ШТАММ МИКРООРГАНИЗМОВ ACINETOBACTER JUNII 5, ОБЛАДАЮЩИЙ СПОСОБНОСТЬЮ УТИЛИЗИРОВАТЬ УГЛЕВОДОРОДЫ Российский патент 1997 года по МПК C12N1/20 C02F3/34 B09C1/10 C12R1/01 C12N1/20 

Изобретение относится к области прикладной микробиологии, а именно к штаммам микроорганизмов, способных утилизировать углеводороды.

Известна возможность ряда микроорганизмов утилизировать углеводороды. В частности, для этих целей используют Aspergillus niger, Aspergillus sp. Candida tropical, Pseudomonas putida [1 3]
Наибольшую известность для указанных целей получили штаммы Ps. putida, на основе которых был получен препарат "Путидойл" [4] Однако, указанный препарат эффективно не действует на все виды углеводородов или их смесей, что заставляет искать более активные в указанном отношении микроорганизмы.

Бактерии рода Acinetobacter являются широко распространенными всеядными хемогетеротрофами с окислительным метаболизмом. Они способны использовать в качестве источника углерода и энергии различные органические вещества, что делает их перспективными для использования для экологических целей, в частности, переработки углеводородов нефти и нефтепродуктов [5, 6]
Из возможных областей применения Acinetobacter следует отметить способность Acinetobacter calcoaceticus NCIB 8250 расти на средах, содержащих до 1 мг/л фенола [7]
Использование Acinetobacter в качестве активного начала для нефтедеградирующих препаратов в просмотренной литературе не обнаружено.

Задачей, решаемой в рамках настоящего изобретения, являлось получение штамма бактерий Acinetobacter, способного утилизировать углеводороды.

Указанная задача была решена получением штамма Acinetobacter junii 5.

Штамм был выделен из образцов почвы Катангского района Иркутской области на среде, содержащей углеводороды, и селектирован по максимальной способности утилизировать пентадекан.

Штамм выращивают при 28^oC в течение 48 ч на жидкой питательной среде, содержащей гидролизат кильки 10,05 г; хлорид натрия 4,95 г; воды дистиллированной до 1 л; рН (до автоклавирования) 7,1.

В бульоне однородная муть и слабый мелкодисперсный осадок. Консистенция бульона вязкая. При посеве в полужидкие среды (0,6% агар) и в толщу плотной питательной среды (1,5% агар) рост в толще агара отсутствует. Рост колоний наблюдается только на поверхности питательной среды.

На поверхности плотной питательной среды колонии имеют правильную круглую форму. Диаметр колоний 2 3 мм. Колонии гладкие, выпуклые, беловатые, окружены прозрачным ореолом неправильной формы. Край колоний гладкий, по мере старения колонии (через 6 суток) он становится волнистым.

Пигмент, диффундирующий в питательную среду, отсутствует.

Морфология клеток граммотрицательные клетки округлой формы. Диаметр клетки 1,2 мкм. Жгутиков и пилей не имеют. Клетки одиночные и диплококки, неподвижные.

Физиологическая характеристика штамма: аэроб, неподвижный, каталозо-положительный, оксидазо-отрицательный, не разжижает желатину. Не растет на глюкозе, сахарозе, лактозе, мальтозе, L-арабинозе, манните, сорбите, глицерине, L-β-фенилаланине, цитрате натрия, L-гистидине, если они используются в качестве единственного источника углерода.

При выращивании на минимальных средах может использовать в качестве единственного источника углерода метанол, этанол, твин-80, декан, додекан, пентадекан, гексадекан, вазелин. Растет в среде, содержащей ампициллин в концентрации 100 мкг/мл.

Анаэробный тест Хью-Лейфсона отрицательный. Не образует индола, на среде Клингера не выделяет сероводорода. Гемолиз на кровяном агаре отсутствует.

Не имеет нитратредуктазы, аргининдегидролазы, лизиндекарбоксилазы, орнитиндекарбоксилазы, триптофандезаминазы.

Штамм может расти в диапазоне рН 6,5 9,5. Оптимальное значение рН среды 7,2.

Диапазон температур 20 30^oC. Оптимальная температура роста 28^oC.

Штамм не обладает азотфиксирующими свойствами. Не патогенен.

Штамм хранится при 4^oC на питательной среде, содержащей 0,06 0,09% общего азота с добавлением 0,2 0,4% агара. Срок хранения до 1 года.

Длительное хранение (2 года и более) осуществляется в сублимированном виде в запаянных ампулах. Защитная среда при высушивании 5,5% лактозы, 1,7% полиглюкина.

Штамм выращивают при 28^oC на питательной среде в течение 24 часов или на посевной среде в течение 72 ч.

Жидкая питательная среда:
триптический гидролизат кильки 10,05 г,
натрия хлорид 4,95 г,
вода дистиллированная до 1 л,
рН (до автоклавирования) 7,1.

Плотная питательная среда: гидролизат кильки 17,9 г, натрия хлорид 5,9 г, агар 11,2 г, вода дистиллированная до 1 л, рН (до автоклавирования) 7,2.

Посевная среда: азотнокислый калий 1,52 г, аммоний фосфорнокислый однозамещенный 2,95 г, калий фосфорнокислый двузамещенный 0,87 г, натрий фосфорнокислый однозамещенный 1,2 г, натрия хлорид 0,5 г, магний сернокислый 0,1 г, кальция хлорид 0,025 г, дрожжевой экстракт 0,1 г, пентадекан 0,5% вода дистиллированная до 1 л, рН (до автоклавирования) 7,0.

Генетические особенности штамма в процессе селекции штамм не подвергался воздействию мутагенных факторов и методов генной инженерии.

Активность штамма определяется косвенным путем по появлению мутности в пробирке при выращивании культуры на посевной среде через 72 ч инкубации.

Штамм депонирован 14 июля 1995 г. под регистрационным N Д "ВНИИСХМ-484" в группе эпифитных микроорганизмов.

В настоящее время штамм используется для получения компонентов препарата, обладающего биоремедиационными свойствами по отношению к загрязнению окружающей среды нефтепродуктами.

Практическая применимость штамма иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1.

К суспензии клеток Acinetobacter junii 5, выращенных на посевной среде и разбавленной до концентрации клеток 10³ кл/мл, был добавлен 1% пентадекана, после чего колбу выдерживали при разных температурах в течение 50 дней, измеряя содержание пентадекана каждые 10 суток. Результаты анализа приведены в таблице.

При использовании препарата "Путидойл" в дозе 10⁵кл/мл при 18^oC степень деградации составила через 10 дней 53% через 20 дней - 83% через 30 дней 94,2%
Пример 2.

В колбу, содержащую 0,1% аммофоса, 0,02% KCl, добавили суспензию бактерий, исходя из конечной концентрации 10³кл/мл, и 1% нефти Новолабитовского месторождения. Смесь выдерживалась 30 дней при 20^oC. Степень деградации нефти составила через 10 суток 89% через 20 суток - 96,9% через 30 суток 99,91%
Как следует из приведенных экспериментов, заявленный штамм способен эффективно утилизировать как индивидуальные углеводороды, так и их смеси в широком диапазоне температур.

Литература
1. Ю.Н. Карасевич. Основы селекции микроорганизмов, утилизирующих синтетические органические соединения. М. Наука, 1982.

2. Biochem. Biophys. Res. Communs, 1977, v. 78, 1, p. 401-410.

3. Agr. Biol. Chem. 1968, v. 32, 8, p. 1033 1039.

4. J. Bacteriol. 1976, v. 125, 3, p. 818.

5. Краткий определитель бактерий Берги. М. Мир, 1980, с. 244.

6. Р. Стейннер и др. Мир микробов. Т. 3, М. Мир, 1979, с. 142.

7. J. Gen. Microbiol. 1973, v. 74, 1, p. 139 148.

Использование: микробиология, в частности для биодеградации смесей нефтепродуктов. Сущность изобретения: выделен новый штамм микроорганизмов Acinetobacter junii 5 из образцов почвы. 1 табл.

Штамм микроорганизмов Acinetobacter junii N D "ВНИИСХМ-484" (в коллекции ВНИИ сельскохозяйственной микробиологии), обладающий способностью утилизировать углеводороды.