ИНДУКТОР ИНТЕРФЕРОНА РИДОСТИН Российский патент 1997 года по МПК A61K38/20 

Изобретение относится к медицине и ветеринарии и может быть использовано для лечения и профилактики вирусных заболеваний.

Индукторы интерферона, стимулирующие выработку в организме человека и животных эндогенного интерферона, имеют ряд преимуществ перед препаратами экзогенного интерферона и являются перспективными средствами профилактики и терапии вирусных инфекций.

К наиболее активным индукторам интерферона относятся синтетические полирибонуклеотиды и двуспиральные (дс)PHK природного происхождения.

Однако наряду с высокой эффективностью их как индукторов интерферона эти препараты обладают высокой токсичностью и проявляют мутагенную активность.

Известен индуктор интерферона двуспиральный полирибонуклеотидный комплекс поли И: поли Ц, оказывающий ингибирующее действие в отношении широкого круга вирусов. Однако препарат поли И: поли Ц также является высокотоксичным и обладает мутагенной активностью.

Наиболее близким к заявляемому препарату (прототипом) является индуктор интерферона до PHK киллерных штаммов дрожжей Saccharomyces cerevisiae, индуцирующий высокие титры интерферона и проявляющий выраженную противовирусную активность в отношении широкого круга инфекций (грипп, герпес, ВИЧ, клещевой энцефалит и др.), причем на ряде моделей он демонстрирует преимущества перед другими индукторами интерферона, такими, как ларифан, поли Г: поли Ц.

Недостатками индуктора интерферона дсPHK из дрожжей Saccharomeces cerevisiae являются:
1. Высокая токсичность препарат относится к классу сильно действующих ядовитых веществ (ЛД₅₀ при внутрибрюшинном введении мышам 5,1 9,7 мг/кг).

2. Наличие слабого, но статистически достоверного мутагенного эффекта в виде повышения числа хромосомных аберраций в 2-2,5 раза по сравнению с контролем (интактными животными).

Целью изобретения является создание нового препарата индуктора интерферона на основе дсPHK киллерных штаммов дрожжей S.cerevisiae - ридостина, обладающего высокой эффективностью, сниженной токсичностью, хорошей переносимостью и на обладающего мутагенной активностью.

Цель достигается путем создания оптимальной лекарственной формы индуктора интерферона (ридостина), в состав которой входят дcPHK дрожжей S.cerevisiae и однонитевая PHK дрожжей как основные компоненты, при этом содержание дсPHK ограничивается 5-15%
Ридостин представляет собой стерильный лиофилизованный препарат, содержащий дcPHK в количестве 5 15% и дополнительно однонитевую PHK дрожжей.

Партии препарата имеют следующие характеристики:
интерферониндуцирующая активность не менее 640 ИЕ₅₀/мл;
значения среднесмертельных доз для мышей при внутрибрюшинном способе введения 45 120 мг/кг;
количество метафаз с хромосомными аберрациями не превышало значений этого показателя у контрольных животных.

Новыми существенными отличительными признаками предлагаемого препарата являются введение в состав препарата однонитевой высокополимерной PHK дрожжей и снижение содержания высокотоксичного компонента дсPHK до 5-15%
Экспериментальными данными установлено, что дсPHK дрожжей проявляет слабый, но статистически достоверный мутагенный эффект, повышая частоту хромосомных аберраций в клетках костного мозга мышей после внутрибрюшинного введения дсPHK в дозе 1/4 ЛД₅₀ (1,5 мг/кг) (табл. 1), что существенно ограничивает возможность применения препарата как лечебно-профилактического средства для медицины и ветеринарии.

Как видно из данных табл. 1, введение только дсPHK приводит к статистически достоверному повышению количества хромосомных аберраций в клетках костного мозга мышей. В случае введения комплексного препарата, содержащего дополнительно однонитевую высокополимерную PHK, повышение частоты хромосомных нарушений не выявляется.

Введение нового биологически активного компонента однонитевой PHK могло отразиться на целевом свойстве интерферониндуцирующей активности. В связи с этим авторы исследуют интерферониндуцирующую активность образцов препарата, содержащих однонитевую PHK в отношении к дсPHK 1:1 40:1. Образцы препаратов вводят внутрибрюшинно белым беспородным мышам в дозах, содержащих одинаковое количество дсPHK (0,5 мг/кг).

Результаты приведены в табл. 2.

Как видно из данных табл. 2, однонитевая PHK в любом соотношении, вплоть до 40: 1, не приводит к потере интерферониндуцирующих свойств препарата дсPHK.

Поскольку сохранение эффективности при снижении содержания активного начала не являлось очевидным, то проведено изучение зависимости интерферониндуцирующей активности от содержания дсPHK в препарате. Определение интерферониндуцирующей активности препаратов с различным содержанием дсPHK проводят на беспородных мышах. Все препараты вводят внутрибрюшинно в одинаковой дозе 5 мг/кг (табл. 3).

Как видно из данных табл. 3, титры интерферона, стабильно превышающие уровень 640 ИЕ₅₀/мл, позволяющие отнести препарат к высокоактивным индукторам интерферона, получают при использовании образцов с содержанием дсPHK выше 2,5%
В то же время увеличение процентного содержания дсPHK в препарате выше 10-15% не дает существенного прироста титров продуцируемого интерферона, что позволяет ограничить содержание дсPHK в препарате 10-13%
Экспериментальными данными установлено, что препараты с содержанием дсPHK выше 50% являются высокотоксичными и сильно действующими ядовитыми веществами (СДЯВ) ЛД₅₀ менее 50 мг/кг. Корреляционный анализ связи состава препарата и его токсичности показывает, что уровень токсичности определяется содержанием дсPHK в нем имеется тесная обратная корреляционная связь среднесмертельной дозы препарата с содержанием дсPHK (табл. 4).

ЛД₅₀ образцов препарата с содержанием дсPHK 5 15% и содержащих в своем составе однонитевую PHK колебалась в пределах 45 120 мг/кг при внутрибрюшинном способе введения, т.е. препараты относились к высоко- или среднетоксичным соединениям.

Результаты экспериментального изучения биологических свойств препарата ридостин в сравнении с его прототипом дсPHK дрожжей, суммированные в табл. 1-4, свидетельствуют о том, что предлагаемое изменение состава индуктора интерферона приводит к устранению нежелательных побочных эффектов устранению мутагенности, снижению токсичности препарата, уменьшению расхода дорогостоящего компонента дсPHK при сохранении его целевых свойств - интерферониндуцирующей активности.

Именно использование отличительных существенных признаков заявляемой композиции препарата: содержание дсPHK в количестве 5-15% и введение в состав препарата однонитевой PHK -позволяет получить качественно новый эффект, а именно:
1. Высокая интерферониндуцирующая активность.

2. Сниженная по сравнению с прототипом токсичность.

3. Отсутствие мутагенной активности.

4. Снижение стоимости дозы препарата, что в совокупности делает его перспективным для клинического использования.

Пример 1. Состав приготавливают при следующем соотношении компонентов, мас. дсPHK 9% однонитевая PHK 30% NaCl остальное. Остальные примеры состава приготавливают аналогичным образом. Серия препарата с приведенным выше составом имеет следующие характеристики: интерферониндуцирующая активность - 1088±64 ИЕ₅₀/мл; среднесмертельная доза при внутрибрюшинном введении мышам 71 мг/кг; мутагенная активность не выявляется (количество хромосомных аберраций 1,0% в опыте по сравнению с 1,8% в контроле, которым служили животные, получившие 0,9% NaCl).

Пример 2. Берут следующие соотношения компонентов: дсPHK 8% однонитевая PHK 41% NaCl остальное. Серия препарата с приведенным выше составом имеет следующие характеристики: интетрферониндуцирующая активность - 1180 ИЕ₅₀/мл; среднесмертельная доза 120 мг/кг; количество хромосомных аберраций 2,5% (по сравнению с 2,0% в контроле), что свидетельствует об отсутствии мутагенной активности.

Пример 3. Берут следующее соотношение компонентов, мас. дсPHK 15% однонитевая PHK 45% NaCl остальное. Серия препарата с приведенным выше составом имеет следующие характеристики: интерферониндуцирующая активность - 1051±392 ИЕ₅₀/мл, среднесмертельная доза 80 мг/кг, количество хромосомных аберраций 1,8% (по сравнению с 1,5% у интактных животных), что свидетельствует об отсутствии мутагенной активности.

Пример 4. Берут следующее соотношение компонентов, мас. дсPHK 5,0% однонитевая PHK 52% NaCl остальное. Серия препарата с таким составом имеет следующие характеристики: интерферониндуцирующая активность - 1280±0; среднесмертельная доза при внтурибрюшинном введении мышам 90 мг/кг; количество хромосомных аберраций 2,0% (по сравнению с 1,5% у интактных животных).

Пример 5. Интерферониндуцирующую активность образцов ридостина изучают при внутрибрюшинном введении белым мышам колонии ICR. Препараты вводят в дозе 5 мг/кг. Кровь из ретроорбитального синуса мышей забирают через 6 ч после введения. О наличии интерферона судят по подавлению цитопатического действия (ЦПД₅₀) тест-вируса (вирус везикулярного стоматита штамм Индиана) в культуре L-929 мышинных фибробластов методом титрования в микроплатах. За титр сывороточного интерферона (в ИЕ₅₀/мл) принимают величину, обратную его наибольшему разведению, при котором наблюдают защиту 50% клеток культуры от цитопатического действия 100 ЦПД₅₀ тест-вируса. Результаты представлены в табл. 5.

Из данных табл. 5 видно, что образцы препарата, содержащие 5-15% дсPHK и однонитевую PHK, являются активными индукторами интерферона.

Пример 6. Определение среднесмертельных доз 3 серий ридостина и 4 серий дсPHK с различным содержанием основных компонентов проводят экспресс-методом по Прозоровскому на белых рандомбредных мышах при внутрибрюшинном введении.

Результаты представлены в табл. 6.

Значения среднесмертельных доз ридостина составляют 71% 90% что позволяет отнести их к классу среднетоксичных соединений в отличие от препаратов, содержащих дсPHK в количестве более 15% относящихся к высокотоксичным и сильнодействующим соединениям.

Пример 7. Мутагенную активность образцов ридостина оценивают по методу анализа хромосомных аберраций в клетках костного мозга мышей линии C 57 BL/6 массой 18-20 г возраcтом 2-3 мас. Препараты вводят внутрибрюшинно в дозах, равных по содержанию дсPHK и соответствующих приблизительно 1/4 ЛД₅₀. Мутагенный эффект оценивают по наличию хромосомных аберраций в клетках костного мозга, учитывая структурные аберрации (фрагменты) через 24 ч после введения. На каждую точку анализа берут по 4 самца, у каждого животного анализируют по 100 метафаз. Достоверность отличия опыта от контроля определяют по критерию Стьюдента с поправкой Фишера.

Результаты приведены в табл. 7.

Как видно из представленных данных, препараты, содержащие дсPHK в выбранном интервале (5-15%) и дополнительно однонитевую PHK, не проявляют мутагенной активности в отличие от прототипа.

Препарат Ридостин прошел полный цикл доклинических испытаний.

Изобретение относится к медицине и ветеринарии. С целью получения немутагенного препарата со сниженной токсичностью, хорошей переносимостью и высокоактивного в отношении индукции интерферона предложена композиционная форма препарата - Ридостин, имеющая в своем составе двуспиральную PHK из киллерных штаммов дрожжей Saccharomyces cerevisiae в количестве 5-15% и однонитевую PHK дрожжей как основные компоненты. 7 табл.

Индуктор интерферона, содержащий двуспиральную РНК из дрожжей Saccharomices cerevisiae, отличающийся тем, что он дополнительно содержит однонитевую высокополимерную РНК дрожжей при следующем соотношении компонентов, мас.

Двуспиральная РНК 5 15
Однонитевая высокополимерная РНК 30 52
NaCl Остальное