ШТАММ ГРИБА ASPERGILLUS NIGER - ПРОДУЦЕНТ ЛИМОННОЙ КИСЛОТЫ Российский патент 1998 года по МПК C12N1/14 C12P7/48 

Предлагаемое изобретение относится к области микробиологической промышленности и представляет новый непатогенный штамм гриба Aspergillus niger (ВСБ-945(2)), способный синтезировать лимонную кислоту при глубинном культивировании.

Лимонная кислота, полученная микробиологическим путем, находит применение как в пищевой, так и в легкой промышленностях.

Лимонная кислота может образовываться в результате метаболизма грибных, дрожжевых, бактериальных культур (Journal of science, 1986, 51, n 2, Биотехнология, 1992, 1, с. 46-49, заявка ФРГ N 3417777, заявка Великобритании N 1603887).

В качестве источника углерода при биосинтезе лимонной кислоты чаще всего используют пищевые источники углерода: сахар, мелассу, а в качестве продуцентов гриб Aspergillus niger. Однако с точки зрения экономической эффективности использование таких непищевых источников углерода, как этиловый спирт предпочтительнее. Существующие штаммы микроорганизмов не способны эффективно синтезировать лимонную кислоту, используя технический спирт в повышенных концентрациях в среде.

Наиболее близким по биосинтетической активности является штамм Aspergillus niger F-710. При выращивании этой культуры на сахарозе выход лимонной кислоты составляет 90-95% (Авчиева П.Б., Винаров А.Ю., Козлова И.А. Биосинтез лимонной кислоты из глюкозы при непрерывной ферментации Asporgillus niger. Прикладная биохимия и микробиология. Т.29, 1993, вып. 4, с. 567-575), однако на этиловом спирте лимонная кислота синтезируется этим штаммом с выходом 50%, при этом концентрация в среде этилового спирта больше 2,5% ингибирует рост культуры, что усложняет проведение процесса ферментации.

В связи с изложенным задача предлагаемого изобретения заключалась в селекции активного непатогенного штамма гриба Aspergillus niger, характеризующегося производственными свойствами, способностью синтеза лимонной кислоты на этиловом спирте и сахарозе, высокой продуктивностью, технологичностью при выращивании.

Предлагаемый новый штамм гриба Aspergillus niger F-722 получен автоселекцией штамма Aspergillus niger F-710 на минеральной питательной среде, содержащей этиловый спирт 4-6%, сахарозу 3%, сернокислый аммоний 2 г/л, калий фосфорнокислый однозамещенный 1,5 г/л, сернокислый магний 0,5 г/л, сернокислый цинк семиводный 0,01 г/л.

Посев клеток производился двухсуточной культурой гриба Aspergillus niger F-710 по 1 петле на жидкую питательную среду (100 мл). Выращивание вели при перемешивании, аэрации, температуре 30^oC в течение 45 сут.

В процессе выращивания и в конце выращивания определяли содержание лимонной кислоты методом окислительного бромирования, основанного на образовании пентабромацетона с последующим спектральным анализом.

Ив двух полученных суспензий (4% этилового спирта и 6% этилового спирта) были посеяны культуры на сусло-агар, на качественную среду с добавлением индикатора бромкрезолзеленого.

Разведения подбирали так, чтобы вырастало 50-80 колоний. Из каждой экспозиции выбирали колонии, которые окрашивали в ярко-желтый цвет. Отобранные 20 культур грибов выращивали на питательной среде приведенного вышe состава в течение 7 сут. В культуральной жидкости определяли содержание лимонной кислоты. На основании полученных результатов был отобран штамм гриба Aspergillus nuger ВСБ-945(2).

Приспособившийся к потреблению этилового спирта в высоких концентрациях штамм проверяли на устойчивость вновь приобретенного свойства. Он пересевался на жидкую питательную среду, содержащую источники минеральных солей, азота, фосфора, а также источники углерода: этиловый спирт, сахарозу, взятых в различных концентрациях.

При пересеве клеток Aspergillus niger ВСБ-945(2) на агаровую среду с концентрацией 4% этилового спирта клетки приспособившегося штамма образуют колонии большего размера, чем клетки гриба Aspergillus niger F-710 через трое суток выращивания.

Определение систематического положения отобранного штамма, проведенное в соответствии с определителем грибов (Bergey s Manual of Systematic Bacteriology - Baltimore. Hong-Kong : London : Sydney, 1989,V. 1,2,3,4).

Определение степени патогенности селекционированного штамма Aspergillus niger подтвердило отсутствие патогенности.

Характеристика штамма грибов Aspergillus niger F-722.

Культуральные признаки: колонии на сусло-агаре белые, мохнатые, через трое суток наблюдается образование спор коричневого цвета при Т-30^oС. При выращивании на среде Чапека при Т = 28^oC, рH 6,0 образуется разветвленный мицелий гриба без зернистых включений. На МПА рост отсутствует.

Морфологические признаки: мицелий состоит из гиф, переплетенных между собой, бесцветных, диаметр гиф 3-6 мкм. При поверхностном росте возвышаются органы плодоношения - конидиеносцы, представляющие собой утолщенные несептированные гифы длиной до 2000 мкм.

Физиолого-биохомические признаки: ассимилирует этиловый спирт, сахарозу, глюкозу. Не нуждается в витаминах и в факторах роста. Расчет при температуре 20-40^oC, оптимальные значения 28-30^oC, растет при pH 1,0-7,0, оптимальные значения 5,8-6,2.

Штамм Aspergillus niger ВСБ-945(2) депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов Государственного научно-исследовательского института Генетики под номером F-722.

Штамм Aspergillus niger F-722 был испытан в камеральных условиях в ферментере Y 20 л, Т = 130^oC, n = 400 об/мин при аэрации 0,3 м³/ч, PH 1,5-6,5 на синтетической питательной среде, следующего состава: этиловый спирт 3%, сернокислый аммоний 2 г/л, калий фосфорнокислый однозамещенный 1,5 г/л, сернокислый магний 0,5 г/л, сернокислый цинк семиводный 0,012 г/л, в течение 30 ч, при этом этиловый спирт вносили дробно: концентрация этилового спирта в среде не превышала 2,5%. Засевную биомассу готовили путем выращивания двухсуточной культуры грибов на вышеприведенной среде.

Для сравнительной оценки исследования были проведены со следующими штаммами гриба: Aspergillus niger F-710, Aspergillus niger F-228.

При выращивании гриба Aspergillus niger F-722 на питательной среде, содержащей этиловый спирт, синтезировал лимонную кислоту с выходом 80% от поданного субстрата, в то время как штаммы грибов F-228, F-710 показали низкую синтетическую активность (выход составил 48% и 52% соответственно).

Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения.

Пример 1. Штамм гриба Aspergillus niger F-722 культивировали в лабораторном ферментере с рабочим объемом 20 л на минеральной среде, следующего состава: сернокислый аммоний 2 г/л, калий фосфорнокислый однозамещенный 1,5 г/л, магний сернокислый 0,5 г/л, сернокислый цинк 0,012 г/л. В среду вносили 2% этилового спирта, 7% сахарозы. Выращивание вели при Т = 32^oC, исх. pH 6,5 при перемешивании 400 об/мин, аэрации 0,4 м³/ч., PH не поддерживали. В результате эксперимента было синтезировано 100 г/л лимонной кислоты, выход составил 110%.

Пример 2. Штамм гриба Aspergillus niger F-722 выращивали также, как в примере 1, только в питательной среде содержалось 4% этилового спирта, 6% сахарозы. Выход продукта биосинтеза - лимонной кислоты составил 93%.

Пример 3. Штамм Aspergillus niger F-710 выращивали также, как в примере 1, при этом выход лимонной кислоты от поданных углеродсодержащих субстратов составил 90%.

Таким образом, на основании проведенных исследований можно заключить, что предлагаемый штамм Aspergillus niger F-722 является этанол-ассимилирующим продуцентом лимонной кислоты, характеризующийся следующими отличительными признаками от прототипа Aspergillus niger F-710:
синтезирует лимонную кислоту на питательной среде, содержащей повышенные концентрации этилового спирта и сахарозы, при этом выход от субстратов составляет 90-110%;
устойчив по своим морфолого-культуральным и физиологическим свойствам.

На основании данных приведенных исследований штамм гриба Aspergillus niger F-722 рекомендован в качестве нового продуцента лимонной кислоты.

Использование: биотехнология, микробиология. Сущность изобретения: новый штамм гриба Aspergillus niger ВКПМ F - 722 - продуцент лимонной кислоты, который способен синтезировать лимонную кислоту с 80% выходом от содержащегося в среде этилового спирта, 110%- ным от смеси этилового спирта и сахарозы. Использование штамма позволяет применять в качестве углеродсодержащего субстрата сахаросодержащие среды с повышенным содержанием этилового спирта.

Штамм гриба Aspergillus niger ВКПМ F-722 продуцент лимонной кислоты.