СПОСОБ НАПРАВЛЕННОГО БИОСИНТЕЗА ЛИМОННОЙ КИСЛОТЫ Российский патент 1997 года по МПК C12P7/48 C12N1/14 C12N1/16 C12N1/38 

Изобретение относится к биотехнологии, а именно, к способам получения лимонной кислоты.

Лимонная кислота используется в фармацевтической, пищевой и кондитерской промышленностях, ее потребность возрастает.

Лимонную кислоту синтезируют микроорганизмы различных родов и видов, в основном, в промышленности культивируют грибы Aspergillus niger, потребляющие углеводсодержащие субстраты (Biotechnol. Lett, 1985, 7, N11) и дрожжи Candida lipolytica (заявка ФРГ 2002028, заявка Японии 55-1039), утилизирующие непищевые источники углерода, такие как углеводороды, спирты.

При этом основным недостатком способов выращивания грибов Aspergillus niger является то, что процесс синтеза лимонной кислоты длителен 5-7 суток. Использование же дрожжевых культур p. Candida ограничено сырьевой базой, так большинство штаммов дрожжей p. Candida не способны инвертировать сахар, потреблять пивную дробину, необработанное зерно и др. к тому же при потреблении углеводородов и этилового спирта дрожжи синтезируют смесь лимонной и изолимонных кислот, что вызывает дополнительные сложности при выделении лимонной кислоты, в связи с чем повышается ее себестоимость.

Наиболее близким является способ получения лимонной кислоты при глубинном выращивании грибов Aspergillus niger на сахаре (Смирнов В.А. Пищевые кислоты. М. Лесная и пищевая промышленность, 1983 г. стр.94-97( грибы Aspergillus niger предлагается выращивать на питательной среде, содержащей источники Fe, Mg, Mn, Zn, Cu, K, в лимите по азоту, фосфору при избытке углеродсодержащего субстрата, при перемешивании, аэрации. Выращивание проводили в течение 7-9 суток, при этом выход лимонной кислоты от поданного субстрата составлял 100%
Недостатком выше описанного способа является то, что процесс длительный, себестоимость продукции высокая из-за больших энергозатрат на стадии выращивания.

Предлагаемое изобретение решает следующую научно-техническую задачу: снизить себестоимость лимонной кислоты.

Технический результат предлагаемого способа заключается в сокращении времени биосинтеза.

Данный технический результат достигается тем, что биосинтез лимонной кислоты осуществляется на питательной среде, содержащей сахар, источники минерального питания, в условиях аэрации и перемешивания, в качестве продуцентов используют консорциум штаммов Aspergillus niger и дрожжей Candida lipolytica, причем дрожжи засевают по достижении концентрации грибов 5-10 г/л, остаточного неинвертированного сахара 10-40% от исходного содержания сахара, вносят биокатализатор N-трис-(гидроксиэтил)аммониевую соль метилфенил сульфонилуксусной кислоты в количестве 10^-5-10^-7г/л, при этом засевная концентрация дрожжей составляет 10-80% от текущей концентрации грибов.

Перечисленные признаки в совокупности обеспечивают более полное потребление субстратов, уменьшение сроков выращивания до 4-х суток за счет более высокой скорости синтеза лимонной кислоты консорциумом микроорганизмов при внесении биокатализатора.

Сущность способа направленного биосинтеза лимонной кислоты заключается в том, что на питательную среду, содержащую хлористый аммоний 1 г/л, однозамещенный фосфат калия 0,3 г/л, сернокислый цинк, водный 0,02 г/л, сахар 5% засевали консорциум грибов Aspergillus niger выращивали при перемешивании и аэрации в аппарате V 3 л до концентрации сухих грибных клеток 5-10 г/л, остаточного неинвертированного сахара 10-40% от исходного сахара в среде при Т-32С, pH 5,5, pH поддерживали внесением 10-ного NaOH, далее вносили биокатализатор N-трис-гидроксиэтил-аммониевую соль метилфенил сульфонилуксусной кислоты в количестве 10^-5-10^-7 г/л, засевали культуру дрожжей Candida lipolytica в количестве 10-80% от текущей концентрации грибов и вели выращивание до окончания процесса синтеза лимонной кислоты. В культуральной жидкости определяли в процессе выращивания содержание лимонной кислоты спектрофотометрическим методом, концентрацию биомассы - весовым методом.

Выбранный диапазон концентраций биокатализатора определялся тем, что при концентрации меньше 10 г/л активация дыхания в клетках не происходила, а внесение более высоких концентраций более 10 г/л оказывало воздействие значительно, но при этом резко повышалась себестоимость процесса.

Использование консорциума штаммов обусловлено комменсализмом грибов Aspergillus niger и дрожжей Candida lipolytica: дрожжи Candida lipolytica не способны синтезировать ферменты, инвертирующие сахар, гидролизующие зерно, муку, также штаммы дрожжей p.Candida являются биотин и тиаминзависимыми, в то время как штаммы Aspergillus niger способны синтезировать перечисленные выше ферменты и обладают способностью синтезировать тиамин. При этом дрожжи Candida lipolytica, так и грибы Aspergillus niger способны синтезировать лимонную кислоту, а скорость синтеза лимонной кислоты у дрожжей Candida lipolytica выше, чем у грибов и это присуще всем штаммам грибов Aspergillus niger и дрожжей Candida lipolytica.

Нами была проведено исследование возможности совместного существования исследуемых культур. Для чего была оценена протеолитическая активность грибов Aspergillus niger. Были рассмотрены шесть пар гриб. Aspergillus niger и дрожжей Candida lipolytica. Выращивали грибы и дрожжи совместно в колбах на качалке при оптимальных температурах, pH, составе питательной среды, источнике углерода. Биомассу отделяли от культуральной жидкости и определяли содержание протеолитических ферментов в культуральной жидкости. Для этого в две пробирки с буфером и мертиолатом добавляли по 1 мл суспензии дрожжей Candida lipolytica, затем в одну из пробирок (контроль) вносили 1 мл воды, а в другую (опыт) 1 мл культуральной жидкости. Измеряли исходную оптическую плотность суспензий в обеих пробирках, затем помещали их на водяную баню при 40^oC на 1 ч, после чего опять измеряли оптическую плотность. В случае уменьшения оптической плотности считали, что протеолитическая активность проявляется. Во всех исследуемых вариантах сочетания грибов Aspergillus niger и дрожжей Candida lipolytica отсутствовал лизис как грибных, так и дрожжевых культур.

Таким образом использование консорциума позволяет ускорить процесс синтеза лимонной кислоты на таких субстратах как сахар, зерно, мука.

В табл. 1 приведена зависимость выхода лимонной кислоты от величины засевной биомассы дрожжей Candida lipolytica ВКПМ Y-2206 при концентрации грибов Aspergillus niger ВКПМF-710 в момент засева 7 г/л.

При засеве дрожжей в количестве меньшем, чем 10% от концентрации грибов, через 4-ро суток выход был на уровне контрольного варианта культивирование одной грибной культуры. При увеличении величины засевного материала дрожжей от 10 до 80% культивирование консорциума обеспечивает активный синтез лимонной кислоты: выход 98-102% в прототипе выход 100% через 168 ч ферментации. Увеличение засевной биомассы дрожжей до 90% от концентрации грибов приводит к некоторому снижению выхода лимонной кислоты, что связано с увеличением концентрации изолимонной кислоты. Штамм Candida lipolytica /опыт 7/ не способен синтезировать лимонную кислоту на сахаре выход 10%
В табл. 2 показано, как влияет концентрация грибной культуры в аппарате в момент засева дрожжевой культуры на выход лимонной кислоты. Концентрация засевной биомассы дрожжей составляла во всех случаях 60% от концентрации грибов.

При концентрации грибов меньше 5 г/л, выход через 4-ро суток составил 75% что связано с низкой концентрацией инвертированного сахара в момент засева дрожжей, при увеличении концентрации грибов в момент засева дрожжей до 12 г/л снижается выход вследствие увеличения вязкости суспензии, ухудшения массообмена в аппарате.

Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения.

Пример 1. Выращивали грибы Aspergillus niger ВКПМ F-710 в ферментере V 3 л, Т выращивания 32^oC на питательной среде при перемешивании n 350 об/мин, аэрации. В исходную питательную смесь вносили 5% сахара, хлористый аммоний 1 г/л, однозамещенный фосфат калия 0,3 г/л, сернокислый цинк, водный 0,05 г/л. В процессе выращивания измеряли АСВ 8г/л при значении АСВ= 5 г/л, остаточном содержании неинвертированного сахара 30% в среду выращивания добавляли N-трис-/гидроксиэтил/аммониевую соль метилфенилсульфонил-уксусной кислоты в количестве 10 г/л, засевали дрожжи Candida lipolytica ВКПМ Y-2206 в количестве 80% от текущей концентрации грибов. Через 4 суток после начала выращивания выход лимонной кислоты от поданных субстратов составил 100%
Пример 2. Выращивание проводили также, как в примере 1, но в качестве грибов использовали штамм Aspergillus niger ВКМF-228, дрожжей Candida lipolytica ВКПМ Y-2206, вносили в количестве 60% от текущей концентрации грибов, при концентрации грибов 10 г/л и содержании неинвертированного сахара 10% Выход лимонной кислоты от поданных субстратов составил 102% через 4 суток после начала выращивания.

Пример 3. Выращивание вели также как в примере 1, но в качестве продуцентов использовали штамм Aspergillus niger ВКПМF-710 и штамм Candida lipolytica ВКМ Y-912. Выход лимонной кислоты на 4-е сутки составил 105%
Пример 4 /по прототипу/. Выращивали грибы Aspergillus niger F-710 также, как в примере 1, но без добавления дрожжевой культуры и биокатализатора. Выход лимонной кислоты от поданного сахара составил 90% через дней до начала выращивания.

Пример 5. Выращивание проводили так же, как в примере 1, но качестве грибов использовали штамм Aspergillus niger ВКПМ F-722, дрожжи Candida lipolytica ВКПМ Y-2206 вносили в количестве 60% от текущей концентрации грибов, при концентрации грибов 10 г/л и содержании неинвертированного сахара 10% Выход составил 108% через 4 суток после начала выращивания.

Таким образом, реализация процесса по предлагаемому способу позволяет сократить время выращивания с 7 до 4-х суток, что значительно снижает энергозатраты на стадии выращивания, тем самым снижает себестоимость лимонной кислоты.

Использование: биотехнология, биосинтез лимонной кислоты. Сущность изобретения: способ заключается в выращивании на питательной среде, содержащей сахар, источники минерального питания, в условиях аэрации и перемешивания консорциума штаммов грибов Aspergillus niger и дрожжей Candida lipolytica, причем дрожжи засевают по достижении концентрации грибов 5-10 г/л, остаточного сахара 10-40% от исходного неинвертированного сахара, вносят биокатализатор N-трис-/гидроксиэтил/ аммониевую соль метилфенил сульфонилуксусной кислоты в количестве 10^-5-10^-7 г/л, при этом засевная концентрация дрожжей составляет 10-80% от текущей концентрации грибов. 2 табл.

Способ направленного биосинтеза лимонной кислоты путем культивирования микроорганизмов на питательной среде, содержащей сахар, источники минерального питания, в условиях перемешивания и при аэрации, отличающийся тем, что в качестве продуцента используют консорциум культур гриба Aspergillus niger и дрожжей Candida lipolytica, причем сначала в питательную среду вносят культуру гриба, а дрожжи засевают по достижении концентрации гриба 5 10 г/л и достижении концентрации остаточного инвертированного сахара 10 40% от исходного при засевной дозе дрожжей 10 80% от текущей концентрации гриба и на стадии засева дрожжей вносят биокатализатор -N-трис(гидроксиэтил)аммониевую соль метилфенилсульфонилуксусной кислоты в количестве 10^- 5 - 10^- 7 г/л.