СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГИДРОЛИЗАТА СОИ Российский патент 2007 года по МПК A23J1/14 A23J3/16 A23J3/34 

Изобретение относится к медицине, а именно к медицинской микробиологии, и может быть использовано для культивирования широкого спектра микроорганизмов, а также для приготовления микробиологических питательных сред различного назначения.

Известно, что питательными основами большинства микробиологических сред являются белковые гидролизаты, содержащие комплекс веществ, необходимых для нормального развития микробной популяции.

Известны способы получения питательных основ путем ферментативного гидролиза белкового сырья. Недостатками указанных способов являются использование в качестве сырья дорогостоящих продуктов (мясо, рыба, казеин), трудоемкость процесса, большое количество технологических операций (7, 9, 10, 11, 12, 13).

Известно использование гидролизатов сои в качестве питательной основы в составе триптиказо-соевого бульона и агара, сред для выделения анаэробов, грибов, стрептококков, пневмококков, менингококков (1, 2, 3). Рекомендован Европейской фармакопеей и фармакопеями США, Франции (4, 5, 6). В РФ в виду отсутствия коммерческого выпуска гидролизата сои указанные среды не выпускаются, что снижает качество бактериологических исследований. Наиболее близким к предлагаемому по совокупности признаков и достигаемому эффекту является способ получения гидролизата сои, включающий смешивание сои с водой и ферментацию суспензии с помощью поджелудочной железы в течение 7-10 суток в присутствии хлороформа (8).

Недостатками указанного способа являются длительность процесса гидролиза, низкая степень очистки гидролизата от негидролизованного белка, приводящая к помутнению и образованию осадка, что практически исключает использование данного гидролизата в составе питательных сред без дополнительной очистки, а также большой расход ферментного препарата.

Кроме того, гидролизат, полученный указанным способом, не содержит пептонов, которые являются основными источниками азота и углерода для хемоорганотрофных микроорганизмов (14).

Предлагаемым изобретением решаются задачи - сокращение длительности процесса гидролиза сои, повышение степени очистки целевого продукта, удешевление процесса и получение гидролизата с высоким содержанием пептонов.

Для достижения названного технического результата в предлагаемом способе получения гидролизата сои соевую муку смешивают с водой при гидромодуле 1:6,5-1:7,5, суспензию кипятят в течение 5-10 мин или выдерживают при 70-90°С в течение 15-30 мин, затем разбавляют водой до гидромодуля 1:13-1:15, подщелачивают до pH 7,8-8,2, вносят 30-40% поджелудочной железы или 3-4% панкреатина от массы сырья и ферментируют в течение 3-6 час при температуре 48-50°С, после чего гидролизат подкисляют до pH 4,2-4,5, кипятят 5-10 мин и фильтруют, фильтрат подщелачивают до pH 8,3-8,6, нагревают до 60-80°С, выдерживают при данных температурах в течение 15-30 мин, охлаждают до температуры 20-40°С, фильтруют, подкисляют до pH 7,2-7,5, концентрируют и высушивают.

Отличительные признаки предлагаемого способа от указанного выше известного, наиболее близкого к нему, заключаются в следующем: суспензию соевой муки перед гидролизом предварительно подвергают тепловой обработке; разбавляют водой; подщелачивают; ведут гидролиз в течение 3-6 час в отсутствии хлороформа; очистку гидролизата осуществляют в кислых и щелочных условиях; щелочной гидролизат подвергают тепловой обработке; гидролизат охлаждают, фильтруют, подкисляют, концентрируют и высушивают.

Тепловая обработка суспензии соевой муки инактивирует содержащиеся в сое ингибиторы ферментов поджелудочной железы, в частности трипсина и химотрипсина. В сое содержится пять и более ингибиторов трипсина в количестве 5-10% от общего содержания белка (15), которые подавляют действие протеаз. Кроме того, тепловая обработка денатурирует белки, которые лучше поддаются действию протеолитическим ферментам, чем нативные (16), и способствует получению гидролизатов с высоким содержанием пептонов.

Разбавление суспензии соевой муки после термической обработки снижает вязкость и степень гидратации, что способствует не только лучшему отделению жидкой фазы в процессе последующих фильтраций, но и обеспечивает снижение потерь гидролизата.

Подщелачивание суспензии соевой муки перед внесением поджелудочной железы или панкреатина обеспечивает оптимум рН для действия протеаз поджелудочной железы, что позволяет сократить расход ферментного препарата. В известном способе расход поджелудочной железы составляет 75% от массы сырья, а в заявляемом - 30-40%, что способствует удешевлению процесса.

Очистка гидролизата при различных значениях pH сначала при 4,2-4,5, а затем при pH 8,3-8,6 и последующая термообработка и фильтрация щелочного гидролизата при температуре 20-40°С способствует полному удалению остаточных белков, растворимых при повышенных температурах.

Только указанный интервал pH и температур при фильтрации щелочного гидролизата обеспечивают его высокую прозрачность. Величина pH гидролизата ниже 8,3 и выше 8,6 не обеспечивают полного осаждения непрогидролизованных белков и соответственно высокую прозрачность гидролизата.

При температуре выше 40°С происходит растворение остаточных белков, которые при охлаждении и дальнейшей переработке гидролизата выпадают в осадок, что ухудшает его качество. При температуре ниже 20°С повышается вязкость гидролизата, при этом резко снижается скорость фильтрации, что сказывается на технологичности процесса. Кроме того, не исключено обсеменение гидролизата микроорганизмами, приводящее к помутнению, что делает его непригодным для дальнейшего использования. Подкисление гидролизата перед высушиванием до pH 7,2-7,5 обеспечивает оптимум pH для роста большинства бактерий.

В целом совокупность отличительных признаков обеспечивает сокращение длительности гидролиза (с 7-10 дней по известному способу до 3-6 час по предлагаемому), получение гидролизата высокой степени прозрачности с высоким содержанием пептонов, что является одним из важных показателей качества гидролизатов, используемых для получения питательных сред, а также удешевление процесса за счет сокращения расхода ферментного препарата и длительности процесса гидролиза. Сухая форма улучшает потребительские свойства препарата.

Способ осуществляется следующим образом.

Пример 1. К 100 кг соевой муки добавляют 650 л воды, смесь перемешивают до получения однородной суспензии, нагревают до кипения и кипятят в течение 5-10 мин, затем добавляют еще 650 л воды и охлаждают до 48-50°С. Суспензию подщелачивают 30% раствором едкого натрия до pH 7,8-8,2, вносят 30 кг поджелудочной железы или 3 кг панкреатина и ведут гидролиз в течение 3-х час при температуре 48-50°С. После окончания гидролиза гидролизат подкисляют соляной кислотой до pH 4,2, кипятят 5-10 мин и фильтруют. Фильтрат подщелачивают до pH 8,3, выдерживают при температуре 60°С в течение 30 мин, фильтруют, подкисляют до pH 7,3, концентрируют до 10-18% сухих веществ и высушивают известным способом, например с помощью распылительной сушки при температуре на входе в сушилку 160-180°С, на выходе - 90-100°С.

Пример 2. Отличается от примера 1 тем, что к 100 кг соевой муки добавляют 700 л воды, а после термической обработки добавляют еще 700 л воды, далее согласно примеру 1.

Пример 3. Отличается от примера 1 тем, что после подщелачивания к суспензии добавляют 35 кг поджелудочной железы или 3,5 кг панкреатина, далее согласно примеру 1.

Пример 4. Отличается от примера 1 тем, что гидролиз ведут в течение 5 час, далее согласно примеру 1.

Пример 5. Отличается от примера 1 тем, что после смешивания соевой муки с водой суспензию выдерживают при температуре 80°С в течение 20 мин, далее согласно примеру 1.

Пример 6. Отличается от примера 1 тем, что после окончания гидролиза гидролизат подкисляют до рН - 4,5, далее согласно примеру 1.

Пример 7. Отличается от примера 1 тем, что гидролизат после подкисления и фильтрации подщелачивают до рН - 8,6, выдерживают при температуре 75°С в течение 15 мин, далее согласно примеру 1.

Пример 8. Отличается от примера 1 тем, что после подщелачивания гидролизат охлаждают до 40°С, далее согласно примеру 1.

Полученный по предлагаемому способу сухой гидролизат содержит 2,5±0,2% аминного азота, 10±2% общего азота, 20±3% углеводов,70±5% пептонов,0,7±0,1% триптофана, pH 2% раствора - 7,0-7,1.

Наличие в гидролизате комплекса питательных веществ в виде аминокислот, углеводов и особенно пептонов (в известном способе пептоны отсутствуют) характеризует его как высокопитательную основу для культивирования широкого спектра микроорганизмов, что подтверждают данные бактериологических исследований.

Бактериологический контроль качества гидролизата сои осуществляют на модели питательного бульона.

Полученный сухой гидролизат сои в количестве 25-30 г растворяют в 1 л дистиллированной воды, нагревают до кипения, разливают в пробирки по 10 мл и стерилизуют 15 мин при 115°С.

Контроль качества препарата осуществляют путем посева различных доз тест-штаммов: S.Dick 1, S.faecalis 775, S.epidermidis 14990, S.pneumoniae LD, S.typhi Hx901, S.flexneri 1a, S.aureus Wood 46, S.typhimurium 79, P.aeruginosa 27/99, E.coli 3912, C.xerosis 1911, S.sonnei S-form, K.pneumoniae 5534, B.cereus 2010, L.monocytogenes 56, S.marcescens 1, E.aerogenes 1006, C.freundii 101/57, Pr.vulgaris Hx19, C.albicans 885.

Учет результатов производят через 20-48 ч инкубации посевов при 37°С.

В таблице представлена характеристика роста тест-штаммов микроорганизмов на гидролизате сои, полученном по предлагаемому способу.

Таблица
Рост тест-штаммов на гидролизате сои, полученном предлагаемым способомТест-штаммыПосевная доза, м.кл.Скорость роста, чНаблюдаемый эффектS.Dick 110036-40придонный ростS.faecalis 77510020-22помутнениеS.epidermidis 1499010020-22диффузное помутнениеS.typhy H90110020-22диффузное помутнениеS.fleexneri 1a10018-20диффузное помутнениеS.aureus Wood-4610020-22диффузное помутнениеS.typhimurium 7910018-20диффузное помутнениеC.albicans 88510040-48диффузное помутнение, наличие осадкаB.cereus 201010018-20хлопьевидный осадок, образование пленкиC.xerosis 191110036-48диффузное помутнениеS.sonnei S-form10018-20диффузное помутнениеL.monocytogenes 5610020-24диффузное помутнениеC.freundii 101/5710018-20диффузное помутнениеS.marcescens 110018-20диффузное помутнениеP.aeruginosa 27/991018-20диффузное помутнение, образование пленкиE.coli 39121018-20диффузное помутнениеK.pneumoniae 35341018-20диффузное помутнениеE.aerogenes 10061018-20диффузное помутнениеP.vulgaris HX191018-20диффузное помутнение

Из таблицы видно, что гидролизат сои обладает высокой чувствительностью по отношению к штаммам, относящимся к различным семействам, способен улавливать в короткие сроки минимальные количества микроорганизмов, что указывает на его высокие ростовые свойства.

Способ прост в выполнении, не требует дополнительных затрат, позволяет получить высококачественную питательную основу, а сухая форма препарата обеспечивает стандартность, удобство при использовании и хранении. Способ легко воспроизводим и может быть внедрен на предприятиях, выпускающих питательные среды.

Источники информации

1. Culture media manual ′Bio Merieux′, 1994, c.21, 24, 57, 60, 68, 69.

2. The 'Oxoid′ manual. 1982, c.275-276, 314-315.

3. Microbiology manual ′Merck′. 1990, c.72, 77, 86, 181, 212.

4. United States Pharmacopeia XXII. ′Microbial limited test′, 1990.

5. European Pharmacopeia II chapter VII-10, 1980.

6. Pharmacopee Francaise X (1986).

7. Руководство по микробиологии, клинике и эпидемиологии инфекционных болезней. Под ред. И.И.Жукова-Вережникова. М., 1962, т.1, с.342-354.

8. Там же. С.350 (прототип).

9. Способ изготовления гидролизной питательной среды. Авторск. свид. №171088, опубл. 11.05.65. Бюллетень №10.

10. Физико-химические методы контроля ингредиентов, питательных сред и биопрепаратов. М., 1970, с.63-64.

11. Основа для выращивания микроорганизмов. Авторск.свид. №548624, С 12 К 1/06, опубл. 28.02.77. Бюллетень №8.

12. Способ получения белкового гидролизата. Авторск. свид. №562284, С12 К 1/06, опубл. 15.03.78. Бюллетень №21.

13. Способ получения питательной основы. Авторск. свид. №662583, опубл. 15.05.79. Бюллетель №18.

14. Красильников А.П. Микробиологический словарь-справочник. Минск, 1986, с.228.

15. Толстогузов В.Б. Новые формы белковой пищи. М., 1987, с.71.

16. Технология ферментативного гидролиза белкового сырья. Обзор. Серия 5. Получение и применение ферментов, аминокислот, витаминов. М., 1982. Вып.2, с.12.

Изобретение относится к медицине, а именно к медицинской микробиологии, и может быть использовано для культивирования широкого спектра микроорганизмов. В предлагаемом способе соевую муку смешивают с водой при гидромодуле 1:6,5-1:7,5, кипятят 5-10 мин или выдерживают при 70-90°С в течение 15-30 мин. Разбавляют водой до гидромодуля 1:13-1:15, подщелачивают до pH 7,8-8,2, ферментируют с помощью поджелудочной железы или панкреатина в течение 3-6 час при 48-50°С. После окончания процесса ферментации гидролизат подкисляют до pH 4,2-4,5, кипятят, фильтруют, фильтрат подщелачивают до pH 8,3-8,6, нагревают до 60-80°С, выдерживают 15-30 мин, охлаждают до 20-40°С, фильтруют, подкисляют до pH 7,2-7,5, концентрируют и высушивают. Предлагаемый способ обеспечивает сокращение длительности гидролиза, получение гидролизата высокой степени очистки и с высоким содержанием пептонов. 1 табл.

Способ получения гидролизата сои, характеризующийся тем, что соевую муку смешивают с водой при гидромодуле 1:6,5-1:7,5, суспензию кипятят в течение 5-10 мин или выдерживают при 70-90°С в течение 15-30 мин, затем разбавляют водой до гидромодуля 1:13-1:15, подщелачивают до pH 7,8-8,2, вносят 30-40% поджелудочной железы или 3-4% панкреатина от массы сырья и ферментируют в течение 3-6 ч при температуре 48-50°С, после чего гидролизат подкисляют до pH 4,2-4,5, кипятят 5-10 мин и фильтруют, фильтрат подщелачивают до pH 8,3-8,6, нагревают до 60-80°С, выдерживают при данных температурах в течение 15-30 мин, охлаждают до температуры 20-40°С, фильтруют, подкисляют до pH 7,2-7,5, концентрируют и высушивают.