ШТАММ МИКРООРГАНИЗМА ACINETOBACTER SPECIES 2, ОБЛАДАЮЩИЙ СПОСОБНОСТЬЮ УТИЛИЗИРОВАТЬ УГЛЕВОДОРОДЫ Российский патент 1997 года по МПК C12N1/20 B09C1/10 C02F3/34 C12R1/01 C12N1/20 

Изобретение относится к области прикладной микробиологии, а именно к штаммам микроорганизмов, способных утилизировать углеводороды.

Известна возможность ряда микроорганизмов утилизировать углеводороды. В частности, для этих целей используют Aspergillus niger, Aspergillus sp. Candida tropical, Pseudomonas putida /1 3/.

Наибольшую известность для указанных целей получили штаммы Ps. putida, на основе которых был получен препарат "Путидойл" /4/. Однако указанный препарат эффективно не действует на все виды углеводородов и их смесей, что заставляет искать более активные в указанном отношении микроорганизмы.

Бактерии рода Acinetobacter являются широко распространенными всеядными хемогетеротрофами с окислительным метаболизмом. Они способны использовать в качестве источника углерода и энергии различные органические вещества, что делает их перспективными для использования для экологических целей, в частности переработки углеводородов нефти и нефтепродуктов /5, 6/.

Из возможных областей применения Acinetobacter следует отметить способность Acinetobacter calcoaceticus NCIB 8250 расти на средах, содержащих до 1 мг/л фенола /7/.

Использование Acinetobacter в качестве активного начала для нефтедеградирующих препаратов в просмотренной литературе не обнаружено.

Задачей, решаемой в рамках настоящего изобретения, являлось получение штамма бактерий Acinetobacter, способного утилизировать углеводороды.

Указанная задача была решена получением штамма Acinetobacter sp.2.

Штамм был выделен из образцов почвы Катангского района Иркутской области на среде, содержащей углеводороды, и селектирован по максимальной способности утилизировать пентадекан.

Штамм выращивают при 28^oC в течение 48 часов на жидкой питательной среде, содержащей гидролизат кильки 10,05 г; хлорид натрия 0 4,95 г; воды дистиллированной до 1 л; pH (до автоклавирования) 7,1.

В бульоне однородная муть и слабый мелкодисперсный осадок. Консистенция бульона вязкая. При посеве в полужидкие среды (0,6% агар) и в толщу плотной питательной среды (1,5% агар) рост в толще агара отсутствует. Рост колоний наблюдается только на поверхности питательной среды.

На поверхности плотной питательной среды колонии имеют правильную круглую форму. Диаметр колоний 2 3 мм. Колонии гладкие, выпуклые, беловатые, окружены прозрачным ореолом неправильной формы. Край колоний гладкий, по мере старения колонии (через 6 суток) он становится волнистым.

Пигмент, диффундирующий в питательную среду, отсутствует.

Морфология клеток грамотрицательные клетки округлой формы. Диаметр клетки 1,2 мкм. Жгутиков и пилей не имеют. Клетки одиночные и диплококки, неподвижные.

Физиологическая характеристика штамма: аэроб, неподвижный, каталозо-положительный, оксидазо-отрицательный, не разжижает желатину. Не растет на глюкозе, сахарозе, лактозе, мальтозе, L-арабинозе, манните, сорбите, глицерине, L-β-фенилаланине, цитрате натрия, L-гистидине, если они используются в качестве единственного источника углерода.

При выращивании на минимальных средах может использовать в качестве единственного источника углерода метанол, этанол, твин-80, декан, додекан, пентадекан, гексадекан, вазелин. Растет в среде, содержащей ампициллин в концентрации 100 мкг/мл.

Анаэробный тест Хью-Лейфсона отрицательный. Не образует индола, на среде Клингера не выделяет сероводорода. Гемолиз на кровяном агаре отсутствует.

Не имеет нитратредуктазы, аргининдегидролазы, лизинкарбоксилазы, орнитиндекарбоксилазы, триптофандезаминазы.

Штамм может расти в диапазоне pH 6,5 9,5. Оптимальное значение pH среды 7,2.

Диапазон температур 20 30^oC. Оптимальная температура роста - 28^oC.

Штамм не обладает азотфиксирующими свойствами. Не патогенен.

Штамм хранится при 4^oC на питательной среде, содержащей 0,06 0,09% общего азота с добавлением 0,2 0,4% агара. Срок хранения до 1 года.

Длительное хранение (2 года и более) осуществляется в сублимированном виде в запаянных ампулах. Защитная среда при высушивании 5,5% лактозы, 1,7% полиглюкина.

Штамм выращивают при 28^oC на питательной среде в течение 24 часов или на посевной среде в течение 72 часов.

Жидкая питательная среда:
триптический гидролизат кильки 10,05 г
натрия хлорид 4,95 г
вода дистиллированная до 1 л
pH (до автоклавирования) 7,1
Плотная питательная среда:
гидролизат кильки 17,9 г
натрия хлорид 5,9 г
агар 11,2
вода дистиллированная до 1 л
pH (до автоклавирования) 7,2
Посевная среда:
азотнокислый калий 1,52 г
аммоний фосфорнокислый однозамещенный 2,95 г
калий фосфорнокислый двузамещенный 0,87 г
натрий фосфорнокислый однозамещенный 1,2 г
натрия хлорид 0,5 г
магний сернокислый 0,1 г
кальция хлорид 0,025 г
дрожжевой экстракт 0,1 г
пентадекан 0,5%
вода дистиллированная до 1 л
pH (до автоклавирования) 7,0
Генетические особенности штамма в процессе селекции штамм не подвергался воздействию мутагенных факторов и методов генной инженерии.

Активность штамма определяется косвенным путем по появлению мутности в пробирке при выращивании культуры на посевной среде через 72 часа инкубации.

Штамм депонирован 14 июля 1995 г. под регистрационным N Д "ВНИИСХМ-483" в группе эпифитных микроорганизмов.

В настоящее время штамм используется для получения компонентов препарата, обладающего биоремедиационными свойствами по отношению к загрязнению окружающей среды нефтепродуктами.

Практическая применимость штамма иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1.

В колбу помещали 1% углеводорода пентадекана в среду, содержащую 0,1% аммофоса и 0,02% хлорида калия, затем инокулировали Acinetobacter sp.2 до концентрации 10⁹кл/мл среды. Колбы помещали на качалку и инкубировали 3 суток при t 18^oC.

Результаты деградации пентадекана приведены в таблице 1.

Пример 2.

В колбу, содержащую 0,1% аммофоса, 0,02% KCl и 1% нефтепродуктов с Успенского загрязнения, возникшего при аварии нефтепровода, добавляли 10² кл/мл Acinetobacter sp. 2, а в качестве контроля 10⁵ кл/мл препарата Путидойл.

Колбы помещали на термостатирующую качалку при 20^oC на 3 суток.

Результаты по деградации нефти приведены в таблице 2.

Источники информации
1. Ю.Н. Карасевич. Основы селекции микроорганизмов, утилизирующих синтетические органические соединения. М. Наука, 1982.

2. Biochem. Biophys. Res. Communs, 1977, v. 1, p. 401 410.

3. Agr. Biol. Chem. 1968, v. 32, 8, p. 1033 -1039.

4. J. Bacteriol. 1976, v. 125, 3, p. 818.

5. Краткий определитель бактерий Берги. М. Мир, 1980, с. 244.

6. Р. Стейннер и др. Мир микробов, т. 3. М. Мир, 1979, с. 142.

7. J. Gen. Microbiol. 1973, v. 74, 1, p. 139 148.

Использование: изобретение относится к области микробиологии, может использоваться для биодеградации смесей нефтепродуктов. Сущность изобретения: выделен новый штамм микроорганизмов Acinetobacter species 2 из образцов почвы Катангского района Иркутской области на среде, содержащей углеводороды. 2 табл.

Штамм микроорганизма Acinetobacter species N D "ВНИИСХМ-483" (в коллекции ВНИИ сельскохозяйственной микробиологии), обладающий способностью утилизировать углеводороды.