СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ МИАСТЕНИИ Российский патент 1999 года по МПК G01N33/53 G01N33/541 

Изобретение относится к области клинической медицины, а именно к лабораторной диагностике миастении.

Известен в литературе способ выявления антител к холинорецепторам (ХР) в плазме крови больных миастенией, основанный на способности антител пассивно перенесенных в организм животного (мышей линии С₅₇), блокировать Н - ХР и уменьшать при этом подвижность животных в тесте "поднятия животного по хвосту" (Смирнов В.А., Сайкова Л.А., Лобзин B.C. О двухфазном действии на мышей иммуноглобулинов, выделенных из крови больного миастенией. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 1988, N 11, с. 549-551).

Недостатком способа является его непригодность для использования в клинике в связи с необходимостью наличия животных, персонала, обученного работе с животными, вивария.

Изобретение направлено на решение задачи: упрощение способа, повышение специфичности, экономичности, безопасности.

Указанная задача достигается путем изучения взаимодействия сыворотки крови больного миастенией с холинорецепторами мембраны лимфоцитов крови здорового донора, предварительно активированных в условиях in vitro ацетилхолином (AX), в реакции розеткообразования, специфичного ацетилхолину. Изучают среди лимфоцитов крови донора, предварительно активированных АХ в дозе 100 мкг в условиях in vitro при температуре + 37 - 37,5^oC в течение 30-40 минут, число розеткообразующих клеток, специфичных АХ, до и после внесения сыворотки крови больного, инактивированной при температуре +56-57^oC в течение 30-35 минут, с последующей инкубацией при температуре +37-37,5^oC в течение 30-40 минут, и после добавления эритроцитов барана, сенсибилизированных ацетилхолином, подсчитывают в мазке количество розеткообразующих лимфоцитов; при уменьшении их количества в 1,5 и более раз по сравнению с фоном диагностируют миастению.

Способ осуществляют следующим образом: из вены обследуемого забирают кровь в количестве 1,5-2 мл в сухую чистую центрифужную пробирку, после отстаивания выделяют сыворотку путем центрифугирования в течение 5 мин при скорости 1500 оборотов в минуту, затем сыворотку инактивируют в течение 30-40 минут, инкубируя при температуре +56 - 57^oC.

Из вены донора забирают кровь в количестве 2,5-3 мл в центрифужную пробирку, содержащую 0,8-1,0 мл 5%-ного раствора цитрата натрия, смесь перемешивают. После отстаивания вносят по 0,4 мл этой взвеси в 2 чистые центрифужные пробирки (одна - для определения исходного содержания розеток в активированной ацетилхолином суспензии лимфоцитов крови донора [здоровый человек, животное] , вторая - для изучения действия на активированные клетки крови донора сыворотки крови обследуемого). В каждую пробирку добавляют по 3,0 мл дистиллированной воды для лизиса эритроцитов, затем по 3,0 мл 1,8%-ного раствора натрия хлорида для восстановления pH 7,2. Центрифугируют 5 минут при скорости 1,5 тыс. оборотов в минуту. Оттянув надосадочную жидкость из всех пробирок, оставив в них 0,2 мл, добавляют по 1 мл среды 199 в каждую пробирку, встряхивают и оставляют в термостате на 15 минут при температуре + 37 - 37,5^oC. Затем суспензию лимфоцитов центрифугируют 5 минут при скорости 1,5 тыс. оборотов в минуту, надосадочную жидкость отсасывают пипеткой. Осадки пробирок активируют ацетилхолином, для чего в пробирки вносят по 0,1 мл раствора, содержащего 100 мкг ацетилхолина (1 мг ацетилхолина хлорида растворяют в 1 мл среды 199). Смеси встряхивают и выдерживают в термостате 30 - 35 минут при температуре + 37 - 37,5^oC. После инкубации суспензию клеток центрифугируют 5 минут при скорости 1,5 тыс. оборотов в минуту, надосадочную жидкость отсасывают пипеткой. Затем дважды отмывают изотоническим раствором натрия хлорида (pH 7,2) путем центрифугирования при скорости 1500 оборотов в минуту. Первую пробирку оставляют временно без воздействия, а осадок второй пробирки соединяют с 0,4 мл исследуемой цельной сыворотки крови больного. Смесь осторожно встряхивают и инкубируют 30 - 35 минут при температуре +37 - 37,5^oC. После инкубации с сывороткой лимфоциты дважды отмывают изотоническим раствором натрия хлорида (pH 7,2) путем центрифугирования при скорости 1500 оборотов в минуту в течение 5 минут, надосадочную жидкость отсасывают пипеткой. Затем в обе пробирки добавляют по 1 мл среды 199 и инкубируют при температуре + 37 - 37,5^oC. 15 минут, затем центрифугируют 5 мин при скорости 1500 об/мин, надосадочную жидкость удаляют. Осадок ресуспензируют во всех пробирках в 0,1 мл среды 199. К полученным взвесям лейкоцитов добавляют по 0,1 мл 0,5% взвеси эритроцитарного диагностикума, смеси инкубируют при температуре +37-37,5^oC в течение 15 мин, центрифугируют 5 мин при 1500 об/мин, выдерживают 1 час в условиях холодильника (при температуре +4 - +6^oC). После инкубации во все пробирки, стянув надосадочную жидкость и осторожно пропипетировав осадок, добавляют по 1 капле 0,5%-ного раствора глютарового альдегида, выдерживают при комнатной температуре 20 минут. Затем отмывают 0,75 мл дистиллированной воды, стягивают надосадочную жидкость пипеткой. Во все пробирки добавляют по 0,5 мл 50%-ного раствора бычьей сыворотки, центрифугируют смеси 5 мин при 1500 об/мин, надосадочную жидкость сливают, а из осадка делают мазки, которые высушивают на воздухе, фиксируют этиловым спиртом 30 минут и окрашивают по Романовскому-Гимза. Просматривают под микроскопом при 900-кратном увеличении 100 лимфоцитов, отмечая среди них число (в процентах) лимфоцитов, фиксировавших на себе 3 и более эритроцитов (РОК). При снижении числа РОК в 1,5 и более раза во втором мазке по сравнению с первым (фоном) диагностируют миастению.

Для приготовления ацетилхолинового диагностикума используют эритроциты барана, обработанные глютаровым альдегидом. Свежие эритроциты барана трижды отмывают изотоническим раствором натрия хлорида (pH 7,2), центрифугируя взвесь в течение 5 мин при 1500 об/мин. Из отмытых эритроцитов готовят 5% взвесь, соединяя 0,5 мл осадка эритроцитов и 9,5 мл забуференного изотонического раствора натрия хлорида pH 7,2. При глютаризации смешивают 5% взвесь эритроцитов с 0,25%-ным свежеприготовленным раствором глютарового альдегида в соотношении 1:1. Выдерживают смесь при температуре + 37 - 37,5^oC в течение 15 минут, после чего эритроциты тщательно отмывают от глютарового альдегида забуференным изотоническим раствором натрия хлорида и тем же раствором доводят объем до первоначального (5% взвесь). Приготовленные таким образом эритроциты хранят 6 месяцев при температуре +4^oC.

При сенсибилизации эритроцитов ацетилхолином глютаризированные эритроциты дважды отмывают изотоническим раствором натрия хлорида pH 6,4 и доводят им же объем взвеси до первоначального (1 мл). Затем соединяют с 10 мг ацетилхолина, предварительно растворенного в 0,1 мл изотонического раствора натрия хлорида pH 6,4. Смесь осторожно встряхивают, затем выдерживают в термостате 30-40 мин при температуре +37 - 37,5^oC, периодически встряхивая, после чего отмывают дважды забуференным раствором натрия хлорида pH 7,2. Слив надосадочную жидкость, доводят объем до первоначального (5% взвесь). В реакции используют 0,5% взвесь сенсибилизированных эритроцитов, которую готовят из исходной (5%) взвеси путем соединения 1 мл ее с 9 мл среды 199.

Заявляемым способом исследованы сыворотки крови 16 больных с достоверно установленным диагнозом миастении, 15 больных с заболеваниями периферической нервной системы (группа сравнения) и 15 практически здоровых лиц (контрольная группа). Результаты исследования приведены в таблицах 1 - 3.

Проведенные исследования показали, что цельная сыворотка крови больных миастенией вызывает снижение способности лимфоцитов донора, предварительно активированных раствором ацетилхолина, к розеткообразованию с ацетилхолиновым диагностикумом. Обработка тех же лимфоцитов сывороткой крови здоровых лиц (таблица 2) и больных с заболеваниями периферической нервной системы (таблица 3) подобного эффекта не вызывала и число ацетилхолиновых розеток оставалось по-прежнему высоким. Эффект угнетения розеткообразования связан с действием антител к холинорецепторам, имеющихся в сыворотке крови больных миастенией.

Примеры конкретного выполнения.

Пример 1. Больная Б-ва А. С., 39 лет, поступила в клинику неврологии 16 декабря 1997 года с жалобами на повышенную утомляемость после умеренной физической нагрузки, общую слабость, поперхивание при глотании твердой пищи, опускание век к вечеру. Из анамнеза заболевания известно, что больна с декабря 1989 года, когда на фоне полного здоровья появилось двоение, общая слабость, быстрая утомляемость, нарушение глотания. Симптомы появились внезапно, в течение 2-3 дней, быстро прогрессировали и через неделю больная не смогла самостоятельно глотать. Больная госпитализирована в неврологическое отделение, где была обнаружена тимома. 18.01.1990 проведена тимэктомия, с 1990 по 1992 больная находилась на II группе инвалидности. Постоянно принимает калимин в дозе 1-1,5 таб. в сутки. При объективном исследовании небольшой двусторонний птоз, глотание с поперхиванием, иногда жидкая пища попадает в нос, фонация удовлетворительная, глоточный рефлекс отсутствует. Чувствительных нарушений нет, диффузная мышечная гипотония и гипотрофия, мышечная сила конечностей 4 балла, сухожильные и периостальные рефлексы снижены, симметричные. Координация движений и функция тазовых органов не нарушены. Клинический диагноз: Миастения, генерализованная форма.

Больной проведено иммунологическое исследование заявляемым способом. С этой целью из локтевой вены больной было взято 2,5 мл крови. Путем центрифугирования в течение 5 минут при скорости 1500 оборотов в минуту была выделена сыворотка, которая в целях инактивации инкубировалась при температуре +56^oC 35 минут.

Из вены донора забрали кровь в количестве 3 мл в центрифужную пробирку, содержащую 0,8-1,0 мл 5%-ного раствора цитрата натрия. Смесь перемешали. После отстаивания внесли по 0,4 мл этой взвеси в 2 чистые центрифужные пробирки. Лизировали эритоциты, добавляя по 3,0 мл дистиллированной воды, затем по 3,0 мл 1,8%-ного раствора натрия хлорида, центрифугировали 5 мин при скорости 1,5 тыс. об/мин. Оттянув надосадочную жидкость из всех пробирок, добавили по 1 мл среды 199 в каждую пробирку, встряхнули и оставили в термостате на 15 минут при температуре +37^oC. Затем суспензию лимфоцитов центрифугировали 5 минут при скорости 1,5 тыс. оборотов в минуту, надосадочную жидкость удалили пипеткой. Затем внесли по 0,1 мл раствора, содержащего 100 мкг ацетилхолина. Смеси встряхивали и выдерживали в термостате 30 минут при температуре +37^oC, центрифугировали 5 мин при 1,5 тыс. об/мин, надосадочную жидкость удалили. Затем дважды отмыли изотоническим раствором натрия хлорида (pH 7,2) путем центрифугирования при скорости 1,5 тыс. об/мин. Первую пробирку оставили временно без воздействия, а осадок второй пробирки соединили с 0,4 мл исследуемой сыворотки крови больного. Смесь осторожно встряхнули и инкубировали 30 минут при температуре 37^oC. После инкубации с сывороткой, лимфоциты дважды отмыли изотоническим раствором натрия хлорида (pH 7,2), надосадочную жидкость удалили. Затем в обе пробирки добавили по 1 мл среды 199 и инкубировали при температуре +37^oC. 15 минут, затем центрифугировали 5 мин при 1,5 тыс. об/мин, надосадочную жидкость удалили. Осадок ресуспензировали во всех трех пробирках в 0,1 мл среды 199. полученным взвесям лейкоцитов добавили по 0,1 мл 0,5 взвеси эритроцитарного диагностикума, смеси инкубировали при температуре +37^oC в течение 15 мин, центрифугировали 5 мин при 1500 об/мин, выдерживали 1 час в условиях холодильника (при температуре +5^oC). После инкубации во все пробирки, стянув надосадочную жидкость и осторожно пропипетировав осадок, добавили по 1 капле 0,5%-ного раствора глютарового альдегида, выдержали при комнатной температуре 20 минут. Затем отмыли 0,75 мл дистиллированной воды, стянули надосадочную жидкость пипеткой. Во все пробирки добавили по 0,5 мл 50%-ного раствора бычьей сыворотки, центрифугировали смеси 5 мин при 1500 об/мин, надосадочную жидкость слили, а из осадка сделали мазки, которые высушили на воздухе, зафиксировали этиловым спиртом 30 минут и окрасили по Романовскому-Гимза. Мазки просмотрели под микроскопом при 900-кратном увеличении.

Результаты исследования показали, что сыворотка крови больной миастенией вызывает снижение способности лимфоцитов донора, предварительно активированных раствором ацетилхолина, к розеткообразованию с ацетилхолиновым диагностикумом. Если исходное число розеткообразующих клеток в суспензии клеток крови донора составило 30%, то после добавлении сыворотки крови больной - всего 9%. Таким образом, число розеткообразующих клеток уменьшилось более, чем в 1,5 раза (в 3,3 раза) по сравнению с фоном. Иммунологический анализ подтвердил клинический диагноз: Миастения.

Пример 2. Больная К-на О. Ю.,34 года, поступила в клинику неврологии 14.10.1997 с жалобами на гнусавость голоса, нарастающую в процессе разговора, утомляемость жевательных мышц при еде, поперхивание жидкой пищей, утомляемость мышц шеи при небольшой физической нагрузке, общую слабость, нарастающую при ходьбе. Из анамнеза заболевания известно, что первые признаки заболевания появились в апреле 1993 года в виде эпизодов гнусавости голоса при разговоре и затруднения глотания твердой пищи, в июне 1993 эти симптомы стали постоянными. С этими жалобами обратилась к ЛОР-врачу, некоторое время лечилась с диагнозом: Хр. фарингит. Неврологом осмотрена в мае 1995 г., курс лечения, включающий кортикостероиды (преднизолон 50 mg) и АХЭ-препараты, дал хороший положительный эффект: почти полный регресс симптомов. В декабре 1995 вновь появилась гнусавость голоса при разговоре и после приема пищи. Симптомы заболевания постепенно нарастали.

При объективном исследовании обращает внимание легкая гипотрофия жевательных мышц, гнусавость голоса, нарастающая при разговоре. Затруднено глотание твердой пищи, мягкое небо свисает, больше справа. Небный и глоточный рефлексы снижены. Чувствительных нарушений нет, мышечная сила достаточная. Сухожильные и периостальные рефлексы живые, симметричные. Координация движений не нарушена. Прозериновая проба положительная. При компьютерной томографии вилочковой железы тимомы не обнаружено. Клинический диагноз: Миастения, локальная краниальная форма.

Больной проведено исследование сыворотки крови заявляемым способом. Для этого из локтевой вены больной было взято 2,0 мл крови. Путем центрифугирования в течение 5 минут при 1500 об/мин была выделена сыворотка, которая в целях инактивации инкубировалась при температуре +56^oC 30 минут.

Из вены донора взяли кровь в количестве 2,5 мл в центрифужную пробирку, содержащую 1,0 мл 5%-ного раствора цитрата натрия, смесь перемешали. После отстаивания внесли по 0,4 мл этой взвеси в 2 чистые центрифужные пробирки. В каждую пробирку добавляли по 3,0 мл дистиллированной воды для лизиса эритроцитов, затем по 3,0 мл 1,8%-ного раствора натрия хлорида для восстановления pH 7,2. Центрифугировали 5 минут при скорости 1,5 тыс. оборотов в минуту. Оттянув надосадочную жидкость из всех пробирок, добавили по 1 мл среды 199 в каждую пробирку, встряхнули и оставили в термостате на 15 минут при температуре +37,5^oC. Затем суспензию лимфоцитов центрифугировали 5 минут при 1,5 тыс. об/мин, надосадочную жидкость удалили, и внесли по 0,1 мл раствора, содержащего 100 мкг ацетилхолина. Смеси встряхнули и выдержали в термостате 30 минут при температуре +37,5^oC. Затем суспензию клеток центрифугировали 5 минут при 1,5 тыс. об/мин, надосадочную жидкость удалили, дважды отмыли изотоническим раствором натрия хлорида (pH 7,2) путем центрифугирования при скорости 1500 оборотов в минуту. Первую пробирку оставили временно без воздействия, а осадок второй пробирки соединили с 0,4 мл исследуемой сыворотки крови больной. Смесь осторожно встряхнули и инкубировали 35 минут при температуре +37,5^oC, затем лимфоциты дважды отмыли изотоническим раствором натрия хлорида (pH 7,2) путем центрифугирования при 1500 об/мин в течение 5 минут, надосадочную жидкость удалили. Затем в обе пробирки добавили по 1 мл среды 199 и инкубировали при температуре +37,5^oC. 15 минут, центрифугировали 5 мин при 1500 об/мин, надосадочную жидкость удалили. К полученным взвесям лейкоцитов добавили по 0,1 мл 0,5% взвеси эритроцитарного диагностикума, смеси инкубировали при температуре +37,5^oC в течение 15 мин, центрифугировали 5 мин при 1500 об/мин, выдержали 1 час в условиях холодильника (при температуре +5^oC). После инкубации во все пробирки, стянув надосадочную жидкость и осторожно взбив осадок, добавили по 1 капле 0,5%-ного раствора глютарового альдегида, выдержали при комнатной температуре 20 минут. Затем отмыли 0,75 мл дистиллированной воды, стянули надосадочную жидкость, добавили по 0,5 мл 50%-ного раствора бычьей сыворотки, центрифугировали смеси 5 мин при 1500 об/мин, надосадочную жидкость слили. Из осадка сделали мазки, которые высушили на воздухе, зафиксировали этиловым спиртом 30 минут и окрасили по Романовскому-Гимза.

При просматривании под микроскопом при 900-кратном увеличении обнаружено 27% розеткообразующих клеток в первом мазке и 8% - во втором. Таким образом, число розеткообразующих клеток во втором мазке уменьшилось более чем в 1,5 раза по сравнению с фоном, и иммунологическая проба подтверждает клинический диагноз: Миастения.

Пример 3. Больной Д-в, 43 года, поступил в клинику неврологии с жалобами на боли в поясничной области позвоночника, иррадиирующими по задне-боковой поверхности правой ноги до стопы, которые усиливались в положении сидя, онемение боковой поверхности правой стопы. Болен 4 года, обострения с частотой 1-2 раза в год, связаны с подъемом тяжести, переохлаждением. Последнее обострение за 2 недели до поступления в клинику. При объективном обследовании определяется вертебральный синдром в виде сглаженного поясничного лордоза, дефанса мышц поясницы, ограничения движения в поясничном отделе позвоночника, положительные симптомы натяжения (Ласега с двух сторон, больше справа), гипотония и гопотрофия мышц правой голени, гипестезия в дерматомах L5-S1 справа, снижение ахиллова рефлекса справа. При рентгенологическом исследовании поясничного отдела позвоночника в двух проекциях определялось снижение высоты межпозвонковых дисков L4-L5, L5-S1, лестничный спондилолистез. При компьютерной томографии заднелатеральный пролапс межпозвонкового диска L5-S.

Клинический диагноз: Остеохондроз поясничного отдела позвоночника, грыжа межпозвонкового диска L5-S1, корешковый синдром.

Больному проведено иммунологическое исследование заявляемым способом. С этой целью из локтевой вены больного было взято 2,5 мл крови, выделена сыворотка с последующей инактивацией ее.

Из вены донора взяли кровь в количестве 2,0 мл в центрифужную пробирку, содержащую 0,8 мл 5%-ного раствора цитрата натрия, смесь перемешали. После отстаивания внесли по 0,4 мл этой взвеси в 2 чистые центрифужные пробирки, лизировали эритроциты, добавив по 1 мл среды 199 в каждую пробирку, оставили в термостате на 20 мин при температуре +37^oC. Затем, надосадочную жидкость удалили центрифугировнием в течение 5 мин при 1,5 тыс. об/мин. Внесли по 0,1 мл раствора, содержащего 100 мкг ацетилхолина и выдержали в термостате 35 минут при температуре +37^oC. Суспензию клеток дважды отмыли изотоническим раствором натрия хлорида (pH 7,2). Первую пробирку оставили временно без воздействия. Осадок второй пробирки соединили с 0,4 мл исследуемой сыворотки крови больной, инкубировали 30 минут при температуре +37^oC, затем дважды отмыли изотоническим раствором натрия хлорида (pH 7,2). В обе пробирки добавили по 1 мл среды 199 и инкубировали при температуре +37^oC. 20 минут, центрифугировали 5 мин при 1500 об/мин, надосадочную жидкость удалили и добавили по 0,1 мл 0,5% взвеси эритроцитарного диагностикума. Смеси выдержали 20 мин при температуре +37^oC и 1 час в условиях холодильника (при температуре +4^oC). Стянув надосадочную жидкость и осторожно взбив осадок, добавили по 1 капле 0,5%-ного раствора глютарового альдегида, выдержали при комнатной температуре 20 минут, отмыв 0,75 мл дистиллированной воды, добавили по 0,5 мл 50%-ного раствора бычьей сыворотки, центрифугировали смеси 5 мин при 1500 об/мин, надосадочную жидкость слили. Из осадка сделали мазки, которые высущили на воздухе, зафиксировали этиловым спиртом 30 минут и окрасили по Романовскому-Гимза.

При иммунологическом исследовании крови заявляемым способом число РОК, специфичных ацетилхолину в исходной крови донора составило 28%, при добавлении сыворотки больного - 24%. Иммунная реакция для миастении не характерна.

Пример 4. В-ва И. В.,27 лет, практически здорова. Заявляемым способом проведено исследование сыворотки крови. Результаты: число розеткообразующих лимфоцитов донора, активированных ацетилхолином составило 34%, после обработки сывороткой крови обследуемой - 28%. Заключение: антител к холинорецепторам в крови В-вой И.В. не обнаружено.

Преимущества способа заключаются в его высокой специфичности и чувствительности, технической простоте исполнения, необходимости минимальных количеств доступных реактивов и несложного оборудования, что позволяет осуществлять проведение способа в условиях клиники.

Способ имеет большое практическое значение, так как дает возможность ранней диагностики заболевания и его дебютов, стертых, атипичных форм и дифференциального диагноза.

Способ может быть использован в области медицины, в частности в лабораторной диагностике. Способ обеспечивает упрощение исследования и повышение специфичности диагностики. Исследуют кровь здорового человека, обработанную раствором ацетилхолина с подсчетом в мазке розеткообразующих клеток до и после инкубации с инактивированной цельной сывороткой крови больного при 37-37,5°С в течение 30-40 мин и добавления к взвеси эритроцитов барана, нагруженных ацетилхолином. Подсчитывают в мазках количество розеткообразующих лимфоцитов и при уменьшении их количества в 1,5 и более раз по сравнению с фоном определяют миастению. 3 табл.

Способ диагностики миастении, включающий забор крови больного миастенией и выделение сыворотки, отличающийся тем, что исследуют кровь здорового человека, обработанную раствором ацетилхолина с последующим подсчетом в мазке розеткообразующих клеток до и после инкубации с инактивированной цельной сывороткой крови больного при температуре 37 - 37,5^oС в течение 30 - 40 мин и добавлением к взвеси эритроцитов барана, нагруженных ацетилхолином, подсчитывают в мазках количество розеткообразующих лимфоцитов и при уменьшении их количества в 1,5 и более раз по сравнению с фоном определяют миастению.