Штамм гриба реNIсILLIUм caNeSceNS - продуцент @ -галактозидазы Советский патент 1992 года по МПК C12N9/38 C12N1/14 

Изобретение относится к микробиологической промышленности в частности к производству ферментов, а мменно к штамму - продуценту внеклеточной ft - галакто- зидазы.

Фермент ft -галактозидаза, получаемый на основе микробиологического синтеза, находит применение в ряде отраслей пищевой промышленности для гидролиза лактозы, а также используется в медицине и фармакологической промышленности.

Известны применяемые в качестве продуцентов ft -галактозидазы различные виды бактерий, актиномицетов, дрожжей и мицелиальных грибов. Последняя группа микроорганизмов наиболее перспективна для промышленного использования, поскольку продуцируемая грибами ft -галактозидаза проявляет свою активность при низких значениях рН среды, что соответствует условиям ее применения.

Известны также грибные продуценты PaecMomyces varlotl. Sclerotium sp. Cortlcium rolfsil, Chaetomella raphigera, Alternaria temnls, Culrularla Inaqualis. несколько видов аспергиллов: A. oryzae, A. nlger, A. foetldus, A. awamorl, а также ряд видов пенициллов: Penlclllium terel, P. cltrlnum, P. canescens, P. multicolor.

Недостатком этих продуцентов ft -галактозидазы является низкая активность штаммов,

Известен штамм Peniclllium canescens 20171 (ВКПМ F-178), выделенный из приVI

СО 00 00

ел

4

родной среды и способный в процессе роста на жидкой питательной среде с соевой мукой и минеральными солями продуцировать внеклеточную ft -галактозидазу в количестве 18-20 ед./мл культуральной жидкости. Активность фермента определена путем гидролиза 0-нитрофенил- -В- D- галактопиранозида (ОНФГ) при 30 С в течение 15 мин.

Известны способы увеличения продуктивности штамма 20171 при его культивировании на средах иного состава, в частности, предлагается среда, содержащая свекловичный жом и белково-витаминный концентрат (Б В К), на которой продуктивность штамма 20171 за 96 ч роста достигает 42 ед./мл. Замена в среде свекловичного жома тыквенными или томатными выжимками позволяет увеличить активность штамма до 65-70 ед./мл.

Недостатком штамма 20171 является низкий уровень его активности.

Известен продуцент ft -галактозидазы Penictlllum multicolor KU-0-132 (PERM- P4375, АТСС 20539), образующий в условиях глубинной ферментации в течение 72 ч роста на питательной среде, содержащей в качестве основных компонентов рисовые отруби и муку из семян хлопчатника, а также минеральные соли, 140 ед./мл ft -галактозидазы (активность фермента определена путем гидролиза ОНФГ при 37°С).

Штамм P. multicolor KU-0-132 среди известных грибных продуцентов обладает на- иболее высокой активностью ft -галактозидазы, однако она достигается при культивировании штамма на среде с мукой из семян хлопчатника, которая является трудно доступным сырьем, и проявляется при более высокой температуре реакции определения (37°С).

Известен также штамм P. canescens ТК-85, представляющий собой мутант, полученный под действием ультрафиолетовых лучей из штамма 20171. Штамм ТК-85 характеризуется быстрым ростом на агаризо- ваиных средах и слабым замедленным конидиеобразование,м. При культивировании на жидкой питательной среде с соевой мукой и минеральными солями в течение 72 ч активность внеклеточной / -галактозидазы штамма ТК-85 составляет 60 ед./мл культуральной жидкости (гидролиз ОНФГ при 30°С).

Недостатком штамма P. canescens TK - 85 является низкий уровень синтеза ft -га- лакхозидазы.

Наиболее близким к предлагаемому по совокупности признаков (вид продуцента,

общее происхождение, способность продуцировать фермент при росте на средах, с доступным непищевым сырьем) является штамм Penlcllllum canescens 20171 (ВКПМ

F-178). Штамм F-178 при культивировании на средах со свекловичным жомом и БВК, с тыквенными или томатными выжимками и дрожжами образует соответственно 42 или 65-70 ед./мл ft -галактозидазы.

Недостатком известного штамма F-178 является низкий уровень активности.

Цель изобретения - повышение уровня накопления ft -галактозидазы в культуральной жидкости.

Поставленная цель достигается созданием штамма Penicllllum canescens ДГ- 86/18. Новый штамм Peniclllium canescens ДГ-86/18 при росте на жидкой питательной

среде, содержащей свекловичный жом и белково-витаминный концентрат, при 30°С в течение 120-144 ч накапливает в культуральной жидкости ft -галактозидазу с активностью 134 ед./мл при определении по

гидролизу ОНФГ при 30°С, что составляет 160 ед./мл при определении тем же методом при 37°С.

Предлагаемый штамм Penicilllum canescens ДГ-86/18 получен в результате

многоступенчатой селекции с применением мутагенных факторов и отбора на средах с 2-дезоксиглюкозой из природного изолята - штамм Penlcllllum canescens 20171 (ВКПМ F-178). Штамм P. canescens ДГ-86/18 депонирован во Всесоюзной коллекции промышленных микроорганизмов института ВНИИгенетика под номером ВКПМ F-436. От известных продуцентов штамм ДГ- 86/18 отличается высоким уровнем накопления ft -галактозидазы при росте на жидкой питательной среде с непищевым сырьем, а также рядом культурально-морфо- логических и физиолого-биохимических признаков.

Культурально-морфологические признаки.

Сусло-агар (10 сут роста, 29°С). Диаметр колоний равен 7,5-7,8 см. Поверхность и край колоний ровные. Воздушный мицелий

белый, вокруг центра плотно переплетенный, ближе к периферии колоний пушистый. Конидиеобразование в центре колоний скудное и более обильное на периферии колоний. Конидии серо-голубого цвета. Обратнэя сторона колоний темно-коричневая.

Агаризованная среда Роулен-Тома с сахарозой и добавлением кукурузного экс- тракта(10 сут роста, 29°С). Диаметр колоний 6,2-6,5 см. Край колоний ровный. Воздушный мицелий в центре колоний пушистый,

далее стелющийся. Конидиеобразование умеренное. Конидии светло-серые с голубоватым оттенком, по краю колоний голубые. Образуются равномерно по всей поверхности колоний. Обратная сторона колоний складчатая, темно коричневая.

Агаризованная среда Чапека с глюкозой и добавлением кукурузного экстракта (10 сут роста. 29°С). Диаметр колоний равен 5,0-6,0 см. Воздушный мицелий пушистый, местами приподнимающийся. Край колоний ровный. Конидиеобразование, кроме края, слабое. Конидии палевого оттенка, по краю колоний голубые. Обратная сторона колоний слабо складчатая, темно-коричневая.

Агаризованная среда Роулен-Тома с сахарозой (10 сут роста, 29°С). Диаметр колоний 4,0-4,5 см. Край колоний ровный. Воздушный мицелий войлочный. Конидиеобразование скудное. Конидии кремового оттенка, по краю колоний голубые. Обратная сторона колоний слабо складчатая, светло-желтого цвета.

Агаризованная среда Чапека с глюкозой (10 сут роста, 29°С). Диаметр колоний равен 1,8-2,0 см. Край колоний неровный, лопастной. Поверхность колоний пыпуклая, гладкая. Воздушный мицелий белый, плотно переплетенный. Конидии темного серо- голубого цвета, образуются в основном по краю колоний. Обратная сторона колоний не складчатая или имеет слабо намеченные крупные складки, не окрашена.

Физиолого-биохимические признаки.

Мезофил, растет при 25-37°С, оптимальная температура роста 29°С. Желатину разжижает слабо, молоко полностью не коагулирует вплоть до 30 сут инкубации. Нитраты восстанавливает полностью к 10 сут роста.

Отношение к источникам углерода. Хорошо усваивает моно-, ди- и полисахариды, в том числе глицерин и крахмал. При росте на глюкозе, фруктозе, сахарозе, мальтозе, маннозе, глицерине образует ярко-желтый или коричневый пигмент.

Отношение к источникам азота. Хорошо усваивает аммонийный азот, пептон, мочевину, кукурузный экстракт.

Генетические особенности (ауксотроф- ность) - прототроф. Штамм непатогенен.

Сравнение культурально-морфологиче- ских и физиолого-биохимических признаков нового штамма Peniclllium canescens ДГ- 86/18 и известного штамма Penlclllium canescens 20171 приведено в табл. 1.

При культивировании на среде со свекловичным жомом, БВК и KH2PQ4 в глубинных условиях через 120-144 ч роста штамм

ДГ-86/18 накапливает в культуральной жидкости /3 - галактозидазу, активность которой составляет 100-130 ед./мл (гидролиз ОНФГ при 30°С) или 140-160 ед./мл (гидролиз ОНФГ при 37°С).

Наряду с ft -галактозидазой, штамм Р. canescens ДГ-86/18 при культивировании на указанной выше среде синтезирует ряд других внеклеточных гликозидаз с активностями, ед./мл:

Карбоксиметилцеллюлаза32-35

Целлобиаза5-9

а -Амилаза2-3

Глюкоамилаза0,7-1,2

Пример. Для получения исходного посевного материала культуру штамма ДГ- 86/18 и известного штамма 20171 выращивают на скошенной агаризованной среде Роулен-Тома с добавлением 1 % кукурузного экстракта W/V) при 28-30°С в течение 4-5 сут, после чего выдерживают при ком- натной температуре в течение 2-3 сут.

Засев ферментационной среды осуществляют либо водной суспензией конидий, содержащей (2-5) хЮ6 конидий/мл, либо кусочком культуры на скошенном агаре разме- ром 1 см .

Процесс ферментации проводят в колбах Эрленмейера емкостью 750 мл, содержащих 50 мл жидкой питательной среды следующего состава, мас.%: Размельченный

свекловичный жом3,0

Белково-витаминный

концентрат5,0

Фосфорнокислый однозамещенный калий2,5

Водопроводная вода

рН среды после

стерилизации натуральный.

Питательную среду засевают одним из указанных выше способов и инкубируют при 30°С на круговой качалке, вращающейся со скоростью 240-250 об/мин.

Полученную культуральную жидкость для отделения мицелия и твердых остатков среды центрифугируют. Активность /3-га- лактозидазы определяют в супернатанте.

Оценку активности ft- галактозидазы осуществляют обычным методом, используя в качестве субстрата ОНФГ.

Реакционную смесь, содержащую 1,5 мг ОНФГ в 4 мл 0,15 М цитратно-фосфатного буфера, рН 4,2, и 1 мл супернатанта в соответствующем разведении, инкубируют 15 мин при 30 или 37°С, после чего к 1 мл реакционной смеси добавляют 1 мл 1М раствора карбоната натрия и 1 мл дистиллированной воды.

Интенсивность окраски полученного раствора 0-нитрофенола определяют при длине волны 420 нм.

За единицу активности ft -галактозида- зы принимают количество фермента, которое освобождает из субстрата 1 мкмоль 0-нитрофенола в 1 мин при данных условиях реакции.

В табл. 2 приведены уровни активности / -галактозидазы после 120 и 144 ч культивирования в равных условиях штаммов Penlcillium canescens ДГ-86/18 и 20171 при температуре реакции определения 30°С.

Средние активности ft -галактозидазы тех же культуральных жидкостей штаммов ДГ-86/18 и 20171 в условиях определения

при 30°С соответственно составляют 134,0

и 87,0 ед./мл, а при 37°С 160.0 и 98,0 ед./мл.

Указанные выше уровни активностей

/ -галактозидазы предлагаемого штамма

Penlcilllum canescens ДГ-86/18 (ВКПМ F- 436) и известного штамма Penlcilllum canescens 20171 (ВКПМ F-178) показывают, что штамм F-436 является более активным и более экономичным, поскольку он обеспечивает в единичном процессе выход фермента на стадии культивирования в 1,5 раза выше, чем известный штамм F-178, что. в свою очередь, определяет соответствующую экономию сырьевых, энергетических и

трудовых ресурсов в производстве. Формула изобретения Штамм гриба Penlcilllum canescens ВКПМ F-436- продуцент ft -галактозидазы.

Использование: биотехнология. Сущность изобретения: штамм F-436 получен из штамма Penlclllium canescens 20171 (ВКПМ F-178) путем многоступенчатой селекции с применением мутагенных факторов и отбора в селективных условиях. При глубинном культивировании на питательной среде, содержащей 3% свекловичного жома, 5% бел- ково-витаминного концентрата и 2,5% однозамещенного фосфорнокислого калия, через 120-144 ч роста при 30°С штамм ВКПМ F-436 накапливает в культуральной жидкости внеклеточную ft -галактозидазу, активность которой составляет: 100-130 ед./мл (гидролиз ОНФГ при 30°С), 140-160 ед./мл (гидролиз ОНФГ при 37°С), 62-68 ед./мл (гидролиз лактозы при 30°С). От известных продуцентов той же тоаксономиче- ской группы штамм ВКПМ F-436 отличается рядом культурально-морфологических и фи- зиолого-биохимических признаков. 2 табл. Ё

Среда

Штамм ДГ-86/18 (F-436)

Чапека с глюкозой, роста

с различными углево

ренное молоко

на, 20%

с нитратом натрия

Диаметр колоний 18-20 мм; колонии выпуклые, гладкие; воздушный мицелий белый, плотно переплетенный; край колоний неровный; конидии темного серо-голубого цвета, расположены в основном по краю колоний; обратная сторона колоний гладкая или слабо складчатая, не окрашена

Хорошо усваивает моно-ди - и полисахариды, в том числе глицерин,крахмал; при росте на глицерине, фруктозе, сахарозе глюкозе, мальтозе, ман- нозе образует желтый или коричневый пигмент Полностью не коагулирует вплоть до 30 сут роста

Разжижает слабо

Нитраты восстанавливает полностью к 10 сут роста

Таблица 1

1 j

Штамм 20171 (F-178)

Диаметр колоний 36-38 мм; воздушный мицелий в центре пушистый, далее стелющийся; край колоний ровный; конидиеобразование обильное; конидии серые, по краю колоний темно-голубые; обратная сторона колоний складчатая, не окрашена

Хорошо усваивает моно-ди - и полисахариды, в том числе глицерин, крахмал, при росте на глицерине, фруктозе, сахарозе образует желтый пигмент

Коагулирует полностью к 12 сут роста

Разжижает слабо

Нитраты восстанавливает полностью к 25 сут роста

Таблица 2