СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТАГОНИСТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ПРОБИОТИКОВ ИЗ СПОРОВЫХ БАКТЕРИЙ ПО ОТНОШЕНИЮ К МИКОБАКТЕРИЯМ Российский патент 2008 года по МПК C12Q1/04 C12N1/20 

Изобретение относится к микробиологии, касается способа изучения взаимоотношений микроорганизмов и может быть использовано для выявления биологической активности пробиотиков из споровых бактерий медицинского и ветеринарного назначения по отношению к микобактериям.

Известен способ определения антагонистической активности пробиотиков и бактериальных штаммов in vitro, включающий совместное культивирование с индикаторными штаммами в жидкой или на плотной питательной среде [1].

Наиболее распространен способ отсроченного антагонизма, когда подсев индикаторных штаммов на плотную питательную среду проводится через определенный период после посева испытуемой культуры. Подсев индикаторных штаммов, например культуры стафилококков, проводят в виде перпендикулярных штрихов к выросшей испытуемой культуре, антагонистическая активность которой количественно характеризуется величиной зоны подавления роста каждого индикаторного штамма [2].

Однако известные способы не позволяют выявлять антагонистические свойства по отношению к микобактериям из-за особенностей их биологии, касающихся скорости роста и требований к питательным средам, что затрудняет совместное культивирования с другими микроорганизмами в одном временном диапазоне и на одних средах.

Описано определение чувствительности штаммов микобактерий туберкулеза к штамму Bacillus subtilis МЖ-6 методом разведений на средах Левенштейна-Йенсена и Финна II. Среды с соответствующими разведениями штамма Bacillus subtilis МЖ-6 свертывают при температуре 86°С в течение 1 ч, затем на них наносят гомогенную взвесь микобактерий туберкулеза, выдерживают в горизонтальном положении при температуре 37°С 3 ч, обжигают верхушки ватных пробок, погружают их пинцетом в пробирки, заливают смесью воска и парафина и помещают в термостат. Предварительные результаты (рост микобактерий) учитывают на 12-14, окончательные - на 20-21 день инкубации [3]. Осуществимость этого способа не подтверждена из-за отсутствия контроля, а возможность определения представляется нам сомнительной: известно, что бактерии Bacillus subtilis являются аэробами, в описанных условиях (внутри плотной питательной среды с консервантом) они не смогут расти, а следовательно, производить бактериоцины, обусловливающие биологическую активность микроорганизма.

Цель изобретения - способ определения и количественной оценки антагонистической активности пробиотиков из споровых бактерий по отношению к микобактериям.

Поставленная цель достигается способом отсроченного антагонизма с использованием суспензии споровых бактерий после трехкратной тепловой обработки.

При осуществлении способа могут быть использованы обычные регламентированные условия проведения теста отсроченного антагонизма для каждого пробиотика, включая продолжительность культивирования испытуемой культуры. Подготовка исследуемых штаммов заключается в растворении физиологическим раствором сухой лиофилизированной биомассы пробиотика (форма производителя) с последующим разведением бактериальной суспензии до рекомендованной концентрации микробных клеток.

Способ осуществляется следующим образом.

Исследуемый пробиотик выращивают в жидкой питательной среде Сотона при температуре 37°С в течение 5 дней и проращивают споры двумя циклами при температуре 37°С в течение 18-20 часов с тепловой обработкой при температуре 132°С в течение 30 минут в начале первого цикла и в конце первого и второго циклов. 1 мл стерильной суспензии исследуемого пробиотика наслаивают на плотную питательную среду Левенштейна-Йенсена, инкубируют при температуре 37°С в течение 24 часов с последующим подсевом и инкубацией индикаторного штамма и определением индекса блокирования роста.

В качестве индикаторных штаммов использовали штамм Academia (M.tuberculosis), штамм Vallee (M.bovis), штамм ГИСК (M.avium) и штамм 296 (М.vaccae), выделенный из лимфоузла коровы.

Сущность способа поясняется примерами.

Пример 1. Определение антагонистической активности бактисубтила по отношению к микобактериям.

Сухую биомассу бактисубтила (на основе штамма Bacillus cereus IP 5832) в ампуле или флаконе растворяли 0,85% раствором натрия хлорида из расчета 1 мл на дозу препарата. Во флакон с 40 мл среды Сотона вносили 10 мкл суспензии бактерий, содержавшей 5×10⁴ мк/см³, после выращивания при температуре 37°С в течение 5 дней автоклавировали при температуре 132°С в течение 30 минут, выдерживали в термостате при температуре 37°С в течение 18-20 часов и повторно автоклавировали при температуре 132°С в течение 30 минут. Повторяли цикл проращивания спор при температуре 37°С в течение 18-20 часов с последующим автоклавированием при температуре 132°С в течение 30 минут. После подтверждения стерильности контрольным посевом 1 мл суспензии бактерий наслаивали на среду Левенштейна-Йенсена (5 мл), пробирки инкубировали при температуре 37°С в течение 24 часов, после чего подсевали 10 мкл суспензии культуры индикаторного штамма, обеспечивавшей рост 20-60 КОЕ в контроле. Контроль: в пробирки вносили 5 мл среды Левенштейна-Йенсена, на которую наслаивали 1 мл среды Сотона, после впитывания которой засевали индикаторные штаммы. Учет результатов проводили в течение 45 дней инкубирования при температуре 37°С по индексу блокирования роста (отношение числа колоний, выросших в контроле, к числу колоний, выросших в опыте, - ИБР). ИБР составил для штамма Academia (М. tuberculosis) - 2,11; для штамма Valleé (M.bovis) - 5,1; для штамма ГИСК (M.avium) - 6,2; для штамма 296 (M.vaccae) - 10,0.

Пример 2. Определение антагонистической активности споробактерина по отношению к микобактериям.

Сухую биомассу споробактерина (на основе штамма Bacillus subtilis 534) в ампуле или флаконе растворяли физиологическим раствором из расчета 1 мл на одну дозу. Подготовка исследуемого штамма, подсев индикаторных штаммов, учет результатов и контроль, как в примере 1. ИБР составил для штамма Academia (M.tuberculosis) - 3,4; для штамма Valleé (M.bovis) - 13,0; для штамма ГИСК (M.avium) - 4,4; для штамма 296 (M.vaccae) - 6,2.

Пример 3. Определение антагонистической активности сахабактисубтила по отношению к микобактериям.

Сухую биомассу сахабактисубтила (на основе штаммов Bacillus subtilis ТНИ-3 и ТНИ-5) в ампуле или флаконе растворяли физиологическим раствором из расчета 1 мл на одну дозу. Подготовка исследуемых штаммов, подсев индикаторных штаммов, контроль и учет результатов, как в примере 1. ИБР составил для штамма Academia (M.tuberculosis) - 4,7; для штамма Valleé (M.bovis) - 6,6; для штамма ГИСК (M.avium) - 6,1; для штамма 296 (M.vaccae) - 6,2.

Пример 4. Определение антагонистической активности коредона по отношению к микобактериям.

Сухую биомассу коредона (на основе штаммов Bacillus subtilis и Bacillus licheniformis) в ампуле или флаконе растворяли физиологическим раствором из расчета 1 мл на одну дозу. Подготовка исследуемых штаммов, подсев индикаторных штаммов, контроль и учет результатов, как в примере 1. ИБР составил для штамма Academia (M.tuberculosis) - 10,1; для штамма Valleé (M.bovis) - 6,0; для штамма ГИСК (M.avium) - 10,2; для штамма 296 (M.vaccae) - 3,3.

Сравнительные результаты антагонистической активности бактисубтила, споробактерина, сахабактисубтила и коредона по отношению к различным индикаторным штаммам микобактерий приведены в таблице.

Таблица
Сравнительные результаты антагонистической активности пробиотиков из споровых бактерий по отношению к индикаторным штаммамИндикаторные штаммыПробиотики из споровых бактерийбактисубтилспоробактеринсахабактисубтилкоредонИндекс блокирования ростаМ. bovis (шт. Valleé)5,113,06,66,0М. tuberculosis (шт. Academia)2,113,44,710,1M.avium (шт. ГИСК)6,24,46,110,2M.vaccae (шт. 296)10,06,26,23,3

Представленные данные свидетельствуют об отличии показателей антагонистической активности испытуемых пробиотиков по отношению к разным видам микобактерий.

Проведенные исследования показали, что предлагаемый способ позволяет объективно оценить антагонистическую активность пробиотиков из споровых бактерий по отношению к микобактериям, что необходимо для выбора пробиотического препарата для применения молодняку крупного рогатого скота, заражающемуся патогенными и условно патогенными микобактериями алиментарным путем в первые дни жизни, как средства лечебно-профилактического воздействия.

Источники информации

1. Лабораторные методы исследования в клинике. Справочник под ред. В.В.Меньшикова. - М.: Медицина, 1987, с.341-343.

2. RU 2177152 C2, 02.12.1999.

3. RU 2120992 C1, 24.08.1995.

Пробиотик предварительно выращивают в жидкой питательной среде Сотона при температуре 37°С в течение 5 дней и проращивают споры двумя циклами при температуре 37°С в течение 18-20 ч с тепловой обработкой при температуре 132°С в течение 30 мин в начале первого и в конце первого и второго циклов. 1 мл стерильной суспензии исследуемых пробиотических штаммов наслаивают на плотную питательную среду Левенштейна-Йенсена, инкубируют при температуре 37°С в течение 24 ч. Затем осуществляют подсев индикаторного штамма, выращивание при температурном и временном оптимуме и последующее определение индекса блокирования роста. Способ обеспечивает объективную оценку антагонистической активности споровых бактерий по отношению к микобактериям. 1 табл.

Способ определения антагонистической активности пробиотиков из споровых бактерий по отношению к микобактериям, включающий подсев индикаторных штаммов на плотную питательную среду Левенштейна-Йенсена через определенный период после посева испытуемого пробиотика и определение индекса блокирования роста, отличающийся тем, что пробиотик предварительно выращивают в жидкой питательной среде Сотона при температуре 37°С в течение 5 дней и проращивают споры двумя циклами при температуре 37°С в течение 18-20 час с тепловой обработкой при температуре 132°С в течение 30 мин в начале первого и в конце первого и второго циклов, а подсев индикаторных штаммов осуществляют через 24 час после посева испытуемого пробиотика.