СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АЗОТСОДЕРЖАЩЕГО КОМПОНЕНТА ПИТАТЕЛЬНОЙ СРЕДЫ Российский патент 1997 года по МПК C12N1/20 

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к препаратам и средам для выращивания и диагностирования микроорганизмов.

Известно использование в качестве биостимуляторов для питательных сред различных природных и синтетических препаратов, таких как витамины, полифенилены, добавки растительных вытяжек и т.д.[1]
Недостатком большинства биостимуляторов является их высокая стоимость, видеоспецифичность действия, возможность проявления мутагенных свойств, вызываемая чужеродность стимулятора микроорганизму.

Известен препарат неопределенной природы, получаемый из культуральной жидкости бактерий, в частности E. coli, после воздействия на бактериальные клетки стрессовых факторов [2]
Недостатком является высокая специфичность действия.

В качестве источников азота для питательных сред чаще всего используют пептоны, в частности пептон Д [3] получаемый экстрагированием кормовых дрожжей, гидролизат кильки и др.[4,5]
Недостатками указанных гидролизатов является низкое содержание аминного и общего азота (2-3 и 7-8% соответственно).

Прототипом изобретения, связанного с получением компонента питательных сред, является процесс получения источника азота двухстадийным гидролизом Bacillus mucilaginosus. Процесс ведется вначале обработкой HCl в течение 30-40 мин при 120-125^oC, а затем обработкой ферментами поджелудочной железы в течение 10-14 дней при pH 7,8-8,0 и температуре 40-42^oC [6]
Недостатками прототипа являются длительность процесса, нетехнологичность, недостаточная эффективность для ряда сред.

Задачей, решаемой изобретением, является создание нового более эффективного и с широким спектром действия биостимулятора с технологией получения, позволяющей использовать его в качестве источника азота в питательных средах.

Задача достигнута использованием в качестве биостимулятора предварительно термостатированных продуктов ферментативного гидролиза биомассы Bacillus mucilaginosus/ФГ Bac. mucilaginosus/
Продукт, который сохраняет оптимальные свойства, получают сочетанием термической обработки при 95-105^oC в течение не менее 5 мин с последующей его обработкой панкреатином при 43-46^oC в течение по крайней мере двух суток и выделением целевого препарата из смеси центрифугированием.

При более низких температурах первой стадии обработки не идет достаточная дезинтеграция клеток, использование более жестких режимов, не улучшая результаты процесса, ведет к ухудшению качества продукта вследствие распада компонентов /витаминов, аминокислот и т.п./.

Лучшие результаты на второй стадии обработки достигаются при проведении ферментативного гидролиза 0,1% панкреатином при pH 7,8-8,0.

В научной литературе подобные биостимуляторы не описаны, как и технология их получения.

Преимуществами получаемого таким образом препарата является повышение аминного азота с 2-3 до 7-8% а общего азота с 7-8 до 15-16% и увеличение количества биомассы в 1,5-2,0 раза.

Полученный ферментативный гидролизат культуры Bac. mucilaginosus может быть использован как биостимулятор и компонент питательных сред для выращивания различных микроорганизмов, его применение не только значительно увеличивает выход микроорганизмов при культивировании, но и сокращает количество необходимых компонентов среды, тем самым упрощает и удешевляет ее приготовление.

Промышленная применимость биостимулятора как компонента питательной среды иллюстрируется примерами.

Пример 1. К 500 г концентрата биомассы Bacillus mucilaginosus с содержанием сухих веществ 10% прибавили 500 мл дистиллированной воды. Полученную смесь довели до кипения и прокипятили 10 мин. Затем охладили до 45^oC, довели pH до 7,8 25%-ным раствором аммиака, добавили 1г панкреатина, 10 мл хлороформа в качестве консерванта, поместили в термостат при 45^oC на 3 суток, 3-4 раза в течение суток смесь перемешивали. По истечение 3 суток смесь центрифугировали 15 мин при 10 тыс. об/мин. Получили 0,8 л прозрачного ферментативного гидролизата, содержащего, как показал анализ, 5% сухих веществ, 350 мг% аминного азота /7% а.с.в./ и 800 мг% общего азота /16% а.с.в./.

Полученный ферментативный гидролизат хранился жидким при 5-8^oC до 1 года при добавлении консерванта /например, хлороформа/ 0,1% или высушивался одним из известных способов /распылительно, лиофильно, в псевдоожиженном слое/.

Выращивание культуры E. coli BL-21 проводили в колбах объемом 250 мл на качалке при 120 об/мин. Объем среды в колбах 25 мл, объем посевного материала 1 мл, температура выращивания 37^oC, pH среды 7,2, время выращивания 6,5 ч. Для приготовления сред использовали различные белковые гидролизаты /пептоны/ в концентрации 1% /10 г/л а.с.в./. Результаты эксперимента представлены в табл.1.

Пример 2. На основе полученного /по периметру 1/ ФГ Bac. mucilaginosus были приготовлены питательные среды для роста различных микроорганизмов. Так, препарат был успешно использован для замены импортного пептона в составе LB-среды для генетических исследований.

Проводили выращивание культур E. coli BL-21, Bac. micoides, Sacch. cerevisiae. Для приготовления контрольных питательных сред использовали наиболее эффективный пептон фирмы Serva. Среднестатические результаты серий опытов и условия культивирования представлены в табл.2 и 3. В качестве посевной среды использовали контрольные среды.

Использование: в биотехнологии при производстве препаратов и сред для выращивания микроорганизмов. Сущность изобретения: проводят термическую обработку биомассы Bacillus mucilaginosus при 95-105^oC, охлаждают и ведут гидролиз 0,1% панкреатином в течение 2-х суток при 43-46^oC.3 табл.

Способ получения азотосодержащего компонента питательной среды, предусматривающий термическую обработку в водной среде биомассы Bacillus mucilaginosus, охлаждение и ферментный гидролиз при pH 7,8 8,0, отличающийся тем, что термическую обработку ведут при 95 105^oC не менее 5 мин, а ферментативный гидролиз ведут 0,1% ным панкреатином в течение двух суток при 43 46^oC.