ШТАММ БАКТЕРИЙ RHODOCOCCUS ERYTHROPOLIS - ПРОДУЦЕНТ ГЛИКОЛИПИДОВ И БЕЛКОВОЙ БИОМАССЫ Российский патент 1998 года по МПК C12N1/20 C12P7/64 C12P19/28 C12P21/00 C12N1/20 C12R1/72 

Изобретение относится к микробиологической промышленности и представляет новый промышленный непатогенный штамм бактерий Rhodococcus erythoropos S-1379 (ВСБ-655), способный как синтезировать гликолипиды, так и образовывать белковую биомассу. Характеризуется высокой продуктивность при культивировании на нефти, продуктах нефтепереработки, глюкозе, декстринах, органических кислотах.

Гликолипиды - поверхностно-активные вещества, добавление которых в воду снижает поверхностное натяжение воды и межфазное натяжение в системе "вода - углеводороды". Очищенные препараты гликолипидов могут быть использованы в фармацевтических препаратах, в качестве стабилизаторов мазей, эмульсий; а технические препараты при их введении вместе с потоком воды в скважину способствуют повышению нефтеотдачи, при этом они более экологически безопасны, чем химически синтезированные ПАВ, так как разрушаются природными микроорганизмами.

Гликолипиды продуцируются штаммами разных видов и родов: Actinomyces, Arthrobacter, Corynebacteria, Micobacteria, Nocardia (Ahibo-Coffy, A. Aurell, H. Lacave, C. Pronee, J.C. Phys, Lipids 22, 185-192, Brennan P.J., Lehane, D. P. and Thomas, D.W. (1970), Eur. J.Biochem. 13, 117-123, Suzuki, T (1974) Agric. Biol. Chem, 38, 1443-1449, а.с.CCCР N 556176, кл. C 12 K 1/02.

Однако, синтезируемые известными штаммами микроорганизмов гликолипиды содержатся в небольшом количестве (до 1 г/л) в культуральной жидкости, а состав гликолипидов таков, что они не обеспечивают понижение поверхностного натяжения воды ниже 50 нМ/м.

Наиболее близким по биосинтетической активности является штамм Mycobacterium mucosum ИБФМ В-292 а.с.CCCP N 556176, кл. C 12 K 1/02. Этот штамм использует углеводороды, нефтепродукты, ассимилирует глюкозу, мальтозу, галактозу, арабинозу. Синтезирует гликолипиды, концентрация которых не превышает 0,5 г/л. Добавление выделенных из культуральной жидкости гликолипидов в воду вызывало снижение поверхностного натяжения на границе вода - воздух до 55 мН/м.

Недостатками известного штамма являются: низкая продуктивность по гликолипидам, что делает экономически малоэффективным их получение методом микробиологического синтеза. В связи с изложенным, задача предлагаемого изобретения заключалась в селекции активного непатогенного штамма бактерий, характеризующегося производственными свойствами: способностью сверхсинтеза гликолипидов, высокой продуктивностью, технологичностью при непрерывном культивировании на глюкозе, углеводородах, мальтозе, декстринах, органических кислотах.

Предлагаемый новый штамм бактерий выделен из почвы около нефтяной скважины методом накопительных культур и последующего выращивания из одиночной колонии на твердой питательной среде с добавлением тяжелых фракций углеводородов. Было исследовано более 50 изолятов, из них было отобрано 5 наиболее активных изолятов с активностью синтеза гликолипидов более 1 г/л. Изоляты были испытаны в условиях культирования в аппарате интенсивного массообмена на синтетической питательной среде, содержащей (г/л): MgSO₄•7 H₂O - 0,7; ZnSO₄•7 H₂O - 0,12; MnSO₄•5 H₂O - 0,12; (NH₄)SO₄ - 2,0; KH₂PO₄ - 6,5; углеводороды - 20,0, глюкозу - 3,0 при температуре 28^oC, pH 7,0. Определяли поверхностное натяжение на границе с воздухом и межфазное натяжение на границе фаз вода-гексадекан методом отрыва платинового кольца по Дю - нуи стегленометрически. Содержание гликолипидов определяли весовым методом после хроматографического разделения в тонком слое.

Определение систематического положения отобранного штамма проведенное в соответствии с определителем бактерий Bergey's Manual of Determinative Bacteriology. Baltimore, показало принадлежность его к Rhodococcus erythopolis.

Определение степени патогенности селекционирования штамма Rhodococcus erythopolis подтвердило отсутствие патогенности.

Характеристика штамма бактерий Rhodococcus erythropolis S-1379.

Культурально-морфологические признаки: колонии на мясо пептонном агаре при культивировании при T = 28^oC блестящие, гладкие, бежевого цвета с ровным краем. Размер колоний не превышает 5,0 мм через трое суток после высева.

На жидкой питательной среде Таусона через двое суток роста при T = 28^oC, при перемешивании клетки образуют небольшие цепочки, встречаются одиночные кокки, размер клеток не превышает 4-5 мкм.

На сусло-агаре культура колоний не образует.

Физиолого-биохимические признаки: ассимилирует мальтозу, сахарозу, глюкозу, углеводороды, этиловый спирт, нефтепродукты, глицерин. Потребляет уксусную, пропионовую, масляную, лимонную, салициловую кислоту.

Ассимилирует аммонийный азот, нитратный азот. Не требует добавок факторов роста и витаминов в питательную среду для выращивания.

Желатину не разжижает, крахмал не гидролизует.

Кислотообразование при росте на сахарах и углеводородах слабое.

Растет в диапазоне температуры от 4 до 35^oC. Оптимальное значение температуры 28^oC. Растет при pH от 3,5 до 9,0, оптимальное значение pH = 6,9. Способен расти на средах с содержанием солей до 30 г/л.

Штамм ВСБ-655 депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов Государственного научно-исследовательского института Генетики под номером S-1379.

Штамм Rhodococcus erythropolis S-1379 был испытан в камеральных условиях в ферментере V = 5 л, n = 1200 об/мин при аэрации 0,6 м/ч, pH = 7,0 на синтетической питательной среде, состав которой варьировали в зависимости от цели эксперимента. Процесс выращивания проводили с целью направленного биосинтеза гликолипидов, либо с целью получения белковой биомассы. В первом случае выращивание вели в лимите по азоту, питательная среда имела следующий состав: углеводороды - 20 г/л, глюкоза - 10 г/л, H₃PO₄ - 0,7 г/л, KCL - 0,6 г/л, MgSO₄ 5•H₂ O - 0,5 г/л, ZnSO₄• 7•H₂O - 0,017 г/л, MnSO₄ • 5H₂O - 0,0102 г/л, (NH₄)₂SO₄ - 2 г/л. Титрование вели первые 20 ч 5%-ным раствором NH OH, далее 5%-ным раствором NaOH.

В табл. 1 представлены показатели периодического процесса культивирования бактерий с целью получения белковой биомассы.

В табл. 2 представлены показатели периодического процесса культивирования бактерий с целью накопления гликолипидов в среде.

Во втором случае вели процесс при следующем составе питательной среды: углеводороды - 25 г/л; H₃PO₄ - 0,7 г/л; KCl - 0,6 г/л; MgSO₄ • 7H₂O - 0,5 г/л; ZnSO₄ • 7H₂O - 0,017 г/л; MnSO₄ • 5H₂O - 0,01 г/л; (NH₄)₂SO₄ - 4 г/л.

Титрование в процессе всего выращивания проводили 5%-ным раствором.

Засевную биомассу готовили путем выращивания односуточной культуры бактерий на вышеприведенной среде, в которой источником углерода служили углеводороды - 2%, при T = 28^oC, pH - 7,0.

Для сравнительной оценки исследования были проведены со следующими штаммами бактерий, способных синтезировать гликолипиды: Mycobacterium mucosum ИВФМ - 292, Pscudoinonas pscudoalkalygene ВКПМ В 2-6783, Rhodococcus erythropolis S-884 табл. 1, 2. Штамм бактерий Rhodococcus erythnopolis показал лучшие результаты в камеральных испытаниях. При периодическом выращивании табл. 1 штамм Rhodococcus erythropolis S-1379 имел выход от субстрата 90%, содержание сырого протеина % составило 75%. Штамм Rhodococcus erythropolis S-884 в этих же условиях имел следующие показатели: выход 85%, содержание сырого протеина 60-65%.

При направленном биосинтезе гликолипидов табл. 2 штамм Rhodococcus erythropolis S-1379 синтезировал до 3,0 г/л гликолипидов, в то время как штамм Rhodococcus erythropolis S-884 синтезировал в этих же условиях до 2,2 г/л гликолипидов.

Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения:
Пример 1. Штамм бактерий Rhodococcus erythropolis S-1379 культивировали в периодической культуре в лабораторном ферментере, с рабочим объемом 5 л на минеральной среде, следующего состава: H₃PO₄ - 0,7 г/л; KCl - 0,6 г/л; MgSO₄ • 7H₂O - 0,5 г/л; ZnSO₄ • 7H₂O - 0,017 г/л; MnSO₄ • 5H₂O - 0,01 г/л; (NH₄)₂SO₄ - 2 г/л. В среду вносили 20 г/л углеводородов, этанола - 20 г/л, глюкозы 1 г/л. Выращивание вели при T = 28^oC, pH 5,5 при перемешивании n = 1200 об/мин, аэрации 0,6 м³/ч. По мере исчерпания источников углерода в среду вносили углеводороды, этанол, глюкозу в выше приведенном соотношении. Первые 20 ч вели титрование 5%-ным раствором NH₄OH, далее 5%-ным раствором NaOH. Выращивание вели в течение 2-х сут. В процессе выращивания определяли в среде содержание углеводородов методом ИК-спектроскопии и содержание гликолипидов методом тонкослойной хроматографии. В результате эксперимента было синтезировало 3,5 г/л гликолипидов.

Пример 2. Штамм бактерий Rhodococcus erythropolis S-1379 культивировали на питательной среде, следующего состава: H₃PO₄ - 0,7 г/лж KCl - 0,6 г/лж MgSO₄ • 7H₂O - 0,5 г/л; ZnSO₄ • 7H₂O - 0,01 г/л; (NH₄)₂SO₄ - 4 г/л в ферментере, с рабочим объемом 5 л, при T = 28^oC, pH = 7,0. Углеводороды вносили в зону выращивания в количестве 25 г/л. Титрование вели 5%-ным раствором NH₄OH. Культивирование проводили в течение 24 ч. В результате была получена биомасса с содержанием сырого протеина 75%.

Пример 3. Штамм бактерий Rhodococcus erythropolis S-1379 культивировали в периодической культуре также как и в примере 2, только в качестве углеродного субстрата использовали мальтозу - 20 г/л и глюкозу - 3 г/л, при этом была получена биомасса с содержанием сырого протеина до 70%.

Пример 4. Штамм Rhodococcus erythropolis S-884 выращивали также как в примере 1, при этом в культуральной жидкости в конце выращивания содержалось до 2,1 г/л гликолипидов.

Пример 5. Штамм Rhodococcus erythropolis S-884 выращивали также как в примере 3. Содержание сырого протеина составило 59,3% в полученной биомассе.

Пример 6. Штамм Rhodococcus erythropolis S-1379 культивировали в непрерывной культуре в ферментере V = 5 л в течение 10 дней при аэрации и перемешивании на питательной среде см. пример 1 при D = 0,1 ч^-1. В полученной биосуспензии накапливалось до 2,8 г/л гликолипидов.

Таким образом, на основании проведенных исследований можно заключить, что предлагаемый штамм Rhodococcus erythropolis S-1379 является новым углеводород-, углевдассимилирующим штаммом, характеризующийся следующими отличительными признаками от прототипа Mycobacterium mucisum ИБФМ В-292:
- активно синтезирует гликолипиды в количестве до 3,5 г/л при выращивании на смеси углеводородного и углеводного субстратах;
- активно растет, образуя биомассу с содержанием сырого протеина до 75%;
- стабилен и устойчив при непрерывном культивировании по своим морфолого-культуральным и физиологическим свойствам.

На основании данных приведенных исследований штамм бактерий Rhodococcus erythropolis S-1379 рекомендован в качестве продуцента при производстве гликолипидов и при получении белковой кормовой биомассы.

Новый штамм бактерий Rhodococcus erythropolis ВКПMS-1379, который способен активно синтезировать гликолипиды в количестве до 3,5 г/л, активно растет на углеводных и углеводородных субстратах, образуя биомассу с содержанием сырого протеина до 75%. Штамм стабилен и устойчив при непрерывном культивировании по своим морфолого-культуральным и физиологическим свойствам. Технический результат состоит в повышении содержания белка в биомассе и высокая продуктивность по гликолипидам. 2 табл.

Штамм бактерий Rhodococcus erythropolis ВКПМ S-1379 продуцент гликолипидов и белковой биомассы.