Штамм бактерий BacILLUS SUвтILIS как тест-культура для испытания алюминиевых сплавов на биостойкость Советский патент 1989 года по МПК C12N1/20 C12Q1/18 C12N1/20 C12R1/125 

1

Изобретение относится к биотехнологии и касается нового штамма бактерий, который может быть использован для определения бактериальной стойкости металлических материалов, а именно алюминиевых сплавов.

Цель изобретения - новый штамм бактерий, обладающий более высокой коррозионной активностью.

Штамм выдачей из продуктов коррозии -алюминиевого сплава Д-16Т, отобранных с силового элемента конструкции техники, эксплуатировавшейся в тропическом районе.

Полученный штамм B.subtilis ВКМВ- 1647Д (27Б) имеет следующие характеристики.

Морфолого-культуральные признаки. После 24 ч инкубации на мясо-пептон- яом агаре (МПА) при 30 С вегетативные клетки имеют форму прямых ровных палочек с тупыми концами, на соединенных в цепи. Размеры 0,7 - 0,3x2- 3 мм. Клетки грамположительные, подвижные .

В клетках, выращенных на МПА+2% глюкозы, внутриклеточные гранулы, неокрашиваемые фуксином, не обнаружены.

Капсулы у клеток на обнаружены.

Образуют эллипсовидные споры, по одной в клетке, занимающие центрально-терминальное положение (среда МПА, 30 С, возраст культуры 7 сут). Спорангий не раздут. Размеры спор 0,8 - 0,9 х 2,1 - 2,3 мкм.

При нагревании до 80 °С в течение 10 мин споры сохраняют способность к прорастанию.

На МПА (48 ч. инкубации при 30°С) культура образует плоские колонии,

круглые ипи неправильной формы, гряз- но-бепого цвета, непрозрачные. Край колоний нечеткий, поверхность матовая, структура в центре зернистая, консистенция мягкая. Диаметр колоний 8-12 мм. Обратная сторона колоний также грязно-белого цвета. Флуоресценция не обнаружена, пигментов в среду не выделяют.

На картофельном агаре через 48 ч инкубации при 30°С поверхность колоний становится складчатой, коричневатого цвета.

При росте в мясо-пептонном бульо-1 не МПБ (30СС, инкубация 48 ч) на поверхности образуют толстую складчатую пленку грязно-белого цвета, вызывают помутнение среды и изменение рН от 7,0 до 6,0. Выпадения осадка и роста по стенке пробирки не наблюдалось .

Физиолого-биохимические признаки. Гетеротрофы, аэробы. Температурный оптимум 30 - 35°С, минимум 5еС, мак- симум 55°С. Активно растут при рН 5,5-8,5 (оптимум 7,0).

В МПБ с 7%-ной NaCl вызывают помутнение раствора. Усваивают глюкозу и ксилозу с образованием кислоты, а газ не образуют. Маннит и арабинозу усваивают очень слабо. Активно используют цитрат, в меньшей степени пропинат.

Нитраты восстанавливают до нитритов. Каталазо-положительны. Реакция Вогес-Проскауэра положительная. На среде с триптофаном индол не образую Крахмал и казеин гидролизуют. Желатину разжижают (мешковидное разжижение). Тирозин не разлагают. Уреазная активность выражена слабо. Фенилал- аниндезаминазу не образуют. Лецитиназной активностью не обладают. i

Вызывают коррозию изделия из алю-

миниевых сплавов при непосредственно контакте с ними. Наибольшая коррозионная активность проявляется при культивировании на среде БСА (1 ч МПА + 1 ч СА) при 22-24°С. .

Антагонистические свойства по отношению к другим культурам, выделенным в тех же условиях, отсутствуют.

Хранение штамма осуществляют в ли офильно-высушенном состоянии в сте- рильных ампулах. Непродолжительное время (до 4 мес. без пересева) может храниться в холодильнике в пробирках с агаризованной средой.

Q

j 0

5

0

5

0

5

5

0

Культура не является патогенной.

Пример 1. Выделение штамма. 0,1 г измельченных в ступке продуктов коррозии алюминиевого сплава, содержащих споры штамма В. sibtil is ВКМВ-1647Д, переносят с соблюдением стерильности в чашку Петри с застывшим МПА и тщательно растирают шпателем. Затем этим же шпателем протирают поверхность МПА последовательно во 2-й, 3-й и 4-й чашках. Чашки закрывают крышками и инкубируют в термостате при 30°С в течение 2-3 сут. Обычно в первых двух чашках после инкубации наблюдают сплошной рост микроорганизмов, тогда Л ак в последующих - изолированные колонии.

Для получения чистой культуры используют метод Коха. Часть бактериальной массы из изолированной колонии переносят микробиологической петлей на поверхность МПА в чашке Петри, распределяют шпателем по поверхности МПА во 2-й, 3-й и 4-й чашках, как это описано выше, и инкубируют при 30 С в течение 2-3 сут. Пересев повторяют 1-2 раза. Полученную культуру проверяют на чистоту путем визуальной оценки, микроскопирования и посевом на сусло-агар (СА) с последующей инкубацией при 30 С в течение 10-12 сут (для выявления микологических загрязнений). Чистую культуру переносят в пробирку со скошенной средой МПА и инкубируют 2- 3 сут при 30 С,

Полученную культуру используют для заражения питательной среды при оценке бактериальной стойкости алюминиевых сплавов.

Пример 2. Оценка бактериальной стойкости алюминиевых сплавов. Испытания проводят контактным методом, сущность которого состоит в выдерживании образцов металлов на поверхности агаризованной среды, ино- кулированной тест-культурой.

Расплавленную среду БСА разливают в чашки Петри и дают застыть. Чашки со средой слегка подсушивают для удаления конденсационной воды. На поверхность среды в каждую чашку помещают небольшое количество (1 микробиологическую петлю бактериальной массы В.subtil is ВКМВ-1647Д за 2- 3-суточной культуры и растирают шпателем. Культуру инкубируют при 22 - 24° С. Через 2-3 сут, когда в чашках наблюдается сплошной рост бактерий, на их поверхность кладут образцы из алюминиевого сплава, размером П0х15х2 мм. Образцы предварительно обрабатывают следующим образом: двухкратно промывают в ацетоне, высушивают Не. воздухе, затем протирают ватным тампоном, смоченным этиловым спиртом, и фламбируют (несколько раз обжигают над пламенем горелки). Количество образцов должно быть не менее 5 ч. Контролем служат такие же образцы, помещенные на поверхность стерильной среды БСА.

Чашки помещают в эксикатор, в котором поддерживается влажность 96- 98% за счет налитой на дно эксикатора стерильной дистиллированной воды для предотвращения высыхания среды.

Продолжительность экспозиции опыт- ных и контрольных образцов 60 сут, при 22 - 24°С. По окончании испытаний образцы извлекают из чашек Петри и дезинфицируют в 5%-ном растворе фенола или формальдегида в течение 3 ч. Затем образцы с помощью скальпеля очищают от продуктов коррозии, промывают в этиловом спирте, высушивают и проводят исследование их поверхности на профилеграфе.

0

5

0

5

Бактери.остойкость материала обратно пропорциональна площади пораженной поверхности образцов.

В таблице представлены в сравнении результаты испытаний на бактериостой- кость образцов из алюминиевого сплава Д-16Т с использованием в качестве тест-культур штаммов B.subtilis ВКМВ- 1647Д и B.subtilis BKMB-428.

Испытания показали, что при использовании в качества тест-культуры предлагаемого штамма площадь пораженной поверхности образцов за тот же промежуток времени возрастала в 2 раза и более, а первые очаги коррозии появлялись на 7-10 сут раньше, что подтверждает его большую активность. Контрольные образцы коррозии не подвергались.

Использование активного штамма В;subtilis BKMB-1647D в качестве тест-культуры повышает достоверность оценки бактериальной стойкости алюминиевых сплавов.

Формула изобретения

Штамм бактерий Bacillus subtilis 20 BKMB-1647D как тест-культура для испытания алюминиевых сплавов на биостойкость .

Изобретение касается биотехнологии, а именно нового штамма бактерий, который может быть использован для определения бактериальной стойкости алюминиевых сплавов. Целью изобретения является новый штамм бактерий BAC SUBTILIS ВКМ В=1647D (27 Б), обладающий более высокой коррозионной активностью. Штамм выделен из продуктов коррозии алюминевого сплава Д=16Т и способен в течение 60 сут при 22-24°С осуществлять на 50% деструкцию материала. 1 табл.