СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФИЛЬТРУЕМОСТИ ЛЕЙКОЦИТОВ Российский патент 2004 года по МПК G01N33/49 

Изобретение относится к медицине, а именно к лабораторной диагностике, и может быть использовано для определения фильтруемости лейкоцитов.

Известен способ определения фильтрационной способности лейкоцитов, при котором разделение крови на эритроцитарную массу и обогащенную лейкоцитами плазму осуществляли путем свободного оседания эритроцитов, после чего суспензию лейкоцитов в плазме фильтровали через фильтры с диаметром пор 5 мкм при постоянном давлении 100 см вод. ст. в течение 30 с (Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 9, 1990, с.274-276).

Недостатком этого способа является приготовление суспензии лейкоцитов путем свободного оседания эритроцитов и разведение лейкоцитов в бедной клетками плазме, приготовление которой требует дополнительного времени, что значительно удлиняет время проведения пробы. Недостатком данного способа также является то, что фильтрация лейкоцитов проводится под постоянным давлением в 100 см вод. ст., что несвойственно физиологическим условиям функционирования лейкоцитов в сосудистом русле и искажает реальный показатель фильтруемости лейкоцитов, а также требует применения специального устройства, создающего постоянное давление, что усложняет способ и делает его менее доступным.

Известен способ определения деформирующей способности эритроцитов, при котором через лавсановые фильтры с размером пор 4,9-5,1 мкм пропускают 0,2-0,4% взвесь эритроцитов в физиологическом растворе. Фиксируют объемную скорость прохождения суспензии эритроцитов крови доноров и исследуемой крови. Затем рассчитывают степень деформируемости эритроцитов (а. с. СССР 1462201, G 01 N 33/49, 1989).

Недостатком данного способа является то, что используется 0,2-0,4% взвесь эритроцитов, то есть данное соотношение красных клеток крови и физиологического раствора далеко от такового в капиллярах человека. Для приготовления взвеси эритроцитов используется обычный физиологический раствор, в котором не содержатся многие ионы плазмы крови. Также недостатком этого способа является то, что фильтрация эритроцитов происходит под воздействием внешней силы, что приводит к снижению достоверности получаемых результатов.

Задача изобретения - упрощение способа и ускорение времени проведения пробы.

Поставленную задачу достигают за счет того, что цельную кровь разделяют на эритроциты и лейкоциты путем центрифугирования, готовят суспензию лейкоцитов в концентрации 5000 в 1 мл солевого буферного раствора с концентрацией ионов, максимально приближенной к таковой в плазме крови, фильтруют суспензию лейкоцитов через микропористую мембрану без воздействия внешней силы, количество лейкоцитов в суспензии определяют путем подсчета в камере Горяева и определяют показатель фильтру емости лейкоцитов (ПФЛ) по формуле
ПФЛ=Л(фильтрата)/Л(суспензии лейкоцитов),
где Л(фильтрата) - количество лейкоцитов в профильтровавшейся суспензии, Л(суспензии лейкоцитов) - количество лейкоцитов в суспензии до фильтрации.

Все вышеперечисленное создает условия во время фильтрации белых клеток крови через микропористую мембрану, максимально приближенные к таковым в физиологических условиях, то есть в капиллярах. За счет этого происходит повышение точности определения фильтруемкости лейкоцитов. Использование центрифугирования позволяет за более короткий срок разделить цельную кровь на эритроциты и лейкоциты. Укорочение времени проведения достигают также за счет того, что для приготовления суспензии лейкоцитов используется не бедная клетками крови плазма, приготовление которой требует времени, а заранее приготовленный буферный солевой раствор.

Сравнение заявляемого технического решения с прототипом позволяет установить соответствие его критерию "новизна".

При изучении других технических решений в данной области признаки, отличающие заявляемое изобретение от прототипа, не были выявлены, и поэтому они обеспечивают заявляемому решению соответствие критерию "изобретательский уровень".

Способ осуществляют следующим образом.

У больного из кубитальной вены забирают цельную венозную кровь. В кровь добавляют гепарин в качестве антикоагулянта и центрифугируют при 1000 об/мин в течение 7 мин. Затем готовят суспензию лейкоцитов в концентрации 5000 в 1 мл в солевом буферном растворе (фосфатно-солевой буфер 39 г Na₂HPО₄•12H₂О и 3 г К₂НРО дополняют до 1 л дистиллированной водой, рН 7,4, осмотическое давление 300 мосм/кг), после чего суспензию лейкоцитов фильтруют через микропористую мембрану с размером пор 5-7 мкм, закрепленную в фильтрационной колонке. После чего определяют количество лейкоцитов в фильтрате путем подсчета в камере Горяева. После этого подсчитывают показатель фильтруемости лейкоцитов (ПФЛ) по формуле
ПФЛ=Л(фильтрата)/Л(суспензии лейкоцитов),
где Л(фильтрата) - количество лейкоцитов в профильтровавшейся суспензии,
Л(суспензии лейкоцитов) - количество лейкоцитов в суспензии до фильтрации.

Пример 1. Больной с гломерулонефритом поступил для лечения в стационар. При поступлении взята кровь. Для определения показателя фильтруемости лейкоцитов у больного забирали 2 мл крови и стабилизировали ее при помощи гепарина. После центрифугирования при 1000 об/мин в течение 7 мин готовилась взвесь лейкоцитов в солевом буферном растворе (фосфатно-солевой буфер 39 г Na₂HPО₄•12H₂О и 3 г К₂НРО дополняют до 1 л дистиллированной водой, рН 7,4, осмотическое давление 300 мосм/кг). После этого суспензию лейкоцитов в течение 1 мин фильтруют через микропористую мембрану, закрепленную в фильтрационной колонке. После чего определяют количество лейкоцитов в фильтрате путем подсчета в камере Горяева. Оно равно 5000 в 1 мл в исходной суспензии лейкоцитов и 4000 в 1 мл фильтрата. После этого подсчитывают показатель фильтруемости лейкоцитов по формуле
ПФЛ=4000/5000=0,8
Таким образом, у больного показатель фильтруемости лейкоцитов равен 0,8.

Проведено изучение фильтрационной способности лейкоцитов у больных с хронической почечной недостаточностью (ХПН). Полученные результаты представлены в таблице. У больных ХПН происходит достоверное снижение фильтрационной способности лейкоцитов.

Предлагаемый способ имеет следующие преимущества:
1) разделение цельной крови на эритроциты и лейкоциты происходит центрифугированием, что позволяет ускорить время проведения пробы;
2) фильтрация лейкоцитов через микропористую мембрану происходит без воздействия внешней силы, что не приводит к дополнительным повреждениям мембраны лейкоцитов и снижению точности получаемого результата;
3) используется суспензия лейкоцитов в концентрации 5000 в 1 мл, что позволяет создать условия, наиболее приближенные к физиологическим, и повысить достоверность получаемого показателя фильтруемости лейкоцитов;
4) суспензия лейкоцитов готовится в солевом буферном растворе с концентрацией ионов, близкой к таковой в плазме крови.

Изобретение относится к медицине, а именно к лабораторной диагностике. Способ определения фильтруемости лейкоцитов заключается в следующем: цельную кровь разделяют на эритроциты и лейкоциты путем центрифугирования, готовят суспензию лейкоцитов в концентрации 5000 в 1 мл солевого буферного раствора с концентрацией ионов, максимально приближенной к таковой в плазме крови, фильтруют суспензию лейкоцитов через микропористую мембрану без воздействия внешней силы, количество лейкоцитов в суспензии определяют путем подсчета в камере Горяева и определяют показатель фильтруемости лейкоцитов (ПФЛ) по формуле ПФЛ=Л(фильтрата)/Л(суспензии лейкоцитов), где Л (фильтрата) - количество лейкоцитов в профильтровавшейся суспензии, Л (суспензии лейкоцитов) - количество лейкоцитов в суспензии до фильтрации. Способ позволяет повысить точность и достоверность получаемых результатов. 1 табл.

Способ определения фильтруемости лейкоцитов путем прохождения взвеси лейкоцитов через фильтр, регистрации количества лейкоцитов в исходной взвеси и в фильтрате с последующим расчетом показателя фильтруемости, отличающийся тем, что цельную кровь разделяют на эритроциты и лейкоциты путем центрифугирования, готовят суспензию лейкоцитов в концентрации 5000 в 1 мл солевого буферного раствора с концентрацией ионов, максимально приближенной к таковой в плазме крови, фильтруют суспензию лейкоцитов через микропористую мембрану без воздействия внешней силы, количество лейкоцитов в суспензии определяют путем подсчета в камере Горяева и определяют показатель фильтруемости лейкоцитов (ПФЛ) по формуле

ПФЛ=Л(фильтрата)/Л(суспензии лейкоцитов),

где Л(фильтрата) - количество лейкоцитов в профильтровавшейся суспензии,

Л(суспензии лейкоцитов) - количество лейкоцитов в суспензии до фильтрации.