относительно SEQ ID No:1 для соответствующих сериновых протеазах в других штаммах H. parasuis. Оказалось, что уровень идентичности составляет по меньшей мере 69% среди различных штаммов распространенных серотипов. Для штаммов в группе известных высокопатогенных и наиболее распространенных серотипов 4, 5, 12 и 13, уровень идентичности составляет даже 90% или выше.

Затем идентифицировали домен Mac-1 H. parasuis, и он представлен в настоящем описании как SEQ ID No:2. Белок согласно SEQ ID No:1 происходит из предполагаемой внеклеточной сериновой протеазы Haemophilus parasuis серотипа 5, штамм SH0165 (Genbank № ACL32961.1), имеющей длину 780 аминокислот. После удаления домена аутотранспортера (а.к. 521-780) и проведения идентификации HMMR (см. www.hmmer.org; Robert Finn et al, Nucleic Acids Research, 2011 Jul 1; 39, Web Server issue, W29-W37) домен семейства Mac-1 указывается как начинающийся на а.к. 130 и оканчивающийся на а.к. 221.

Таблица 1 Идентичность последовательности с SEQ ID No:1 для различных штаммов H. parasuis Штамм Начало Конец % идентичность Серотип 3 - штамм SW1 1 491 69 Серотип 4 - штамм GX0 1 471 90 Серотип 4 - штамм HPS 1 523 97 Серотип 5 - штамм 297 1 523 99 Серотип 5 - штамм Nag 1 523 98 Серотип 5 - штамм SH0 1 523 99 Серотип 9 - штамм D74 1 727 70 Серотип 12 - штамм ZJ 1 523 98 Серотип 13 - штамм MN 1 503 95 Серотип 15 - штамм 84 1 523 99

При сравнении домена Mac-1 H. parasuis с доменом Mac-1 Streptococcus suis идентичность составляет только 17% (с использованием Blastp), что указывает на то, что только малая часть домена является необходимой для связывания антитела и/или протеазной активности. Далее, это является указанием на то, что, хотя домен Mac-1 присутствует с идентичностью 100% в различных серотипах H. parasuis (как указано в настоящем описании выше; несмотря на то, что в других штаммах или серотипах уровень идентичности является более низким), варианты встречающегося в природе белка, вероятно, будут индуцировать эффективные антитела против встречающегося в природе белка, по меньшей мере варианты в пределах уровня идентичности 70% или более.

Пример 2

Задача

Задачей этого исследования бело тестирование эффективности субъединичной вакцины по сравнению с общепринятой вакциной на основе бактерина против заражения H. parasuis серотипа 5. Субъединичная вакцина содержала полипептид согласно SEQ ID No:1, где соответствующую ДНК клонировали из H. parasuis серотипа 5, штамм SH0165 (Genbank № ACL32961.1), экспрессировали в системе экспрессирующего вектора E. coli (pET22b, с сигнальной последовательностью pelB и HIS-меткой). Вакцина на основе бактерина содержала инактивированные клетки бактерий Haemophilus parasuis серотипа 5.

Схема исследования

Для этого испытания использовали тридцать здоровых поросят в возрасте 4 недель. Поросят распределяли на три группы (в равной степени распределенные среди разных пометов) по 10 поросят в каждой. Группу 1 вакцинировали дважды внутримышечно в возрасте 4 и 6 недель 2 мл вакцины, содержавшей субъединицу в количестве 75 мкг/мл, суспендированную в адъюванте типа "масло в воде". Группу 2 вакцинировали дважды внутримышечно вакциной на основе бактерина, содержавшей инактивированные клетки, суспендированные в адъюванте типа "масло в воде", и группу 3 оставляли невакцинированными в качестве контроля заражения. В возрасте 8 недель поросят подвергали интратрахеальному заражению вирулентной культурой H. parasuis серотипа 5.

В течение 10 суток после заражения свиней наблюдали каждые сутки в отношении клинических признаков инфекции H. parasuis, таких как угнетенное состояние, двигательные проблемы и/или неврологические признаки, и оценивали с использованием стандартной оценочной системы. Непосредственно перед каждой вакцинацией и заражением, проводили взятие сыворотки крови для определения антител. С регулярными интервалами до и после заражения проводили взятие крови в гепарин для повторного выделения заражающего штамма. Вскрытие проводили для всех животных, которые были отбракованы до запланированного дня вскрытия, а также для всех выживших животных.

Результаты

До заражения не наблюдали аномалий и не происходило интеркуррентных смертей. Средняя выживаемость в сутках, средние клинические показатели, количество животных, которые необходимо было умертвить до окончания испытания, а также результаты повторного выделения крови, указаны в настоящем описании ниже в таблице 2.

Таблица 2 Результаты вакцинации - испытание с заражением Группа Средняя выживаемость (сутки) Средний клинический показатель # умерщвленных # положительных по наличию культуры в крови Субъединица 7,7 27,1 3/10 3/10 Бактерин 4,9 47,4 6/10 3/10 Контроль 2,0 71,0 9/10 6/10

Заключение

Результаты указывают на то, что рекомбинантная субъединичная вакцина индуцировала очень хорошую защиту против заражения H. parasuis. Индуцированная защита была лучшей, чем защита, индуцированная вакциной на основе бактерина.

Пример 3

Задача

Задачей этого исследования было тестирование эффективности субъединичной вакцины по сравнению с общепринятой вакциной на основе бактерина против H. parasuis в модели заражения гетерологичным серотипом 4. Использованные вакцины представляют собой те же вакцины, которые описаны в примере 2.

Схема исследования

Для этого исследования использовали тридцать здоровых поросят в возрасте 3 недель. Поросят распределяли на три группы (в равной степени распределенные среди разных пометов) по 10 поросят в каждой. Группу 1 вакцинировали дважды внутримышечно в возрасте 3 и 6 недель 2 мл вакцины, содержавшей субъединицу в количестве 75 мкг/мл, суспендированную в адъюванте типа "масло в воде". Группу 2 вакцинировали дважды внутримышечно вакциной на основе бактерина, содержавшей инактивированные клетки, суспендированные в адъюванте типа "масло в воде", и группу 3 оставляли невакцинированными в качестве контроля заражения. В возрасте 8 недель поросят подвергали интратрахеальному заражению вирулентной культурой H. parasuis серотипа 4.

В течение 10 суток после заражения свиней наблюдали каждые сутки в отношении клинических признаков инфекции H. parasuis, таких как угнетенное состояние, двигательные проблемы и/или неврологические признаки, и оценивали с использованием стандартной оценочной системы. Непосредственно перед каждой вакцинацией и заражением, проводили взятие сыворотки крови для определения антител. С регулярными интервалами до и после заражения проводили взятие крови в гепарин для повторного выделения заражающего штамма. Вскрытие проводили для всех животных, которые были отбракованы до запланированного дня вскрытия, а также для всех выживших животных.

Результаты

До заражения не наблюдали аномалий и не происходило интеркуррентных смертей. Средняя выживаемость в сутках, средние клинические показатели, количество животных, которые необходимо было умертвить до окончания испытания, а также результаты повторного выделения крови, указаны в настоящем описании ниже в таблице 3.

Таблица 3 Результаты вакцинации - испытание с заражением Группа Средняя выживаемость (сутки) Средний клинический показатель # умерщвленных # положительных по наличию культуры в крови Субъединица 10,0 0,7 0/10 0/10 Бактерин 10,0 0,7 0/10 0/10 Контроль 9,4 6,3 1/10 2/10

Заключение

Результаты указывают на то, что рекомбинантная субъединичная вакцина индуцировала очень хорошую защиту против гетерологичного заражения H. parasuis, таким образом, была показана перекрестная защита между серотипом 4 и 5 для этого субъединичного антигена. Индуцированная защита была лучшей, чем защита, индуцированная вакциной на основе бактерина.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> Intervet International BV

<120> НОВАЯ ВАКЦИНА ПРОТИВ HAEMOPHILUS PARASUIS

<130> 24859 24860 24861

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 520

<212> БЕЛОК

<213> Haemophilus parasuis

<400> 1

Met Lys Pro Tyr Leu Ser Lys Ile Val Ile Ala Thr Leu Phe Ser Ser

1 5 10 15

Ser Val Gln Val Val Glu Ala Gln Thr Tyr Trp Ala Ser Gly Val Asn

20 25 30

Gln Asn Ser Gly Trp Thr Ala Asp Leu Gln Tyr Pro Asn Gln Cys Trp

35 40 45

Gly Ala Val Ala Gly Asn Thr Leu Gly Trp Trp Lys Ser Arg Val Lys

50 55 60

Ala Gln Val Glu Phe Asn Glu Asp Thr Pro Lys Asp Ser Lys Ala Ile

65 70 75 80

Ser Gly Trp Ile Tyr Lys Thr Tyr Pro His Ile Gln Gly Gly Leu Gln

85 90 95

Pro Tyr Arg Gly Met Glu Tyr Phe Phe Ser Arg Phe Ala Ser Gly Val

100 105 110

Lys Leu Tyr Glu Glu His Asn Lys Lys Thr Tyr Tyr Glu Ser Glu Arg

115 120 125

Gly Pro Thr Lys Ile Ser Gly Gly Pro Phe Trp Thr Glu Arg Tyr Asp

130 135 140

Ser Asp Ala Lys Leu Val Thr Lys Ser Leu Ile Asp Asn Phe Lys Thr

145 150 155 160

Gly Asn Val Val Ala Ala Leu Thr Ser Gln His His Thr Val Thr Leu

165 170 175

Trp Gly Ile Glu Val Asp Gly Asp Gly Lys Ile Lys Lys Gly Trp Ile

180 185 190

Ser Asp Ser Val Lys Asp Lys Ala Gly Asn Leu Lys Met Val Glu Val

195 200 205

Val Gly Asn Tyr Ala Lys Asp Asn Lys Gly Asn Asp Ile Phe Arg Phe

210 215 220

Leu Tyr Ser Tyr Ala Val Asp Gly Gly Arg Met Tyr Val Thr Asp Leu

225 230 235 240

Tyr Asp Ile Tyr Ser Ile Thr Tyr Leu Ser Ile Asp Glu Ala Arg Asn

245 250 255

Asn Gly Thr Tyr Lys Asp Thr Ser Asn Arg Glu Asp Cys Arg Leu Ser

260 265 270

Leu Ala Pro Gly Val Ser Glu Ser Phe Cys Ser Ile Asn Ser Thr Ala

275 280 285

Thr Asn Thr Thr Lys Val Glu Asn Val Ser Thr Thr Ser Asn Asn Ser

290 295 300

Thr Asn Leu Pro Thr Lys Val Glu Asn Ser Gly His Ser Asn Gln Ala

305 310 315 320

Ile Asn Ala Ala Ser Ala Ser Asp Asp Thr Val Ser Ser Ala Ser Glu

325 330 335

Asn Asn Asp Ser Val Asn Thr Pro Glu Asn Ile Glu Asn Ser Asn Gly

340 345 350

Val Asp Ile Gly Asn Asn Ser Thr Val Ser Ser Ala Asn Val Glu Asn

355 360 365

Ser Ser Asn Glu Val Ser Val Ile Asn Thr Pro Asn Thr Ser Ser Leu

370 375 380

Pro Asn Asp Gln Gly Thr Lys Lys Ile Ile Val Asp Ser Ser Glu Ser

385 390 395 400

Asn Ala Lys Asp Pro Ile Ile Ser Lys Ala Thr Glu Ser Leu Thr Lys

405 410 415

Glu Ile Asn Ser Tyr Pro Glu Leu Ser Phe Ile Thr Lys Asn Met Gly

420 425 430

Asp Val Thr Phe Tyr Ile Val Gln Lys Asp Gly Val Asp Ile Thr Leu

435 440 445

Ile Asn Pro Lys Thr Glu Gln Ser Leu Val Ser Asn Lys Gly Leu Val

450 455 460

Ile Tyr Asp Phe Lys Gln Gly Gln Asn Gly Asn Ile His Ile Thr Lys

465 470 475 480

Ser Pro Asn Gln Ala Ala Ile Lys Glu Ala Asn Glu Val Thr Ser Leu

485 490 495

His Thr Asp Leu Asn His Val Glu Met Asn Asn Leu Asn Lys Arg Met

500 505 510

Gly Glu Leu Arg Gly Ile Asp Ala

515 520

<210> 2

<211> 92

<212> БЕЛОК

<213> Haemophilus parasuis

<400> 2

Pro Thr Lys Ile Ser Gly Gly Pro Phe Trp Thr Glu Arg Tyr Asp Ser

1 5 10 15

Asp Ala Lys Leu Val Thr Lys Ser Leu Ile Asp Asn Phe Lys Thr Gly

20 25 30

Asn Val Val Ala Ala Leu Thr Ser Gln His His Thr Val Thr Leu Trp

35 40 45

Gly Ile Glu Val Asp Gly Asp Gly Lys Ile Lys Lys Gly Trp Ile Ser

50 55 60

Asp Ser Val Lys Asp Lys Ala Gly Asn Leu Lys Met Val Glu Val Val

65 70 75 80

Gly Asn Tyr Ala Lys Asp Asn Lys Gly Asn Asp Ile

85 90

<---

Изобретение относится к биотехнологии, ветеринарии. Предложен белок, обладающий по меньшей мере 69% идентичностью последовательности с белком согласно SEQ ID No: 1, или иммуногенный фрагмент этого белка для применения в профилактическом способе для защиты свиньи от инфекции Haemophilus parasuis серотипа 4 и инфекции Haemophilus parasuis серотипа 5 путем введения свинье вакцины, причем вакцина содержит белок или его иммуногенный фрагмент в качестве антигена. Также изобретение относится к вакцине, применению белка, обладающего по меньшей мере 69% идентичностью последовательности с белком согласно SEQ ID No: 1, или иммуногенного фрагмента этого белка, в качестве антигена для производства вакцины для защиты свиньи от инфекции Haemophilus parasuis серотипа 4 и инфекции Haemophilus parasuis серотипа 5 и к способу защиты свиньи от H. parasuis. Изобретение позволяет получить вакцину для профилактического лечения свиньи от инфекции H. parasuis, которая предпочтительно обеспечивает защиту, по меньшей мере настолько же хорошую, как и общепринятая вакцина на основе бактерина, в частности против двух наиболее распространенных серотипов H. parasuis, т.е. серотипов 4 и 5. 4 н. и 5 з.п. ф-лы, 3 табл., 3 пр.

1. Белок, обладающий по меньшей мере 69% идентичностью последовательности с белком согласно SEQ ID No: 1, или иммуногенный фрагмент этого белка, для применения в профилактическом способе для защиты свиньи от инфекции Haemophilus parasuis серотипа 4 и инфекции Haemophilus parasuis серотипа 5 путем введения вакцины свинье, причем вакцина содержит белок или его иммуногенный фрагмент в качестве антигена.

2. Белок или его иммуногенный фрагмент для применения по п.1, отличающийся тем, что белок обладает по меньшей мере 90% идентичностью последовательности с белком согласно SEQ ID No: 1.

3. Белок или его иммуногенный фрагмент для применения по п.1 или 2, отличающийся тем, что белок обладает по меньшей мере 95% идентичностью последовательности с белком согласно SEQ ID No: 1.

4. Белок или его иммуногенный фрагмент для применения по любому из пп.1-3, отличающийся тем, что белок представляет собой белок согласно SEQ ID No: 1.

5. Белок или его иммуногенный фрагмент для применения по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что способ предназначен для защиты свиньи от повышенного риска смертности вследствие инфекции Haemophilus parasuis серотипа 4 и/или серотипа 5.

6. Белок или его иммуногенный фрагмент для применения по любому из пп.1-4, отличающийся тем, что способ предназначен для защиты свиньи от одного или нескольких клинических признаков вследствие инфекции Haemophilus parasuis серотипа 4 и/или серотипа 5.

7. Вакцина для защиты свиньи против инфекции Haemophilus parasuis серотипа 4 и инфекции Haemophilus parasuis серотипа 5, причем вакцина содержит белок, обладающий по меньшей мере 69% идентичностью последовательности с белком согласно SEQ ID No: 1, или иммуногенный фрагмент этого белка, и фармацевтически приемлемый носитель.

8. Применение белка, обладающего по меньшей мере 69% идентичностью последовательности с белком согласно SEQ ID No: 1, или иммуногенного фрагмента этого белка, в качестве антигена для производства вакцины для защиты свиньи от инфекции Haemophilus parasuis серотипа 4 и инфекции Haemophilus parasuis серотипа 5.

9. Способ защиты свиньи от инфекции Haemophilus parasuis серотипа 4 и инфекции Haemophilus parasuis серотипа 5 путем введения свинье вакцины, причем вакцина содержит в качестве антигена белок, обладающий по меньшей мере 69% идентичностью последовательности с белком согласно SEQ ID No: 1, или иммуногенный фрагмент этого белка.