СПОСОБ ПОДГОТОВКИ К ИССЛЕДОВАНИЮ ВОЗДЕЙСТВИЯ ТАБАЧНОГО ДЫМА НА ТУБЕРКУЛЕЗНЫЙ ВОЗБУДИТЕЛЬ Российский патент 1997 года по МПК G09B23/28 

Изобретение относится к медицине, а именно к микробиологии, и может быть использовано для исследования возбудителя туберкулеза в условиях хронической интоксикации табачным дымом.

Хронические привычные интоксикации рассматриваются как один из наиболее распространенных и опасных факторов в возникновении заболеваний человека. Особую роль в этом отводят хронической интоксикации табаком ввиду ее чрезвычайной распространенности как среди всего населения, так и среди больных туберкулезом (Липатова Л. С. 1980. Герман А. К. 1987).

В настоящее время в области исследования влияния курения табака на живые организмы одним из основных моментов является углубленное изучение тонких механизмов воздействия табака на органы, ткани и клетки. Причем изучения токсического воздействия курения на макроорганизмы в большой или меньшей степени уже разработаны (Радбиль О. С. Комаров Ю. М. 1988), однако исследования микроорганизмов, в частности возбудителя туберкулеза, в условиях хронической табачной интоксикации к настоящему времени практически отсутствуют.

Проблеме исследования возбудителя туберкулеза в условиях хронической табачной интоксикации посвящено ограниченное количество работ.

Наиболее близким по технической сущности и принятым за прототип является известный способ моделирования хронической интоксикации табачным дымом на туберкулезный процесс (Yonescu y. Gulbenu P. Zutescu Z. 1976.) Авторы исследовали влияние курения табака на развитие туберкулезного процесса на модели "Курящий кролик". Табачный дым вводят животным интраназально в виде обычных ингаляций, затем через 3 мес после начала "курения" кроликов заражают вирулентной культурой микобактерий туберкулеза. Через определенные интервалы времени (3 нед и 3 мес) животных забивают и изучают морфологические изменения во внутренних органах. Кроме того, выделяют микобактерии туберкулеза и изучают их свойства.

Однако известный способ имеет следующие недостатки:
значительные затраты времени (3 и более месяцев) и средств, необходимых для воспроизведения туберкулезного процесса у подопытных животных;
невозможность устранить влияние макроорганизма животного на возбудитель туберкулеза;
отсутствие возможности изучить и контролировать состав вдуваемого в ноздри табачного дыма.

Задачей изобретения является упрощение и удешевление способа.

Это достигается тем, что в известном способе моделирования воздействия табачного дыма на возбудитель туберкулеза, включающем посев возбудителя на питательную среду, в 50%-ном спирте растворяют конденсат табачного дыма, титруют, равномерно наносят на твердую питательную среду, подсушивают в термостате и производят посев возбудителя туберкулеза.

Сопоставительный анализ предлагаемого способа с прототипом показывают, что предлагаемый способ отличается от известного тем, что его осуществляют in vitro, что соответствует критерию "новизна".

Признаки, отличающие предлагаемый способ от прототипа, не выявлены в других решениях, что соответствует критерию "изобретательский уровень".

Способ осуществляет следующим образом. Конденсат табачного дыма сигарет III класса без фильтра (именно сигареты этого класса, типа "АСТРА" наиболее часто курят больные туберкулезом), полученного в Институте Канцерогенеза Всероссийского онкологического центра по способу "Кореста", экстрагируют из Кембриджского фильтра и растворяют в 50%-ном спирте. Раствор конденсата титруют и осторожно равномерно наслаивают в пробирки на среду Левенштейна-Йенсена; пробирки со средой в наклонном положении помещают в термостат, подсушивают. В результате конденсат табачного дыма тонкой пленкой покрывают питательную среду. Через 2-3 сут приступают к посевам микобактерий туберкулеза.

Предлагаемая модель позволяет изучить влияние табачного дыма в виде конденсата на возбудитель туберкулеза. Использование конденсата табачного дыма, получаемого по стандартным методикам, дает возможность хорошей сопоставимости результатов.

Примеры конкретного использования даны в виде выписок из экспериментов.

Пример 1. Эксперимент N 2 от 11. 04. 90. Поставлена цель смоделировать воздействие различных концентраций табачного дыма на возбудитель туберкулеза. С этой целью получены различные концентрации конденсата табачного дыма и изучалось их влияние на время появления видимого роста микобактерий туберкулеза. Использованы 5 разведений конденсата, мг/cм²:
1 разведение 0,2
2 разведение 20
3 разведение 2
4 разведение 0,2
5 разведение 0,02
После титрования растворы конденсата осторожно наслаивались в количестве 0,3 мл на среду Левенштейна-Йенсена и пробирки со средой в наклонном положении на штативе помещались в термостат при температуре 37^oC. В качестве растворителя конденсата применялся чистый (не разбавленный) медицинский этиловый спирт (в дальнейшем будет называть его 100%-ным спиртом). Посев производился культурой микобактерий туберкулеза штамма 4688. Результаты опыта в 3-х повторностях приведены в табл. 1.

Таким образом, в эксперименте четко выявляется тормозящее влияние на рост микобактерий туберкулеза, что проявляется в более позднем появлении видимого роста колоний, 1, 2, 4 и 5 разведений конденсата табачного дыма. Кроме того, отмечается супрессивный (подавляющий) эффект 100%-ного спирта, что замедляет рост микобактерий туберкулеза в указанных выше концентрациях в еще большей степени. Представляет интерес тот факт, что 3 разведение конденсата (2 мкг/см²) стимулируют рост микобактерий, снимает супрессивный эффект 100%-ного спирта и рост культуры возбудителя идет практически в те же сроки, что и в контроле культуры и даже несколько быстрее. При пересчете на "среднего" курильщика, выкуривающего 11-12 сигарет без фильтра в день, такое разведение конденсата соответствует стажу курения 5 лет.

Пример 2. Эксперимент N 3 от 03. 05. 90 г. Поставлена цель изучить влияние различных разведений этилового спирта на рост микобактерий туберкулеза. Для этого проведено титрование этилового спирта с целью получения 25, 50, 75 и 100% разведений.

После титрования растворы спирта осторожно наслаивались в количестве 0,3 мл на среду Левенштейна-Йенсена и пробирки со средой в наклонном положении, чтобы спирт тонкой пленкой покрыл скос пробирки, на штативе помещали в термостат при температуре 37^oC. Количество жидкости специально было взято 0,3 мл, так как меньшего ее количества недостаточно для покрытия скоса пробирки, а большее количество приводит к замедлению процесса испарения. Через 2-е суток выполняли посевы микобактерий туберкулеза общепринятым методом на уже подсохший скос пробирки (опыт ставился в 3-х повторностях со штаммом N 4688).Ежедневно контролировалось время появления видимого роста(см. табл. 2).

Из опыта видно, что 75%-ный и особенно 100%-ный спирт оказывают супрессивное, тормозящее воздействие на рост микобактерий туберкулеза. 25%-ный и 50%-ный спирт оказывает подавляющего действия на рост микробактерий туберкулеза, и рост культур был почти такой же, как на контроле. Сделан вывод, что в качестве растворителя конденсата табачного дыма наиболее подходит 50%-ный спирт, в котором растворение конденсата осуществляется лучше, чем в 25%-ном спирте.

Пример 3. Эксперимент N4 от 06.06.90. Цель эксперимента смоделировать процесс воздействия табачного дыма на возбудитель туберкулеза при использовании в качестве растворителя конденсата 50%-ный спирт. Результаты приведены в табл. 3.

Из эксперимента видно, что при использовании в качестве растворителя конденсата 50%-ного спирта достигается практически одинаковый рост микобактерий туберкулеза в контроле культуры и контроле растворителя, что свидетельствует об отсутствии супрессивного эффекта 50%-ного спирта и позволяет наиболее точно смоделировать влияние курения на возбудитель туберкулеза. Подтверждается также стимулирующее действие 3 и частично 4 разведения конденсата табачного дыма.

Всего нами выполнено 19 серий посевов микобактерий на среду Левенштейна-Йенсона с использованием 3-х различных культур: Micobacterium tuberculosis штамм H₃₇R а референс культура из коллекции США и штамм 4688, выделенный от больных туберкулезом; Micobacterium bovis (BCJ) штамм ГИСК им. Тарасевича, г. Москва. Сделано 54 опыта на 324 пробирках. В качестве растворителя применялся в первых опытах 100%-ный медицинский этиловый спирт, однако он сам тормозил рост микобактерий, поэтому в большинстве опытов использовался 50% -ный спирт, который сочетал хорошую способность растворять конденсат с отсутствием тормозящего эффекта на рост микобактерий, что позволило изучать "чистое" влияние самого конденсата табачного дыма на микроорганизмы.

Изобретение относится к медицине и может быть использован в условиях медицинских научно-исследовательских учреждений различного профиля. Задачей изобретения является упрощение и удешевление способа. Способ заключается с следующем.

Конденсат табачного дыма экстрагируют из Кембриджского фильтра и растворяют в 50%-ном спирте. Раствор конденсата титруют, получая различные концентрации, и осторожно равномерно наслаивают в пробирки на среду Левенштейна-Иенсена, пробирки со средой в наклонном положении помещают в термостат, подсушивают. В результате конденсат табачного дыма тонкой пленкой покрывает питательную среду. Через 2-3 сут приступают к посевам микробактерий туберкулеза. 3 табл.

Способ подготовки к исследованию воздействия табачного дыма на туберкулезный возбудитель, включающий посев возбудителя на питательную среду, отличающийся тем, что в 50%-ном спирте растворяют конденсат табачного дыма, титруют, равномерно наслаивают на твердую питательную среду, подсушивают в термостате и производят посев возбудителя.