СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРИРОДНЫХ ЦИТОКИНОВ Российский патент 2000 года по МПК A61K38/19 A61K35/14 A61N5/67 

Изобретение относится к медицине, в частности к иммунологии, и может быть использовано в биотехнологии получения препаратов природных цитокинов с преимущественным содержанием определенных факторов (ФHO-α).
Известен способ получения комплекса природных цитокинов (суперлимф), включающий выделение мононуклеарных клеток (МНК) из периферической крови, их пульсовую стимуляцию митогеном (ФГА), удаление стимулятора, культивирование клеток в бессывороточной среде, отделение супернатанта (Ковальчук Л.В., Ганковская Л. В. Иммуноцитокины и локальная иммунокоррекция //Иммунология. - 1995. -N 1- С. 4-7).

Однако этот способ требует достаточно продолжительной (3 часа) инкубации лимфоцитов в присутствии митогена с последующим тщательным его удалением путем трехкратного центрифугирования взвеси клеток в растворе Версена. Кроме того, ФГА является дорогостоящим реактивом и его использование в соответствии с вышеуказанным способом в дозе 20 мкг/мл значительно повышает затраты на промышленное производство комплекса цитокинов.

Сущность предлагаемого способа получения природных цитокинов состоит в том, что осуществляют выделение МНК из периферической крови, их активацию низкоинтенсивным инфракрасным лазерным излучением в энергетическом режиме 0,48 Дж/см³ с частотой импульсов 3000 Гц и временем воздействия 10 минут, культивирование клеток и отделение супернатанта.

Использование низкоинтенсивного инфракрасного лазерного излучения в качестве активатора МНК обусловлено его биостимулирующим действием на лимфоциты.

Энергетический режим лазерного облучения МНК 3000 Гц - 10 минут (0,48 Дж/см³) индуцирует максимально стойкую активацию клеток, необходимую для получения комплекса природных цитокинов с заданными свойствами in vitro.

Способ осуществляют следующим образом. Из кубитальной вены здорового донора (гомологичные цитокины) или больного (аутологичные цитокины) производят забор крови в стерильную силиконовую посуду, содержащую 0,5 мл гепарина (5000 Ед/мл). Путем центрифугирования на градиенте плотности фиколл-верографина (p= 1,077-1,078 г/мл) из полученной крови выделяют МНК, которые трижды отмывают раствором Версена, и готовят взвесь клеток с концентрацией 10•10⁶/мл в среде 199, содержащей гентамицин (80 мкг/мл).

Взвесь МНК в объеме 1,0 мл помещают в пенициллиновые флаконы, которые устанавливают в разработанную нами насадку для лазерного облучения жидкостей и подвергают низкоинтенсивному лазерному облучению с помощью аппарата "Узор" ( (λ = 0,89 мкм) в режиме с частотой импульсов 3000 Гц и временем воздействия 10 минут. Рукоятка мощности находится в крайнем правом положении, соответствующем максимальной мощности одного импульса (3,8 Вт). После лазерного воздействия конечную концентрацию клеток доводят до 5х10⁶/мл (уменьшают в 2 раза) путем внесения соответствующего объема среды 199 с гентамицином и культивируют в термостате в течение 20 часов при температуре 37^oC.

Взвесь МНК центрифугируют 10 минут при 1500 об/мин. Супернатант, содержащий комплекс природных цитокинов, забирают в стерильные пенициллиновые флаконы и хранят в морозильном отделении холодильника при минус 20^oC. К оставшемуся клеточному остатку добавляют до прежнего объема среду 199 с гентамицином и культивируют 24 часа в термостате при 37^oC, как описано выше. Все манипуляции со взвесью МНК и супернатантами производят в стерильном боксе с соблюдением правил асептики и антисептики.

Определяют биологическую активность как первой, так и второй порции супернатанта по усилению фагоцитоза в латекс-тесте. Увеличение фагоцитарного числа (Ф.ч.) на 20-40% при добавлении супернатанта МНК соответствует высокой биологической активности комплекса цитокинов.

При заборе 10,0 мл венозной крови выход супернатанта составляет 8,0-10,0 мл.

Пример
У здорового донора Г., 22 лет, произвели забор 10,0 мл венозной крови, из которой выделили МНК на градиенте плотности фиколл-верографина и подвергли их активации лазерным облучением с помощью аппарата "Узор" в энергетическом режиме 0,48 Дж/см³ с частотой импульсов 3000 Гц и временем воздействия 10 минут. Облученные клетки культивировали в термостате при 37^oC и дважды забирали супернатант (через 20 и затем через 24 часа культивирования), определяли его биологическую активность и уровень основных иммунопептидов ИЛ-1β и ФНО-α.
Биологическая активность супернатанта в латекс-тесте: первая порция супернатанта повышала процент фагоцитирующих нейтрофилов (Ф.ч.) с 54% до 81%, т. е. на 31,3% по отношению к исходному показателю; вторая порция - с 54% до 77%, т.е. на 24,0% по отношению к исходному Ф.ч.

Уровень иммунопептидов в первой порции супернатанта составил 3632,0 пкг/мл ИЛ-1β и 8090,2 пкг/мл ФНО-α, во второй порции - 812,0 пкг/мл ИЛ-1β и 8004,9 пкг/мл ФНО-α.
Выход супернатанта составил 9,0 мл.

Обоснованием выбора энергетического режима явились результаты проведенных нами исследований функциональной активности облученных лазером МНК 13 здоровых доноров в возрасте от 19 до 28 лет. МНК донора облучали в 7 различных энергетических режимах. Контролем служили интактные лимфоциты. Функциональную активность клеток оценивали с помощью витальной окраски лимфоцитов флюоресцентным красителем акридиновым оранжевым (Карнаухов В.Н. Люминисцентный спектральный анализ клетки: - М.: Наука. - 1978. - 207 С.) с вычислением индекса активации (ИА) по формуле:

Статистическую обработку результатов проводили с определением критерия t Стьюдента.

Результаты определения индекса активации облученных лазером МНК представлены в таблице 1. Как видно, при облучении лимфоцитов в дозах 0,012 Дж/см³ и 0,48 Дж/см³, соответствующих режимам 150 Гц-5 мин и 3000 Гц-10 мин, мы достигли значительной и стойкой их активации, необходимой для получения природных цитокинов.

Биологическую активность лазериндуцированных супернатантов МНК оценивали по усилению фагоцитоза нейтрофилами в латекс-тесте, а именно по увеличению фагоцитарного числа (таблица 2). Супернатанты лимфоцитов, подвергнутых лазерному облучению, так же как и активированных митогеном, с высокой степенью достоверности усиливали фагоцитоз, причем стимулирующий эффект супернатантов лазероблученных клеток был значительно выше (p<0,02), а выбранный энергетический режим 3000 Гц - 10 мин не отличался от режима 150 Гц - 5 мин.

Тестирование комплексов природных цитокинов по уровню основных иммунопептидов ИЛ-1β и ФНО-α (таблица 3) с использованием коммерческих наборов для иммуноферментного анализа ProCon IL-1 и ProCon TNF (ТОО "Протеиновый контур") показало значительное преобладание продукции ФНО-α при использовании в качестве активатора МНК инфракрасного лазерного излучения в режиме 3000 Гц - 10 мин.

Таким образом, применение способа обеспечивает следующие преимущества: позволяет получить комплекс цитокинов с высоким содержанием ФНО-α, который может составить основу препарата для лечения больных онкологического профиля;
позволяет снизить трудоемкость и длительность процесса получения комплекса природных цитокинов.

Изобретение относится к медицине, точнее к иммунологии, и может быть использовано в биотехнологии получения препаратов природных цитокинов. Природные цитокины получают путем выделения мононуклеарных клеток из периферической крови, их активации низкоинтенсивным инфракрасным лазерным излучением, культивирования клеток и отделения супернатанта. Технический результат: способ позволяет получить комплекс природных цитокинов с высоким содержанием ФНО-α. 3 табл.

Способ получения природных цитокинов, включающий выделение мононуклеарных клеток (МНК) из периферической крови, их активацию, культивирование и отделение супернатанта, отличающийся тем, что активацию МНК осуществляют низкоинтенсивным инфракрасным лазерным излучением в энергетическом режиме 0,48 Дж/см³ с частотой импульсов 3000 Гц и временем воздействия 10 мин.