ШТАММ БАКТЕРИЙ ACINETOBACTER JWOFFI 7, ОБЛАДАЮЩИЙ СПОСОБНОСТЬЮ УТИЛИЗИРОВАТЬ УГЛЕВОДОРОДЫ Российский патент 1997 года по МПК C12N1/20 C02F3/34 B09C1/10 C12R1/01 C12N1/20 

Изобретение относится к области прикладной микробиологии, а именно к штаммам микроорганизмов, способных утилизировать углеводороды.

Известна возможность ряда микроорганизмов утилизировать углеводороды. В частности, для этих целей используют Aspergillus niger, Aspergillus sp. Candida tropical, Pseudomonas putida /1- 3/.

Наибольшую известность для указанных целей получили штаммы Ps. putida, на основе которых был получен препарат "Путидойл" /4/. Однако указанный препарат эффективно не действует на все виды углеводородов или их смесей, что заставляет искать более активные в указанном отношении микроорганизмы.

Бактерии рода Acinetobacter являются широко распространенными всеядными хемогетеротрофами с окислительным метаболизмом. Они способны использовать в качестве источника углерода и энергии различные органические вещества, что делает их перспективными для использования для экологических целей, в частности переработки углеводородов нефти и нефтепродуктов /5, 6/.

Из возможных областей применения Acinetobacter следует отметить способность Acinetobacter calcoaceticus NCIB 8250 расти на средах, содержащий до 1 мг/л фенола /7/.

Использование Acinetobacter в качестве активного начала для нефтедеградирующих препаратов в просмотренной литературе не обнаружено.

Задачей, решаемой в рамках настоящего изобретения, явилось получение штамма бактерий Acinetobacter, способного утилизировать углеводороды.

Указанная задача была решена получением штамма Acinetobacter Iwoffi 7.

Штамм был выделен из образцов почвы Катангского района Иркутской области на среде, содержащей углеводороды, и селектирован по максимальной способности утилизировать пентадекан.

Штамм выращивают при 28^oC в течение 48 часов на жидкой питательной среде, содержащей гидролизат кильки 10,05 г; хлорид натрия 4,95 г; воды дистиллированной до 1 л; pH (до автоклавирования) -7,1.

В бульоне однородная муть и слабый мелкодисперсный осадок. Консистенция бульона вязкая. При просеве в полужидкие среды (0,6% агар) и в толщину плотной питательной среды (1,5% агар) рост в толще агара отсутствует. Рост колоний наблюдается только на поверхности питательной среды.

На поверхности плотной питательной среды колонии имеют правильную круглую форму. Диаметр колоний 2 3 мм. Колонии гладкие, выпуклые, беловатые, окружены прозрачным ореолом неправильной формы. Край колонии гладкий, по мере старения колонии (через 6 суток) он становится волнистым.

Пигмент, диффундирующий в питательную среду, отсутствует.

Морфология клеток грамотрицательные клетки округлой формы. Диаметр клетки 1,2 мкм. Жгутиков и пилей не имеют. Клетки одиночные и диплококки, неподвижные.

Физиологическая характеристика штамма: аэроб, неподвижный каталого-положительный, оксидазо-отрицательный, не разжижает желатину. Не растет на глюкозе, сахарозе, лактозе, мальтозе, L-арабизоне, манните, сорбите, глицерине, L-β-фенилаланине, цитрате натрия, L-гистидине, если они используются в качестве единственного источника углерода.

При вращении на минимальных средах может использоваться в качестве единственного источника углерода метанол, этанол, твин-80, декан, додекан, пентадекан, гексадекан, вазелин. Растет в среде, содержащей ампициллин в концентрации 100 мкг/мл.

Анаэробный тест Хью-Лейфсона отрицательный. Не образует индола, на среде Клингера не выдает сероводорода. Гемолиз на кровяном агаре отсутствует.

Не имеет нитратредуктазы, аргининдегидролазы, лизиндекарбоксилазы, орнитиндекарбоксилазы, триптофандезаминазы.

Штамм может расти в диапазоне pH 6,5-9,5. Оптимальное значение pH среды 7,2.

Диапазон температур 20 30^oC. Оптимальная температура роста - 28^oC.

Штамм не обладает азотфиксирующими свойствами. Не патогенен.

Штамм хранится при 40^oC на питательной среде, содержащей 0,06-0,09% общего азота с добавлением 0,2-0,4% агара. Срок хранения до 1 года.

Длительное хранение (2 года и более) осуществляется в сублимированном виде в запаянных ампулах. Защитная среда при высушивании 5,5% лактозы, 1,7% полиглюкина.

Штамм выращивают при 28^oC на питательной среде в течение 24 часов или на посевной среде в течение 72 часов.

Жидкая питательная среда:
триптический гидролизат кильки 10,05 г,
натрия хлорид 4,95 г,
вода дистиллированная до 1 л,
pH (до автоклавирования) 7,1.

Плотная питательная среда:
гидролизат кильки 17,9 г,
натрия хлорид 5,9 г,
агар 11,2 г,
вода дистиллированная до 1 л,
pH (до автоклавирования) 7,2.

Посевная среда:
азотнокислый калий 1,52 г,
аммоний фосфорнокислый однозамещенный 2,95 г,
калий фосфорнокислый двузамещенный 0,87 г,
натрий фосфорнокислый однозамещенный 1,2 г,
натрия хлорид 0,5 г,
магний сернокислый 0,1 г,
кальция хлорид 0,025 г,
дрожжевой экстракт 0,1 г,
пентадекан 0,5%
вода дистиллированная до 1 л,
pH (до автоклавирования) 7,0
Генетические особенности штамма в процессе селекции штамм не подвергался воздействию мутагенных факторов и методов генной инженерии.

Активность штамма определяется косвенным путем по появлению мутности в пробирке при выращивании культуры на посевной среде через 72 часа инкубации.

Штамм депонирован 14 июля 1995 г. под регистрационным N Д "ВНИИСХМ-485" в группе эпифитных микроорганизмов.

В настоящее время штамм используется для получения компонентов препарата, обладающего биоремедиационными свойствами по отношению к загрязнению окружающей среды нефтепродуктами.

Практическая применимость штамма иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1.

К суспензии клеток Acinetobacter, выращенных на посевной среде и разбавленной до концентрации 10 кл/мл, был добавлен 1% H-гексадекана, после чего колбу термостатировали при 28^oC в течение 72 часов.

Степень деградации гексадекана составила через 16 часов 39,4% через 32 часа 78,9% через 48 часов 95,6% через 72 часа 99,7%
Пример 2.

В колбу, содержащую культуру Acinetobacter Iwoffi 7, выращенную на жидкой питательной среде в концентрации 10³ кл/мл, добавили 0,1% нитроаммофоски и 1% топочного мазута, после чего выдерживали смесь в течение 35 дней при комнатной температуре.

Параллельно проводились опыты до деградации мазута препаратом "Путидойл". Результаты биодеградации в присутствии препаратов приведены в таблице.

Литература
1. Ю.Н.Керасевич. Основы селекции микроорганизмов, утилизирующих синтетические органические соединения. М. Наука, 1982.

2. Biochem Biophys. Res. Communs, 1977, v. 78, 1, p. 401 410.

3. Agr.Biol.Chem. 1968, v. 32, 8, p. 1033-1039.

4. J. Bacteriol. 1976, v. 125, 3, p. 818.

5. Краткий определитель бактерий. Берги. М. Мир. 1980, с. 244.

6. Р. Стейннер и др. Мир микробов. Т. 3, М. Мир, 1979, с. 142.

7. J. Gem. Microbiol. 1973, v. 74. 1, p. 139 -148.

Использование: микробиология. Сущность применения: выделен штамм микроорганизмов Acinetobacter Iwoffi, позволяющий повысить скорость биодеградации смесей нефтепродуктов. 1 табл.

Штамм бактерий Acinetobacter Iwoffi N D "ВНИИСХМ"-485, обладающий способностью утилизировать углеводороды.