СПОСОБ ПОДГОТОВКИ КРОВИ К РАДИОИММУНОЛОГИЧЕСКОМУ АНАЛИЗУ Российский патент 1997 года по МПК G01N33/534 

Изобретение относится к области медицины, в частности к лабораторной диагностике, и может быть использовано для иммунохимического анализа, в частности радиоиммунологического, малых количеств периферической крови.

Известен способ подготовки крови к анализу (Г.А.Ткачева, М.И.Балаболкин, И.П.Ларичева. Радиоиммунологические методы исследования. Справочник. М:Медицина, 1983, с. 192). Способ состоит в том, что забирают венозную кровь в количестве 3-10 мл, добавляют антикоагулянт, кровь центрифугируют, плазму сливают в лабораторные емкости.

Признаки аналога, совпадающие с существенными признаками заявляемого изобретения: забирают кровь больного, кровь центрифугируют, плазму отделяют от эритроцитарной массы.

Причины, препятствующие достижению требуемого технического эффекта, состоят в том, что способ ограничен в применении в отношении определенных лиц, например детей, т.к. способ травматичен и требует значительного количества крови на анализ.

Известен способ подготовки крови к анализу, принятый нами за прототип (В.В.Трусов, А.А.Зеленин, С.А.Маризин. Радиоиммунологический анализ в биологии и медицине. Учебно-методическое пособие. Горький, ГМИ, 1987). Способ состоит в том, что после взятия 3-10 мл крови из вены и добавления антикоагулянта (5% раствора цитрата натрия, раствора гепарина) путем центрифугирования отделяют плазму от эритроцитной массы, после чего пипеткой переносят ее в стеклянные пробирки для хранения.

Признаки прототипа, совпадающие с существенными признаками заявляемого изобретения: забирают кровь больного; центрифугируют кровь; пипеткой переносят плазму в лабораторную емкость.

Причины, препятствующие достижению требуемого технического эффекта, состоят в травматичности взятия крови из вены и необходимости взятия значительного количества взятия крови, что ограничивает применение у детей и лиц с патологией вен, в том числе при необходимости повторных взятий крови.

Требуемый технический результат достаточная высокая точность проведения анализа при взятии периферической, а не венозной крови.

Задача, на решение которой направлено заявляемое изобретение подготовка крови, взятой из пальца пациента (периферической крови) к радиоиммунологическому анализу.

Заявляемый способ состоит в том, что у пациента забирают периферическую кровь в количестве 0,1-0,2 мл, помещают в капилляр, смоченный антикоагулянтом (5% раствором цитрата натрия, раствором гепарина), устанавливают капилляр в разработанную авторами кассету, центрифугируют при числе оборотов 1500-2000 в мин в течение 10-15 мин и замораживают в течение 3-5 мин при температуре -15.-20^oC до востребования.

Перед проведением анализа часть капилляра по длине столбика эритроцитарной массы при температуре 27-30 ^oС до ее размораживания и аспирируют из капилляра размороженную фракцию с помощью разработанного авторами отсоса эритроцитарной массы. Оставшуюся в капилляре замороженную плазму размораживают и сливают через другой (чистый) конец капилляра, а затем производят радиоиммунологический анализ.

Возможно предварительно перед центрифугированием определить величину СОЭ.

Кассета выполнена в виде одноместного штатива для установки капилляра, который нижним концом упирается в эластичную прокладку. В рабочем положении кассета вертикально устанавливается в центрифугу. При центрифугировании капилляр принимает горизонтальное положение. После центрифугирования кассета в вертикальном положении устанавливается в морозильную камеру на 3-5 мин до замораживания крови в капилляре. Капилляр, извлеченный из кассеты, в горизонтальном положении хранили в морозильной камере при температуре -15.-20^oC.

Отсос эритроцитарной массы выполнен в виде камеры-накопителя в форме цилиндра, на проксимальный конец которого надета инъекционная игла (для спинномозговой пункции), в середине размещена сеточка, а на дистальный торец надета резиновая груша. В рабочем положении (из груши выпущен воздух) вводят иглу в капилляр со стороны расположения оттаянной эритроцитарной массы, аспирируют эритроцитарную массу.

Признаки изобретения, отличительные от прототипа и достаточные во всех случаях, на которые распространяется испрашиваемый объем правовой охраны: забирают периферическую (капиллярную) кровь больного, помещают ее в капилляр, после центрифугирования замораживают кровь в течение 3-5 мин при температуре -15. -20 ^oC, а перед аспирацией нагревают часть капилляра по длине столбика эритроцитарной массы при температуре 27-30^oC до ее размораживания.

Замораживание крови в капилляре после центрифугирования необходимо для хранения, так как при более высокой температуре происходит постепенное разрушение гормонов. Выбор температуры замораживания обусловлен тем, что более высокие температуры не позволяют хранить кровь длительно: при температуре выше -12.-14^oC не более 2-3 недель, а более низкая температура требует для своего поддержания больших затрат электроэнергии, не влияя существенно на результаты исследования. Продолжительность хранения обусловлена необходимостью подготовки серии проб от одного больного, забираемых в течение 20-40 дней и исследовании всех проб одним набором реактивов для уменьшения суммарной ошибки метода. Время замораживания 3-5 мин обусловлено тем, что замораживание менее 3 мин недостаточно для перевода фракции крови в твердую фазу и охлаждения до требуемой температуры, в заморажиавание более 5 мин увеличивает расход электроэнергии.

Нагревание капилляра по длине столбика эритроцитарной (клеточной) массы необходимо для лучшей аспирации ее в результате переведения в жидкую фазу, в то время как плазма остается в твердой фазе, что предотвращает случайное смешение ее с клетками крови. Температура нагрева при 27-30^oC обусловлена достаточно быстрым размораживанием эритроцитарной массы и отсутствием разогрева конца капилляра с размороженной плазмой.

Примеры конкретного осуществления способа:
1. Больная С. 35лет. Диагноз: Ревматоидный артрит с системными проявлениями, ревматоидный полисерозит, лимфаденопатия, серопозитивный, быстро прогрессирующее течение, активность III ст. стадия III, ФН II-III ст.

В комплексную противовоспалительную и базисную терапию по показаниям включены процедуры электрофореза лития карбоната. Однако контроль за состоянием щитовидной железы затруднен в связи с артезией и склерозированием поверхностных вен, удобных для взятия венозной крови. Провели трехкратный в процессе терапии забор периферической крови из безымянного пальца правой кисти путем прокола кожи ланцетом. Кровь забирали в смоченный 5% раствором цитрата натрия от прилипания крови к стенке капилляра стеклянный капилляр объемом 0,1 мл. Устанавливали капилляр в кассету и центрифугировали в лабораторной центрифуге при 1500 об/мин в течение 15 мин. После центрифугирования кровь замораживали в течение 3 мин при -15^oC и хранили в морозильнике.

Перед проведением радиоиммунологического анализа определения гормона тироксина в исследуемых пробах крови капилляры по очереди извлекали из морозильника, отогревали столбик со стороны эритроцитарной массы при температуре +27^oC, эритроцитарную массу извлекали отсосом, а плазму выпускали после оттаивания в пробирку через чистый конец. Полученную плазму (0,05 мл) использовали в радиоиммунологическом анализе.

2. Пациент И. 27лет. Обследован по направлению терапевта в связи с жалобами на снижение потенции при работе на вредном производстве.

В связи с глубоким расположением поверхностных вен и трудностью взятия проб крови на анализ кровь брали из безымянного пальца правой кисти. Провели трехкратное в течение рабочей недели взятие крови путем прокола кожи пальца ланцетом. Кровь забирали в смоченный 5% раствором стеклянный капилляр объемом 0,2 мл, устанавливали капилляр в кассету и центрифугировали 10 мин при 2000 об/мин. После центрифугирования в течение 5 мин замораживали кровь и хранили в морозильнике при -20^oC, вынув капилляр из кассеты.

Перед проведением радио иммунологического анализа определения гормона тестостерона в исследуемых пробах крови капилляры по очереди извлекали из морозильника, нагревали по длине столбика со стороны эрицитроцитарной массы при температуре +30^oC, извлекали эритроцитарную массу с помощью отсоса, размороженную плазму выпускали в пробирку через чистый конец. Полученные 0,08 мл плазмы использовали в анализе. Был выявлен нормальный уровень тестостерона в крови и отсутствие прямого угнетающего продукцию тестостерона влияния вредных факторов производства. Применение предложенного способа позволило диагностировать функциональное, а неорганическое нарушение потенции у пациента под влиянием труда на вредном производстве в данном конкретном случае.

Способ апробирован на дату подачи заявки у 486 человек.

Достигнут технический эффект у 476 из 486 человек (97-98%). Повторный прокол кожи пальца пришлось провести у 10 человек (2%) из-за малого количества (менее 0,02 мл) выделившейся крови, вследствие недостаточно глубокого прокола кожи. Других осложнений при взятии периферической крови в разделении ее на фракции не наблюдалось. Травматизация кожных покровов и сосудов при использовании данного способа была минимальной при сравнении с другими способами взятия крови для радиоиммунологического анализа.

Использование: способ подготовки крови к радиоиммунологическому анализу в медицине, в частности в лабораторной диагностике для иммунохимического анализа малых количеств периферической крови. Сущность способа состоит в том, что у пациента забирают периферическую кровь в количестве 0,1-0,2 мл, помещают в капилляр, смоченный антикоагулянтом, центрифугируют при 1500-2000 об/мин в течение 10-15 мин и замораживают в течение 3-5 мин при температуре -15...-20^oC. При проведении анализа нагревают капилляр по длине столбика эритроцитарной части при температуре 27-30^oC до ее размораживания и размороженную фракцию аспирируют из капилляра.

Способ подготовки крови к радиоиммунологическому анализу, включающий забор крови у пациента, ее центрифугирование до разделения плазмы и эритроцитарной массы и аспирацию фракции плазмы для анализа, отличающийся тем, что периферическую кровь забирают, центрифугируют и замораживают в капилляре в течение 3 5 мин при -15. 20^oC, перед аспирацией часть капилляра по длине столбика эритроцитарной массы нагревают при 27 30^oС и удаляют с помощью отсоса, а затем размораживают фракцию плазмы и используют ее для анализа.